一种脱细胞基质复合材料及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物医学及组织工程材料技术领域，具体涉及一种脱细胞基质复合材料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.随着组织工程学和再生医学的发展，人们对组织工程技术所涉及的支架材料展开了大量研究，其中包括高分子材料、金属材料、生物陶瓷和异种材料等，但上述材料在临床应用中表现出一定的并发症或不良反应。因此，近年来，脱细胞基质源的生物材料受到大量的关注和研究，以脱细胞基质源生物材料作为组织工程支架的研究正在兴起。
3.组织是由细胞和细胞外基质(extracellular matrix，ecm)组成的，制备脱细胞基质的目的是为了去除组织中免疫原性很强的细胞成分，如表皮细胞﹑毛囊﹑皮脂腺﹑汗腺、真皮中血管内皮细胞和成纤维细胞等，而保留免疫原性相对较弱的细胞基质外成分以及真皮组织完整的三维空间结构。由ecm组成的生物支架材料被广泛应用在外科手术重建和组织与器官的再生医学领域，例如皮肤烧烫伤后的治疗、软骨损伤后的修复和疝气修补等。ecm是组织和器官中的细胞的分泌产物，与这些细胞之间有着动态的相互作用，能够及时反映微环境的改变，同时在细胞迁移、分化和增殖方面有着重要作用，其三维结构与体内细胞生长的天然环境十分接近，不仅可以起着支架材料的作用，而且包含的多种生长因子在组织修复和重建中有重要促进作用。ecm经过脱细胞处理后仍有一定活性，是细胞生长的理想环境，因此ecm既能避免移植后的排斥反应和过强的免疫炎症反应，不会影响移植效果，又能提供引导组织再生的生物“模板”或支架，达到最大限度地修复组织缺损的目的。
4.但目前组织工程支架面临的主要问题是如何快速重建新生组织的血管系统。因为充分的血液供应是保证新生组织在体内存活的决定性因素，新生组织的血管系统需要严格限制组织的大小，如果组织过大而新生血管不足，则组织获取的营养和氧气也不足，这将导致新生组织在新血管生成前坏死。因此，如何在构建组织工程新生组织的同时重建其血管系统成为组织工程技术从基础研究向临床应用过渡的关键性问题。
5.综上，虽然传统的脱细胞基质因其组分和活性成分，已经在组织工程和再生医学领域广泛得到应用，但由于其成血管能力不足，导致在组织修复过程中无法为新生组织形成足够血管组织从而导致修复失败或组织坏死。
6.因此，本领域亟待提供一种有利于组织再生过程中的血管化进程的组织修复材料，以改善现有传统材料对于缺损组织的修复情况存在的不足。


技术实现要素：

7.本发明的目的就是为了解决上述技术问题，而提供了一种脱细胞基质复合材料以及制备该脱细胞基质复合材料的方法和其在医学领域的相关应用。
8.本发明首先提供了一种具有血管化诱导功能的脱细胞基质复合材料，所述脱细胞基质复合材料是由血管脱细胞基质和真皮脱细胞基质复合形成的具有三维多孔网状结构，
其中，所述血管脱细胞基质与真皮脱细胞基质的重量比为1:1～2:1。
9.进一步地，所述血管脱细胞基质和真皮脱细胞基质来源于哺乳动物的软组织；优选的，所述哺乳动物包括猪、牛和人。
10.研究表明，不同种类的异源或异种结缔组织脱除细胞后保留的细胞外基质成分并不完全相同，并且其中的各类小分子物质在组织修复过程中起到关键作用，其中血管内皮细胞生长因子(vegf)在血管系统再生中过程中起着重要作用，它通过促进血管内皮细胞的有丝分裂、血管通透性的增加以及增进单核细胞的趋化性等方式促进血管的再生。血管组织内含有大量与血管生成相关的生长因子和信号分子，采用血管脱细胞材料作为组织修复材料的关键组分，有利于组织再生过程中的血管化进程。
11.本发明通过复合一定质量比的血管脱细胞基质与真皮脱细胞基质，能够显著促进复合材料在组织修复过程的血管化，改善对于缺损组织的修复情况，是一种能够有效改进基于脱细胞基质的生物材料的有效途径。
12.本发明的目的之二是提供上述脱细胞基质复合材料的制备方法，所述脱细胞基质复合材料的制备方法包括以下步骤：
13.(一)血管组织脱细胞基质材料的制备，包括以下步骤：
14.(1)取血管组织原材料，用去离子水清洗除去血液和污垢，将整个动脉剪开切成长、宽和高为所需规格尺寸的组织原材料，并用胶体磨均匀研磨成微小粒径的颗粒后，低温冷冻保存；
15.(2)脱细胞：将步骤(1)的血管组织原材料放入酶溶液内降解处理后，清洗离心洗除去酶溶液，再放入脱细胞溶液中过夜处理；
16.(3)用清洗液对步骤(2)的产物进行清洗，并离心除去上清液；
17.(4)二次脱细胞：用脱细胞溶液对步骤(3)的产物进行二次处理，随后用清洗液除去表面的脱细胞溶液，最后用无菌去离子水清洗，离心除去上清液后获得血管脱细胞基质，低温冷冻保存；
18.(二)真皮脱细胞基质微颗粒材料的制备，包括以下步骤：
19.(5)收集真皮组织原材料，用去离子水清洗其上的血液和污垢，切割成长、宽和高为所需规格尺寸的组织原材料，低温冷冻保存；
20.(6)消毒灭菌：缓慢解冻，将组织原材料置于消毒溶液中消毒，消毒完后用无菌生理盐水充分清洗；
21.(7)微颗粒化：将消毒后的组织原材料用胶体磨均匀研磨成微小粒径的颗粒；
22.(8)脱细胞：将步骤(7)的产物用脱细胞液浸泡去细胞后，清洗离心除去脱细胞液；
23.(9)用无菌生理盐水对步骤(8)的产物进行清洗，并离心除去上清液，获得真皮脱细胞基质微颗粒，低温冷冻保存；
24.(三)脱细胞基质复合材料的制备，包括以下步骤：
25.(10)复合：解冻血管脱细胞基质和真皮脱细胞基质微颗粒，将两者按质量比在溶剂中分散均匀并冻干，从而获得脱细胞基质复合材料；
26.(11)灭菌：对脱细胞基质复合材料进行终端灭菌处理。
27.进一步地，所述脱细胞液选自tritonx
‑
100、羟乙基哌嗪乙磺酸、聚乙二醇辛基苯基醚、脱氧胆酸钠、十二烷基氨基丙酸钠或脂肪醇聚氧乙烯醚中的至少一种；优选的，所述
脱细胞液的浓度为0.1％～1％，在摇床上震荡4
‑
24h。
28.进一步地，所述酶溶液选自核酸酶、胰酶或中性蛋白酶中的至少一种，酶浓度为0.5
‑
5％，所述降解处理的步骤为在摇床上震荡4
‑
24h。
29.进一步地，所述清洗采用的清洗液选自磷酸盐缓冲液、无菌生理盐水、无菌去离子水或乙二胺四乙酸的至少一种。
30.进一步地，所述的清洗步骤为：控制脱细胞基质与清洗液的质量比为1:0.5～1:5，在摇床上震荡0.5
‑
2h后，于500
‑
3000g下离心1
‑
10min除去上清液，重复上述过程1
‑
5次。
31.进一步地，所述消毒的消毒剂选自氢氧化钠、酒精、过氧乙酸或过氧化氢中的至少一种。
32.进一步地，所述微颗粒化的步骤为：将组织原材料和无菌生理盐水按质量比1:1
‑
1:5混匀后缓慢倒入胶体磨内物料仓，进行2000
‑
60000rpm，1
‑
10min的研磨，得到微颗粒的直径为1
‑
300微米。
33.步骤(10)的混合可以通过震荡器、均化器或超声波仪实现。
34.步骤(11)中辐照的辐射线选自γ射线、电子射线或者x射线中的一种。辐照剂量为5～40kgy；优选的，所述辐照剂量为20
‑
30kgy。
35.本发明的目的之三是提供上述脱细胞基质复合材料的应用，其包括将该复合材料用于制备促进组织血管化的支架材料方面的应用。
36.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
37.本发明的制备方法采用了物理法与化学法相结合的脱细胞方法，在有效去除可能引起人体免疫反应的抗原物质的同时，最大限度保留了细胞外基质原有的基本支架结构和主要生物化学成分；在此基础上，由于血管基质中的弹性蛋白在脱细胞过程中去除使之不利于加工成型并维持其机械强度，通过将非血管组织基质与提取自血管的脱细胞基质进行复合，能够保留非血管脱细胞基质的纤维特性获得不同性状的复合材料，并充分利用血管脱细胞基质内所含有的促血管化因子如vegf等，可有助于组织缺损处成血管化，而有效血管化有利于为周围的新生组织提供丰富的氧气和营养物质，有助于病变和缺损组织的修复修补。
附图说明
38.图1a为未脱细胞前组织原材料中的he染色效果图，b为脱细胞后基质的he染色效果图，c为未脱细胞前组织原材料中的he染色效果放大图，d为脱细胞后基质的he染色效果放大图；
39.图2为组织原材料脱细胞前后dna含量对比图；
40.图3为组织原材料脱细胞前后i型胶原蛋白含量对比图；
41.图4为血管组织原材料脱细胞前后vegf因子含量对比图；
42.图5a、b为脱细胞基质复合材料中孔隙孔径的sem图；图c、d为脱细胞基质复合材料中胶原蛋白三螺旋结构的sem图；
43.图6为实施例1和对比例1中的复合材料成血管实验显微镜下照片；
44.图7为实施例1和对比例1中的复合材料在成血管实验中毛细血管长度定量结果对比图；
45.图8为动物实验兔子宫内膜缺损植入材料实验后，空白对照组、缺损对照组和实验组的he和cd31组织切片染色图。
具体实施方式
46.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
47.实施例1
48.一种脱细胞基质复合材料的制备方法，包括以下步骤：
49.(一)取血管组织原材料，用去离子水清洗除去血液和污垢，将整个动脉剪开切成长、宽和高为所需规格尺寸的组织原材料。
50.称取500g组织原材料，将其和无菌生理盐水按质量比1:3的比例混合均匀，倒入胶体磨内粉碎均匀，并离心除去上清液，获得微颗粒化后中间体；将微颗粒化后中间体放置于3倍质量的胰酶溶液内，置于摇床上震荡处理8h后，离心除去上清液，再加入3倍质量的生理盐水，置于摇床上震荡清洗2h后，离心除去上清液，重复上述清洗过程3次，得到酶处理清洗后中间体；往酶处理清洗后中间体中加入4倍质量的脱氧胆酸钠溶液，置于摇床上过夜震荡处理18h后，离心除去上清液，再加入3倍质量的edta磷酸盐缓冲液，置于摇床上震荡2小时，离心除去上清液，重复清洗三次，得到脱细胞清洗后中间体；往脱细胞清洗后中间体中加入3倍质量脱氧胆酸钠溶液，置于摇床上震荡处理2h，离心除去上清液，再加入3倍质量edta的磷酸盐缓冲液，置于摇床上震荡清洗1小时，离心除去上清液后，再用注射用水重复上述过程2次，获得血管脱细胞基质中间体。
51.(二)把获得的真皮组织进行清洗、裁切后，称取其质量为500g，将其和过氧乙酸溶液按质量比1:3的比例混合均匀，置于摇床上震荡过夜24h，将震荡完毕后的离心瓶离心去除上清液。往沉淀中加入3倍质量的无菌生理盐水，置于摇床上震荡清洗10min，将震荡完毕后的离心瓶离心去除上清液，重复上述过程3次，获得消毒灭菌后中间体。
52.将消毒灭菌后中间体和无菌生理盐水按质量比1:3的比例混合均匀，倒入胶体磨内研磨3min，收集研磨后的微小颗粒物装于离心瓶内离心去除上清液，获得微颗粒化后中间体。
53.将微颗粒化后中间体和脱氧胆酸钠溶液按质量比1:4混合均匀，置于摇床上震荡过夜24h，将震荡完毕后的离心瓶离心去除上清液。加入4倍质量的无菌生理盐水，置于震荡清洗10min，将震荡完毕后的离心瓶离心去除上清液，重复上述过程10次，获得真皮脱细胞基质后中间体。
54.(三)将血管脱细胞基质中间体和真皮脱细胞基质后中间体按质量比1:1混合，混合物再和无菌去离子水按质量比1:1混合均匀，装入模具中在
‑
20℃下冷冻24h成型，再于
‑
50℃下冷冻干燥48h后装入密闭容器内，经20kgy(辐照剂量单位)的辐照后室温保存。
55.表征例1
56.将实施例1中的脱细胞前后生物组织进行he染色，染色结果见图1，从图1(a)中可以明显看到脱细胞前组织的细胞中有大量细胞核存在，从图1(b)中可以看到脱细胞后组织
的细胞核全部被清除了，证明该制备方法可有效脱去细胞和去抗原。
57.表征例2
58.取100mg实施例1的脱细胞前后生物组织材料，用dneasy blood&tissue kit(qiagen)试剂盒对其进行分析处理，并计算其脱细胞前后dna含量的变化，结果如图2。
59.从图2中可以明显看到，脱细胞后组织的dna含量远远低于其脱细胞前组织，证明该制备方法可有效脱去细胞。
60.表征例3
61.取100mg实施例1的脱细胞前后生物组织材料，在110℃下采用6mol/l盐酸水解后制成供试液，精密量取0.5ml空白(水)、羟脯氨酸对照品系列溶液及供试液，分别加入1ml异丙醇、0.5ml氧化剂溶液，混合后在室温下放置4min，再分别加入6.5ml显色剂，混合后，将各管放置在60℃水浴中加热15min，冷却，用空白对照，与560nm测定吸光度值，以羟脯氨酸对照品溶液系列浓度对其吸光度做直线回归，得到回归方程，由此计算出供试品溶液中羟脯氨酸含量，结果如图3。
62.按下式计算胶原蛋白含量：
63.胶原蛋白含量(％)＝羟脯氨酸含量(％)
÷
13％
×
100％，式中13％为羟脯氨酸在胶原蛋白中的占比。
64.从图3中可以明显看到生物组织材料脱细胞前后胶原蛋白含量并未产生显著性差异。
65.表征例4
66.取200mg实施例1的脱细胞前后生物组织材料，用猪(porcine)血管内皮细胞生长因子(vegf)elisa检测试剂盒对其进行分析处理，并计算其脱细胞前后vegf因子含量的变化，结果如图4。
67.从图4中可以明显看到生物组织材料脱细胞前后vegf因子含量产生极显著性差异，说明脱细胞步骤将会把生物组织中细胞内含有的vegf因子释放出来，虽然部分因子会在脱细胞步骤中被清除，但仍有大量的vegf因子会被吸附在胶原纤维上，材料的总体vegf因子浓度上升。
68.表征例5
69.对实施例1冻干后的材料进行扫描电镜拍摄，结果如图5。从图5中的a、b两张低倍镜下可以明显看到脱细胞基质复合材料具有三维多孔网状结构，并且在c、d两张高倍镜下可以看到材料中的胶原蛋白保留了完整的三螺旋结构。
70.对比例1
71.混合比例考查：
72.参照实施例1的方法，将前处理后的来自血管组织及真皮组织的组织材料经过消毒灭菌、微颗粒化、脱细胞等步骤，获得不同种类的脱细胞基质。将血管脱细胞基质和真皮脱细胞基质分别按0:1、1:2、2:1、1:0的比例混合，混合后加入等质量的无菌去离子水，搅拌混合均匀后，经过冷冻干燥后，装入密闭容器内，经20kgy(辐照剂量单位)的辐照后室温保存后，分别获得血管脱细胞基质含量为0％、33％、67％和100％的复合材料。
73.实验例1
74.将实施例1和对比例1的复合材料进行成血管实验，分别称取0.5g材料，按0.1g/ml
的比例加入5ml培养基，于37
±
1℃的恒温震荡箱内浸提24h，取培养基进行成血管实验，结果如图6。
75.从图6中可以明显看到，血管脱细胞基质含量为50％和67％的复合材料相较于其他组别，具有更好的成血管效果，并与图7的毛细血管长度定量结果相印证，但50％和67％两组材料在数值上并无显著性差异，说明当复合材料中血管脱细胞基质含量组分为50％
‑
67％之间，材料具有较强的成血管性能。
76.实验例2
77.通过对比分析实验例1的实验结果，选出血管脱细胞基质含量为67％的复合材料作为接下来动物实验的实验组所用材料。
78.将材料处理成合适大小，植入进大鼠子宫内膜子宫角损伤的体内模型，作为实验组，将不进行任何处理的大鼠作为空白组，将造模后不填充材料的大鼠作为对照组。在三个发情期结束后，通过适当的组织学分析来评估子宫内膜损伤的修复情况，结果如图8。
79.从图8的he和cd31组织切片中可以明显看到，缺损对照组的子宫内膜层明显薄于空白对照组，实验组的子宫组织明显厚于缺损对照组，略薄于空白组，说明材料对子宫组织缺损部位具有明显的促进组织再生功能。
80.以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。