血管内皮生长因子C在制备治疗青光眼的制品中的应用

血管内皮生长因子c在制备治疗青光眼的制品中的应用
技术领域
1.本发明属于眼病治疗药物技术领域，具体涉及血管内皮生长因子c(vascular endothelial growth factor
‑
c，vegf
‑
c)在制备治疗青光眼的制品中的应用。


背景技术：

2.青光眼是全球首位致盲眼病，据统计，2013年全世界40
‑
80岁的人群中，青光眼患病率为3.54％约6426万人，预计到2020年及2040年分别达到7602万人及11182万人，其中约有60％为亚洲青光眼患者。我国的流行病学研究表明，在我国非选择人群中，原发性青光眼的发病率最高为0.52％，继发性青光眼和先天性青光眼的发病率相对较低，分别为0.06％和0.02％。随着年龄增长，原发性青光眼的发病率也增加，在年龄超过40岁的人群中，原发性青光眼的发病率可达1.37％。不同类型的青光眼在性别上也存在差异，原发性闭角型青光眼(pacg)的发病率女性高于男性；原发性开角型青光眼(poag)的发病率男性高于女性。为降低病理性升高的眼内压(iop)，青光眼的治疗手段包括药物、激光及手术。其中，青光眼手术需将房水引流至结膜下以达到降眼压的作用；因此，手术后恢复结膜滤过功能就成为青光眼治疗手术的术后治疗的关键。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供血管内皮生长因子
‑
c(vegf
‑
c)在制备治疗青光眼的制品中的应用，通过结膜下注射vegf
‑
c生长因子来增加结膜淋巴管生成，从而弥补现有技术的不足。
4.本发明首先提供vegf
‑
c生长因子的一种用途，是在制备用于改善青光眼滤过手术后结膜淋巴引流功能的制品中的应用；
5.所述的制品，为注射用液体蛋白制剂；
6.所述的注射用液体蛋白制剂，是将vegf
‑
c溶解于中性缓冲液中制备的；
7.所述的液体蛋白制剂中vegf
‑
c的浓度为10
‑
50μg/μl；
8.本发明另一个方面还提供一种改善滤过手术后结膜淋巴引流功能的制品，所述的制品中包含有药理有效浓度的vegf
‑
c。
9.本发明将vegf
‑
c生长因子注射入正常新西兰大白兔结膜下，显示vegf
‑
c生长因子在改善滤过手术后结膜淋巴引流功能中具有重要作用。通过滤过手术后注射药物中添加vegf
‑
c生长因子，从而达到改善滤过手术后结膜淋巴引流功能的目的。
附图说明
10.图1：正常新西兰大白兔结膜免疫荧光结果图，其中a
‑
h为淋巴管相关标记位点podoplanin、lyve
‑
1染色结果，可见podoplanin染色结果与lyve
‑
1染色结果基本重合；i
‑
l为淋巴管相关标记位点lyve
‑
1与血管相关标记位点cd31染色结果，可见淋巴管相关标记位点lyve
‑
1与血管相关标记位点cd31染色结果基本不重合。
11.图2：vegf
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c生长因子注射入正常新西兰大白兔结膜淋巴管标记位点(podoplanin、lyve
‑
1)蛋白质水平变化图：vegf
‑
c生长因子处理组的淋巴管标记位点podoplanin、lyve
‑
1蛋白质表达水平较对照组上调，右侧为灰度分析的结果，n＝2，p值由独立样本t检验计算得出，*：p<0.05，**：p<0.01，误差线为标准差。
12.图3为vegf
‑
c生长因子注射入正常新西兰大白兔结膜淋巴管标记位点(podoplanin、lyve
‑
1)mrna水平变化图，vegf
‑
c生长因子处理组的淋巴管标记位点podoplanin、lyve
‑
1基因mrna表达水平较对照组上调，p值由独立样本t检验计算得出，*：p<0.05，**：p<0.01，误差线为标准差。
具体实施方式
13.本发明所使用血管内皮生长因子
‑
c(vascular endothelial growth factor
‑
c，vegf
‑
c)是淋巴管生成的关键调节因子，属于血管内皮生长因子家族。
14.本发明实施例中所使用的试剂材料、设备及实验动物信息如下：
15.1.试剂与材料：
16.vegf
‑
c生长因子(bivision，4633)；1ml注射器(kdl)；无菌磷酸盐缓冲液(pbs)(solarbio，p1020)；tritonx100(solarbio，t8200)，抗荧光衰减封片剂(含dapi)(solarbio，s2110)，tween80(aladdin，t104865)；ripa细胞组织裂解液(solarbio，r0010)；sds
‑
page loading buffer(non
‑
reducing，5x)(cwbio,cw0028)，bca蛋白浓度测定试剂盒(碧云天，p0010)；rna提取试剂盒(艾德莱，rn28)；反转录试剂盒(诺唯赞，r323
‑
01)；定量试剂盒(诺唯赞，q711
‑
02)；免疫荧光及蛋白抗体与实时荧光定量pcr引物。
17.2.仪器：
18.荧光显微镜(nikon，ni
‑
u)，凝胶成像系统(bio
‑
rad，chemidoc touch)，pcr仪(艾本德，mastercycler x50s)，荧光定量pcr仪(abi，7500)，组织匀浆仪(qiagen，tissuelyserⅱ)，离心机(ct15ke)。
19.3.实验动物：
[0020]6‑
8周的正常新西兰大白兔，体重6
‑
8kg，购自山东第一医科大学附属青岛眼科医院实验动物中心。
[0021]
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。下述实施例中所使用的实验方法无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂与材料。
[0022]
实施例1：验证正常新西兰大白兔结膜中存在淋巴管
[0023]
1.实验方法
[0024]
(1)冰冻切片免疫荧光染色验证正常新西兰大白兔结膜具有可被淋巴管标记物及血管标记物识别的管道结构，具体操作如下
[0025]
正常新西兰大白兔空气栓塞处死，取下的眼球去除晶状体及玻璃体并切成两半，包埋于oct胶中，4℃过夜后保存于
‑
80℃。将oct包埋的组织切成7um厚的冰冻切片，pbs清洗5min3次，4％多聚甲醛固定15min后，pbs清洗5min3次，以pbs稀释triton
‑
100至0.3％，取30ul滴加至切片上，30min后以pbs清洗5min3次。稀释封闭用胎牛血清至10％，滴加30ul血清稀释液至切片上，室温孵育60min后，抗体与切片在4。c下孵育过夜。将带有一抗的切片用
pbs清洗10min3次，滴加30ul二抗稀释液至切片上，湿盒内室温孵育60min，pbs清洗10min3次，并用含淬灭剂的dapi封片后，置于荧光显微镜下观察结果。
[0026]
表1：抗体信息统计表
[0027][0028][0029]
(2)实验结果
[0030]
正常新西兰大白兔结膜冰冻切片免疫荧光染色，如图1a，淋巴管标记物podoplanin、lyve
‑
1染色结果基本重合，图1b可见淋巴管标记物podoplanin与血管标记物cd31染色结果基本不重合，这表明兔结膜中存在podoplanin及lyve
‑
1标记的淋巴管。
[0031]
实施例2：vegf
‑
c生长因子可上调正常新西兰大白兔结膜中淋巴管相关标记物表达，促进淋巴管增生。
[0032]
1.实验方法
[0033]
(1)vegf
‑
c生长因子结膜注射动物模型构建及取材
[0034]6‑
8月龄成年正常新西兰大白兔4
‑
5只，左眼作为对照组，右眼作为处理组注射vegf
‑
c生长因子(0.05ng/ul)，注射七天后，将新西兰大白兔空气栓塞处死，将结膜于角巩膜缘处分离至穹隆结膜附近取下，清除结膜下肌肉组织后，放入液氮中速冻。
[0035]
(2)兔结膜蛋白提取及蛋白印迹实验
[0036]
向装有结膜样品的离心管中加入含有蛋白酶抑制剂的ripa裂解液200ul，在显微镜下剪碎组织后，放入组织匀浆仪内，充分配平，参数设置为1min27次，总时间为5min，2秒开、2秒关。将匀浆后的组织蛋白用超声探头进行超声，超声能量设置为60％，总时间为1min。充分裂解的组织蛋白在4℃离心机12000rpm离心20min后，取蛋白上清，加入标记好的离心管中。利用bca蛋白浓度测定试剂盒对蛋白上清进行浓度测定后，将上清液移到标记好的离心管中，按照上清液与loading buffer1:4的比例加入sds
‑
page loading buffer(non
‑
reducing，5x)，95。c水浴锅煮10min，取20
‑
50ug蛋白样品进行蛋白免疫印迹实验。
[0037]
表2：实施例2中用到的抗体信息表
[0038][0039]
(3)兔结膜rna提取及实时荧光定量pcr实验
[0040]
向装有兔结膜的离心管中按照艾德莱rna提取试剂盒说明书加入裂解液，剪碎组织后放入组织匀浆仪充分匀浆，保证操作中的无rna酶状态，使组织细胞充分裂解后按照艾德莱rna提取试剂盒说明书提取rna。
[0041]
取1ugrna，利用反转录试剂盒合成cdna，利用superreal premix plus(sybr green)和荧光定量pcr仪进行实时荧光定量pcr实验。以gadph为内参基因，运用2
‑
δδct
法计算目的基因mrna表达量与内参基因mrna表达量的比值，进行相对定量。
[0042]
表3：引物信息表
[0043][0044][0045]
2.实验结果
[0046]
为探讨vegf
‑
c改善结膜淋巴引流功能，在正常新西兰大白兔结膜注射vegf
‑
c生长因子(10
‑
50ug/ul)。如图2可见，在蛋白质水平上结膜中淋巴管相关位点podoplanin及lyve
‑
1表达量上调，血管标记物cd31表达量变化不大；如图3可见，在mrna水平上，结膜中淋巴管相关位点podoplanin及lyve
‑
1表达量上调，血管标记物cd31表达量变化不大。以上结果表明vegf
‑
c生长因子可增加结膜淋巴管生成，具有改善结膜淋巴引流功能的潜力。
[0047]
以上实施例仅用以说明本发明的计数方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方法进行一一列举。凡在本发明的精神及原则之内所作的任何修改、等同替换及改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。