一种抑制奶牛源沙门菌的复方中药组合物及应用

1.本发明涉及中药组合物技术领域，更具体的说是涉及一种抑制奶牛源沙门菌的复方中药组合物及应用。


背景技术：

2.奶牛沙门菌病主要临床症状为败血、高热、腹泻，该病在一年四季均可发生，严重影响养殖业的发展，目前防治奶牛沙门菌病主要采用抗生素，但由于抗生素的滥用，使得多重耐药沙门菌不断出现，抗生素的治疗效果受到很大影响。
3.中草药是千百年来经过不断实践，试验形成的产物，是我国传统文化的瑰宝。很多草药都有抗菌和抗病毒的作用，但作用机理不同于西药，其中对复方中草药的抑菌机理目前尚未明了，原理也较为复杂。
4.因此，如何提供一种抑制奶牛源沙门菌的复方中药组合物是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了一种抑制奶牛源沙门菌的复方中药组合物及应用。药材配伍使用产生比单味药更强的药效和临床效果。其中，每味药材含有多种防治疾病的有效成分，配伍后在药性上可以互相促进，协同增效，在毒性上相互制约，减少或缓和毒副作用。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种抑制奶牛源沙门菌的复方中药组合物，包含以下原料：乌梅、五倍子、五味子、黄芩、甘草。
8.优选的：乌梅、五倍子、五味子、黄芩、甘草按质量比为1～4：1～5：1～4：1～2：1～4。
9.进一步的：乌梅、五倍子、五味子、黄芩、甘草按质量比为1:1:1:1:1。
10.本发明还提供了上述的一种抑制奶牛源沙门菌的复方中药组合物的制备方法，包括以下步骤：
11.1)称取各原料混合，加入蒸馏水，浸泡；
12.2)武火煮沸后，文火熬制，过滤，收集滤液；重复2次，合并2次滤液进行浓缩得浓缩液；
13.3)浓缩液离心，取上清液灭菌，即得一种抑制奶牛源沙门菌的复方中药组合物。
14.优选的：步骤1)浸泡时间为0.5～1h。
15.优选的：步骤1)各原料总质量和蒸馏水按质量体积比为1g：2～3ml。
16.优选的：步骤2)武火温度为150℃～220℃；文火温度为80℃～120℃，熬制的时间为30～35min；过滤采用32层纱布；浓缩的程度至浓缩液终浓度为1g/ml。
17.优选的：步骤3)离心条件为4000rpm，时间为8min；灭菌采用121℃高压灭菌。
18.本发明还提供了上述的一种抑制奶牛源沙门菌的复方中药组合物在制备防治奶
牛源沙门菌感染药物中的应用。
19.优选的：药物中复方中药组合物的mic为0.49～0.98mg/ml，mbc为0.98～1.96mg/ml。
20.优选的：中药组合物降低血清gpt、got含量、提高血清tp、igg含量、降低炎症反应。
21.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种抑制奶牛源沙门菌的复方中药组合物及应用，相较于现有技术，中药组合物对奶牛源沙门菌的平均抑菌直径为26.7mm，平均mic和mbc分别为0.56mg/ml、1.12mg/ml，说明中药组合物效果体外抑菌效果较好；中药组合物能提高小鼠血清tp、igg含量，降低got和gpt水平，对防治奶牛源沙门菌感染有一定效果。而且不仅具有抑菌、抗菌的效果，药材来源广泛、毒副作用小、药物残留少、无耐药性。
具体实施方式
22.下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.本发明实施例公开了一种抑制奶牛源沙门菌的复方中药组合物及应用。
24.实施例1
25.实验动物及菌株
26.spf级balb/c小鼠60只，19日龄左右，体质量18～20g。
27.编号hb1～hb7(血清型：hb1～hb6为甲型副伤寒沙门菌，hb7为乙型副伤寒沙门菌)的7株奶牛源沙门菌，菌株hb1对19日龄小鼠的半数致死量(ld
50
)为1
×
107cfu/ml，菌株hb7对19日龄小鼠的半数致死量(ld
50
)为5.6
×
106cfu/ml，由河北省预防兽医学重点实验室分离鉴定并保存。
28.菌液的制备与计数
29.从
‑
80℃冰箱中取出保存的沙门菌划线于ss培养基中复苏，挑取单菌落于lb液中37℃培养致对数生长期后，利用计数板计数法调整菌株hb1和hb7的菌液浓度分别为为1
×
107cfu/ml和5.6
×
106cfu/ml。
30.实施例2
31.中药组合物的制备
32.一种抑制奶牛源沙门菌的复方中药组合物，包含以下原料：乌梅、五倍子、五味子、黄芩、甘草。
33.为进一步优化技术方案：乌梅、五倍子、五味子、黄芩、甘草按质量比为1：5：1：2：1。
34.制备方法，包括以下步骤：
35.1)称取各原料混合，加入蒸馏水，浸泡；
36.2)武火煮沸后，文火熬制，过滤，收集滤液；重复2次，合并2次滤液进行浓缩得浓缩液；
37.3)浓缩液离心，取上清液灭菌，即得一种抑制奶牛源沙门菌的复方中药组合物。
38.为进一步优化技术方案：步骤1)浸泡时间为0.5h。
39.为进一步优化技术方案：步骤1)各原料总质量和蒸馏水按质量体积比为1g：2ml。
40.为进一步优化技术方案：步骤2)武火温度为150℃；文火温度为120℃，熬制的时间为30min；过滤采用32层纱布；浓缩的程度至浓缩液终浓度为1g/ml。
41.为进一步优化技术方案：步骤3)离心条件为4000rpm，时间为8min；灭菌采用121℃高压灭菌。
42.实施例3
43.中药组合物的制备
44.一种抑制奶牛源沙门菌的复方中药组合物，包含以下原料：乌梅、五倍子、五味子、黄芩、甘草。
45.为进一步优化技术方案：乌梅、五倍子、五味子、黄芩、甘草按质量比为1：1：1：1：1。
46.制备方法，包括以下步骤：
47.1)称取各原料混合，加入蒸馏水，浸泡；
48.2)武火煮沸后，文火熬制，过滤，收集滤液；重复2次，合并2次滤液进行浓缩得浓缩液；
49.3)浓缩液离心，取上清液灭菌，即得一种抑制奶牛源沙门菌的复方中药组合物。
50.为进一步优化技术方案：步骤1)浸泡时间为0.75h。
51.为进一步优化技术方案：步骤1)各原料总质量和蒸馏水按质量体积比为1g：2.5ml。
52.为进一步优化技术方案：步骤2)武火温度为200℃；文火温度为100℃，熬制的时间为33min；过滤采用32层纱布；浓缩的程度至浓缩液终浓度为1g/ml。
53.为进一步优化技术方案：步骤3)离心条件为4000rpm，时间为8min；灭菌采用121℃高压灭菌。
54.实施例4
55.中药组合物的制备
56.一种抑制奶牛源沙门菌的复方中药组合物，包含以下原料：乌梅、五倍子、五味子、黄芩、甘草。
57.为进一步优化技术方案：乌梅、五倍子、五味子、黄芩、甘草按质量比为4：1：4：1：4。
58.制备方法，包括以下步骤：
59.1)称取各原料混合，加入蒸馏水，浸泡；
60.2)武火煮沸后，文火熬制，过滤，收集滤液；重复2次，合并2次滤液进行浓缩得浓缩液；
61.3)浓缩液离心，取上清液灭菌，即得一种抑制奶牛源沙门菌的复方中药组合物。
62.为进一步优化技术方案：步骤1)浸泡时间为1h。
63.为进一步优化技术方案：步骤1)各原料总质量和蒸馏水按质量体积比为1g：3ml。
64.为进一步优化技术方案：步骤2)武火温度为220℃；文火温度为80℃，熬制的时间为35min；过滤采用32层纱布；浓缩的程度至浓缩液终浓度为1g/ml。
65.为进一步优化技术方案：步骤3)离心条件为4000rpm，时间为8min；灭菌采用121℃高压灭菌。
66.实施例5
67.试验设计与样品采集
68.先用中药组合物(药液)对菌株hb1～hb7进行体外抑菌试验，测试其体外抑菌效果，
69.再用菌株hb1和hb7分别感染spf级balb/c小鼠，每组各5只，共6组，分为空白对照组、阳性组(感染不给药组)、注射兽用头孢曲松钠组和中药组合物治疗组(按给药浓度各分为3组，hb1：a1、b1、c1和hb7：a7、b7、c7)，灌胃浓度均分别为0.02g/ml、0.01g/ml、0.005g/ml，每次0.2ml，连续灌胃7d并进行观察。小鼠麻醉后，眼球采血，将血液滴入预冷的ep管中，3000rpm离心10min，进行血清指标检测，分析评价中药组合物的效果。
70.在牛津杯打孔的培养基上，将7株菌液用无菌玻璃涂布棒涂抹均匀，分别在孔里加入150μl中药组合物药液，设置3个平行，设置阳性对照(涂菌，添加头孢曲松钠)和空白对照(涂菌，加双蒸水)，将培养基正放置在37℃恒温培养箱中培养18～24h，取出测定抑菌圈直径。
71.判定标准：抑菌圈直径小于10mm为耐药，10～15mm为中度敏感，15mm以上为高度敏感。
72.采用二倍稀释平板法，在96孔细菌培养板的第1～12孔中分别加入100μl灭菌水(防止水分蒸发影响结果)，然后在第2孔再加入100μl中药组合物药液(125g/ml)混合均匀后取100μl加入第三孔，以此类推稀释到第9孔后弃100μl，中药组合物药液最终浓度梯度范围为：62.5mg/ml～0.245mg/ml。在第2～10孔中分别加入10μl对数期的菌液(109cfu/ml)，每种药物3个重复，第10孔不加药液的阳性对照孔，第11孔为不接菌的阴性对照孔，置于37恒温培养箱中培养24h，每孔中加入1％的红四氮唑5μl，颜色变红说明有细菌生长，以无细菌生长的稀释度为该中药组合物对细菌mic。用无菌棉签分区划线法将不同稀释梯度的试验菌液接种于普通培养基上，每种药物3个重复，置于37℃恒温培养箱中培养12～16h，无菌生长的区域为该药的mic。在mic试验基础上继续培养24h，观察结果，清澈透明无浑浊现象的试管即为无菌生长试管，无菌生长试管中的最低药物浓度为mbc。
73.小鼠血清tp、igg、got和gpt指标的检测
74.小鼠血清tp、igg、got和gpt指标的检测步骤按照说明书进行，并绘制tp、igg、got和gpt各指标的标准曲线，计算tp、igg、got和gpt指标的活性，从血清生化角度观察中药组合物的药效。
75.结果表明：
76.由表1可知，7株奶牛源沙门菌对中药组合物高度敏感。其中中药组合物对hb1、hb2、hb3、hb6抑菌圈直径为27mm，中药组合物对hb4抑菌圈直径为26mm，中药组合物对hb5抑菌圈直径为25mm，中药组合物对hb7敏感性测定结果为28mm，平均抑菌圈直径为26.7mm。对中药组合物的mic和mbc体外抑菌发现：中药组合物对7株沙门菌的mic在0.49～0.98mg/ml，中药组合物低浓度即能抑制2株沙门菌的生长；中药组合物对7株沙门菌的mbc在0.98～1.96mg/ml，中药组合物较低的浓度能杀死2株沙门菌。综合中药组合物的体外抑菌直径、mic和mbc，该中药组合物抑菌效果较好。
77.表1中药组合物对奶牛源沙门菌敏感性测定结果(单位：mm)
[0078][0079]
中药组合物对人工感染沙门菌小鼠治疗后血清生化指标变化结果
[0080]
对于总蛋白(totalprotein,tp)含量的测定，由表2可知，空白对照组tp的含量为49～51gpt/l，攻hb1和hb7菌的阳性组为41～43gpt/l，比空白对照组血清tp含量增加约8gpt/l，中药组合物治疗试验组tp的含量均高于阳性组，与头孢曲松组一致，中药组合物对小鼠治疗试验能提高血清tp含量，与正常组相当。但给药浓度在0.02g/ml时，血清中的tp含量最高，且随着给药浓度的增加tp含量依次升高。
[0081]
表2治疗组小鼠血清中tp含量的测定结果(gpt/l)
[0082][0083]
由表3可知，空白对照组igg含量为41.17～41.19g/l，阳性组为30～34g/l，治疗组igg含量均高于阳性组，使用数据统计软件ibm spss statistics 26进行分析，发现治疗组血清igg显著高于阳性组(p<0.05)，中药组合物对小鼠治疗试验血清igg含量显著提高，最适中药组合物浓度为0.02g/ml。
[0084]
表3治疗组小鼠血清中igg含量测定结果(g/l)
[0085][0086][0087]
由表4可知，空白对照组gpt含量为32～65μmol/ml，阳性组为613～644μmol/ml，使用数据统计软件ibm spss statistics 26进行分析，发现治疗组血清gpt含量显著低于阳性组(p<0.05)，中药组合物能显著降低hb1和hb7感染小鼠的血清gpt的含量，最适中药组合
物浓度为0.01g/ml。
[0088]
表4治疗组小鼠血清中gpt的测定结果(μmol/ml)
[0089][0090]
由表5可知，空白对照组got含量为55～57μmol/ml，攻菌后阳性组69～70μmol/ml，用数据统计软件ibm spss statistics 26进行分析，结果显示治疗组血清got含量显著低于阳性组(p＜0.05)，中药组合物能显著降hb1和hb7感染小鼠的血清got的含量，其最适中药组合物浓度为0.02g/ml。
[0091]
表5治疗组血清中got含量的测定结果(μmol/ml)
[0092][0093][0094]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0095]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。