一种防治球虫病的组合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及饲料添加剂技术领域，尤其涉及一种防治球虫病的组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.球虫病在养殖业中发病率高，是一种危害性极大、分布广泛的寄生虫病。其中鸡球虫病危害尤其严重，主要侵袭3月龄以内的雏鸡，成鸡一般是带虫者，使其他家禽均可感染发病，因此在养鸡生产中，几乎所有雏鸡饲料中都必须加入抗球虫药物，我国每年投入预防本病的药物费用平均为每只鸡0.2元～0.3元，每年用于防治鸡球虫病的药费达数亿元人民币，占鸡病全部防治费用的近1/3，鸡群一旦感染，可引起雏鸡下痢、便血、贫血，发病率和致死率可高达80％，严重阻碍禽畜的生长发育和生产能力，给全球养殖业造成了巨大的经济损失。
3.研究表明，在鸡群中传播的鸡球虫主要分为7种，分别为堆型艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和早熟艾美耳球虫，其中以柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫对鸡的致病力最强。目前在临床上防控鸡球虫的主要措施有聚醚类离子载体抗生素、化学合成类球虫药、疫苗、中草药的使用等。
4.聚醚类离子载体抗生素概况：早在20世纪50年代就发现了聚醚类离子载体抗生素，该类抗生素具有促进离子通过细胞膜的能力，至20世纪70年代，聚醚类抗生素已成为抗球虫病药物的支柱。目前用于临床生产上的聚醚类离子载体抗生素主要有莫能菌素、拉沙菌素、盐霉素、马杜霉素、那拉霉素、山度霉素和海南霉素等，这类药物一般作用于球虫生活史的早期阶段，具有毒性低、抗虫谱广、抗药性产生慢等特点，通常作为鸡球虫病的预防性药物，但随着离子载体类抗球虫药的广泛应用，球虫也逐渐对这些抗生素产生了抗药性。
5.化学合成类球虫药概况：目前用于养鸡生产的化学合成抗球虫药主要有氯羟吡啶、二硝托胺、氨丙啉、尼卡巴嗪、常山酮、地克珠利、托曲珠利、磺胺喹噁啉和乙氧酰胺苯甲酯等。化学合成药物虽然疗效好，但有些容易产生抗药性，研究表明，各种化学合成类药物在使用一段时间后，都会引起球虫的抗药性，甚至产生耐药虫株，有时还会导致球虫对该药的其他同类药物也产生抗药性。
6.临床应用疫苗概况：目前临床应用的疫苗主要包括活疫苗、dna疫苗、亚单位疫苗、活载体疫苗等。其中，应用最广泛的是活疫苗，活疫苗可分为强毒疫苗、弱毒疫苗、晚熟系球虫苗和早、中、晚熟系联合球虫苗4类。强毒疫苗虽然能激发宿主产生足够的保护力，但在使用过程中也存在一定的风险：如强毒疫苗在制作和使用过程中不使用抗球虫药，如免疫不当，可能会引起球虫病；强毒疫苗中的混合球虫是野生毒株，未经任何致弱处理，毒力较强，如使用不当可能会引起球虫病；强毒疫苗是由地方性毒株组成，若不谨慎使用，能将强毒虫株引入新的鸡场，引起当地球虫病暴发等。弱毒活苗是从自然感染的鸡粪便中收集卵囊，采用单卵囊扩增法来纯化卵囊，然后通过减弱虫株的致病性，降低对宿主的危害性，并能产生
足够的免疫力的致弱虫株，按一定比例配以适当的稳定剂而组成的一种活疫苗。目前致弱的方法有早熟选育、鸡胚传代和理化处理等几种。弱毒疫苗相比强毒疫苗，致病性显著下降，且仍保持了良好的免疫原性。但也存在一些不足：弱毒疫苗的制作工艺繁琐，耗时耗力；弱毒疫苗虫株的繁殖力相比亲本株明显下降，导致研制成本增加；致弱虫株存在致弱性能不稳定，毒力返强等潜在因素。虽然疫苗是防控鸡球虫病的重要措施之一，但还存在许多不足，如活卵囊疫苗虽然能提供完全保护，但存在制作工艺繁琐、容易扩散病原等问题，而基因工程疫苗即使能诱发鸡体产生部分保护力但仍然无法替代传统活疫苗等问题。
7.中草药概况：生产上常用的防治球虫病的中草药主要有驱虫类药，如常山、苦楝皮、百部、冰片、雄黄、槟榔、雷丸、芜荑、贯众等；清热燥湿类药，如黄芩、黄连、黄柏、白头翁、龙胆草、茵陈等；清热解毒类药，如青蒿、柴胡、白茅根、蒲公英、地锦草、穿心莲、金银花、大青叶、藿香等；补气益血类药，如党参、黄芪、当归、白芍、甘草、大枣等；活血止血类药，如丹参、桃仁、旱莲草、翻白草、白及、蒲黄等。其中，常山、苦参、青蒿、柴胡等一般用作抗球虫中药复方的君药；白茅根、黄柏、黄芪、仙鹤草、地锦草等一般用作复方制剂的辅药，金银花、当归等作为佐药；甘草、车前草等作为使药使用。在不同的方剂中，各味中草药的主次作用也会有所变化。它们之间须按照一定的组方法则进行配伍，以达到最佳组合效应，从而取得最好的防治鸡球虫病的效果。近年来，中药防治鸡球虫的相关机理也取得一定的进展。如大黄具有抗炎和缓泻作用，促进虫体或卵囊的排出；苦楝根皮内含有川楝素和楝树碱等生物碱，它们具有杀灭原虫的作用，尤其对子孢子和第一代裂殖体有抑杀作用；常山含有常山酮等生物碱，对球虫内生性发育的第二代裂殖生殖有抑制作用。就中草药本身而言，只有少数药的作用机理进行了探究，大多数药物的机理尚不明确。由于中草药抗球虫制剂中的成分复杂，对复方制剂作用机理的探讨，仅从中兽医理论、组方原则和治疗效果的观察上来推理解释还不完善，需结合现代研究和检测方法来探讨。
8.鸡球虫病是由艾美耳属球虫寄生于鸡肠上皮细胞内所引起的原虫病，该病对养鸡业危害极大，其发病率达80％～100％，病死率达20％～30％，严重时病死率高达80％，全世界因球虫病所造成的损失每年约20亿英镑。自levine发现磺胺类药物具有抗球虫作用以来，已先后有50多种药物投入临床应用，为养鸡业的发展做出了贡献。然而随着药物的广泛应用，球虫抗药性问题日趋普遍和严重，多重抗药性或交叉抗药性的产生大大缩短了药物的使用年限。虽然人们对鸡球虫病的免疫预防进行了一些研究，但目前及今后相当长的一段时间内，药物防治仍是控制鸡球虫病的主要手段，而目前应用的聚醚类离子载体抗生素、化学合成抗球虫药、疫苗均存在一定的不足，因此，亟待开发一种新型的抗鸡球虫措施，以弥补上述不足。
9.天然提取物具有独特的作用机制、丰富的生物活性、显著的治疗效果和副作用小甚至无副作用等优势，能为新型无害的抗鸡球虫产品的研发提供思路和来源。目前研究表明具有抗微生物的植物挥发性油具有抗球虫效果；植物挥发性油中含酚类、醛类等氧化物质，能对游离于肠腔球虫有抑制作用；富含抗氧化剂的天然提取物对治疗球虫感染存在潜在的应用价值，均表明天然提取物是抗鸡球虫药物开发的重要潜在来源。


技术实现要素：

10.本发明的首要目的在于提供一种天然、疗效确切、无药残及副作用的防治球虫病
的组合物，所述组合物由以下重量份的原料组成：石榴提取物0.25
‑
0.50份、鬼针草提取物20
‑
40份、铁苋菜提取物20
‑
40份、凤尾草提取物2.50
‑
5.00份、马齿苋提取物1.25
‑
2.50份、艾叶油0.50
‑
1.00份、茶树精油2.50
‑
5.00份。
11.优选地，所述组合物由以下重量份的原料组成：石榴提取物0.50份，鬼针草提取物40份，铁苋菜提取物40份，凤尾草提取物5.00份，马齿苋提取物2.50份，艾叶油1.00份，茶树精油5.00份。
12.本发明组合物中各物质之间相互协同增效，共同作用，可有效地预防和治疗球虫病：例如，石榴提取物含有多种生物碱，具有广谱抗菌作用，具驱杀虫、收敛、涩肠、止痢止血等功效；鬼针草具有清热解毒、散瘀活血的功效，有研究表明鬼针草还可以显著提升鸡体重，降低盲肠损伤，可通过调节肠道细菌，对于鸡的生长表现及原虫感染具有有益效果；铁苋菜中含生物碱、黄酮甙、酚类，具有清热解毒、利湿消积、收敛止血的功效，可用于肠炎，痢疾，吐血、衄血、便血、尿血，崩漏；凤尾草具有清热利湿、凉血止血、消肿解毒等功效，用于治疗痢疾、肠炎、吐血、便血、尿血等病症；马齿苋，消炎杀菌，治疗肠炎同时减轻肠炎引起的一些症状，清热止血，缓解患病禽畜出血症状；艾叶油散寒止痛，止血凝血功能，抑制纤维蛋白溶酶的活性，可促进凝血；茶树精油，为广谱抗微生物，具有抑菌、抗炎、驱虫，杀螨的功效，可改善禽畜感染球虫引起的肠炎症状。
13.本发明还提供了一种上述防治球虫病的组合物的制备方法：将上述配方量的组合物配制成溶液，搅拌，灭菌。
14.优选地，将上述配方量的组合物，加水配制成溶液。
15.本发明另一个目的是提供上述组合物在用于制备防治球虫病药物方面的应用。
16.进一步地，所述组合物是在用于制备防治鸡球虫病药物方面的应用。
17.进一步地，本发明提供了上述组合物在制备防治柔嫩艾美耳球虫药物中的应用。
18.作为本发明优选方案，所述组合物按配方量配成水溶液，各组分浓度分别为石榴提取物0.025～0.05mg/ml，鬼针草提取物2～4mg/ml，铁苋菜提取物2～4mg/ml，凤尾草提取物0.25～0.5mg/ml，马齿苋提取物0.125～0.25mg/ml，艾叶油0.05～0.1μl/ml，茶树精油0.25～0.5μl/ml。
19.作为本发明优选方案，将所述组合物按照配方量配成溶液，每日给药剂量5ml，一日1次，连用3
‑
5日。
20.本发明组合物不仅改善了球虫感染对鸡只造成的体重下降、盲肠损伤等情况，还有效提高感染鸡只存活率以及减少感染鸡只排出的卵囊，抗球虫指数大于160％，具有较好的保护效果。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
22.(1)本发明提供了一种防治球虫病的组合物，组合物中各物质之间相互协同增效，共同作用，可有效地预防和治疗球虫病，抑制球虫繁殖。不仅改善球虫感染对鸡只造成的体重下降、盲肠损伤等情况，同时能有效提高感染鸡只存活率以及减少感染鸡只排出的卵囊，有利于防控球虫的传播，抗球虫指数大于160％，具有较好的保护效果。
23.(2)本发明组合物成分均为天然植物提取物，克服了疫苗和抗生素使用的缺陷，减少甚至替代抗生素的使用，无药物残留；有效提高了肉、蛋食品安全性能，在鸡球虫病的防治领域具有广阔的应用前景。
附图说明
24.图1为细胞毒性试验测试结果。
25.图2为子孢子入侵率分析结果。
26.图3为盲肠组织切片显微镜照片。
27.图4为盲肠病变情况照片。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行制备。所用药物试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
30.本发明实施例中所用石榴提取物(jhs
‑
025)购自陕西嘉禾生物科技股份有限公司，鬼针草提取物(sy20191212265)购自陕西森元生物科技有限公司，铁苋菜提取物购自陕西森元生物科技有限公司，凤尾草提取物购自陕西天瑞生物技术有限公司，马齿苋提取物购自陕西森元生物科技有限公司，艾叶油购自深圳安泰生物科技有限公司，茶树精油购自陕西森弗天然制品有限公司。
31.实施例1
32.一种防治球虫病的组合物，配方如下：石榴提取物0.25g，鬼针草提取物20g，铁苋菜提取物20g，凤尾草提取物2.50g，马齿苋提取物1.25g，艾叶油0.50ml，茶树精油2.50ml。
33.将上述配方量的组合物加水配制成10l组合物溶液，搅拌，分装，灭菌，备用。
34.实施例2
35.一种防治球虫病的组合物，配方如下：石榴提取物0.50g，鬼针草提取物40g，铁苋菜提取物40g，凤尾草提取物5.00g，马齿苋提取物2.50g，艾叶油1.00ml，茶树精油5.00ml。
36.将上述配方量的组合物加水配制成10l组合物溶液，搅拌，分装，灭菌，备用。
37.实施例3
38.一种防治球虫病的组合物，配方如下：石榴提取物0.375g，鬼针草提取物30g，铁苋菜提取物30g，凤尾草提取物3.75g，马齿苋提取物1.875g，艾叶油0.75ml，茶树精油3.75ml。
39.将上述配方量的组合物加水配制成10l组合物溶液，搅拌，分装，灭菌，备用。
40.对比例1
41.一种防治球虫病的组合物，配方如下：石榴提取物0.50g，鬼针草提取物40g。
42.将上述配方量的组合物加水配制成10l组合物溶液，搅拌，分装，灭菌，备用。
43.本对比例与实施例2不同之处在于，缺少铁苋菜提取物、凤尾草提取物、马齿苋提取物、艾叶油及茶树精油。
44.对比例2
45.一种防治球虫病的组合物，配方如下：石榴提取物0.375g，鬼针草提取物30g。
46.将上述配方量的组合物加水配制成10l组合物溶液，搅拌，分装，灭菌，备用。
47.本对比例与实施例2不同之处在于，缺少铁苋菜提取物、凤尾草提取物、马齿苋提
取物、艾叶油及茶树精油，改变浓度为实施例2的75％。
48.试验例
49.为证明本发明组合物对鸡球虫病的防治效果，对本发明组合物进行体外抑制鸡球虫试验和临床疗效观察试验，以下通过试验例进一步阐述本发明组合物的有益效果。
50.(一)试验材料与试验方法
51.1.1试验材料
52.1.1.1试验动物：spf鸡。
53.1.1.2试验虫株及细胞株：柔嫩艾美耳球虫虫株；df
‑
1细胞。
54.1.1.3主要试剂耗材：胰蛋白酶
‑
edta消化液(0.25％)；细胞培养用青霉素
‑
链霉素；胎牛血清；50ml细胞培养瓶；24孔细胞培养板；次氯酸钠；牛血清白蛋白(bsa)；透明质酸酶；细胞培养基dmem；cfda
‑
se细胞增殖与示踪检测试剂盒；cck
‑
8试剂盒；流式细胞进样管；80目、120目标准分离筛；重铬酸钾等。
55.1.1.4主要仪器：高速常温台式离心机；立式压力蒸汽灭菌器；恒温培养箱；紫外分光光度计；电热恒温水浴锅；超声波裂解仪；二氧化碳培养箱；正置显微镜、倒置显微镜和倒置荧光显微镜；正置荧光显微镜；流式细胞检测仪；超低温冰箱；生物安全柜；台式冷冻离心机；超高速冷冻离心机；核酸电泳仪；pcr仪；麦克马斯特(mcmaster's)虫卵计数器等。
56.1.2试验方法
57.1.2.1粪便中球虫卵囊的收集：通过饱和食盐水方法大量收集带血粪便中的卵囊，粪便中卵囊收集的具体操作步骤如下：
58.(1)将粪便加入3l烧杯中，向烧杯内加入3倍体积的自来水，充分搅拌均匀，然后用80目标准分离筛进行过滤，过滤过程中用玻璃棒不停搅拌，收集滤液和滤渣；
59.(2)向滤渣中再加入自来水，重复步骤1，此过程重复2次，最后弃去滤渣，将所得滤液混合后再次用180目的标准分离筛进行二次过滤，滤液收集至烧杯中，滤液静止3h至5h，然后快速倾去大部分上清(注意尽量避免倒掉沉淀)，将剩余的混悬液搅拌混匀后用500ml离心管离心，3600r/min室温离心8min，弃上清，收集沉淀；
60.(3)用玻璃棒搅匀沉淀，加入少许饱和食盐水，搅匀，再次添加至500ml离心管容积上限并搅拌，形成均匀的混悬液，混悬液3600r/min室温离心8min；
61.(4)将含卵囊的上清溶液倒入另外一个3l大烧杯中，重复步骤3，此过程重复2次。合并所有上清液，在上清液中加入至少3倍体积的自来水，然后3600r/min室温离心8min沉淀卵囊；若所得卵囊沉淀中杂质较多，需再次用饱和食盐水离心漂浮一次，以获得较为纯化的球虫卵囊；
62.(5)卵囊沉淀中加入5倍体积的naclo溶液，4℃处理10min(每隔3min摇晃一次)，以除去细菌和卵囊表面的杂质，用10倍体积的自来水3600r/min室温离心8min，洗涤3次，沉淀即为分离的球虫卵囊。
63.1.2.2鸡球虫卵囊孢子化：将naclo除杂的卵囊转至终浓度为2.5％的k2cro4平皿中，28℃条件下培养48h，镜检观察卵囊孢子化的程度。当孢子化卵囊比例超过90％时，置4℃冰箱中保存，备用。
64.1.2.3鸡球虫无菌子孢子的制备：将纯化后的柔嫩和毒害艾美耳球虫孢子化卵囊，用干烤灭菌的玻璃匀浆器研磨破坏卵囊壁，释放出孢子囊，收集孢子囊于无菌的10ml离心
管，加入hbbs，2000r/min离心10min，用灭菌的hbbs悬浮沉淀，转移至50ml灭菌的三角烧瓶中，加入0.5％的胰蛋白酶和5％的鸡胆汁，混匀后置于41℃消化至90％以上的子孢子溢出，2500r/min离心5min，收集沉淀，用hbbs悬浮后，用干烤过的g3砂芯漏斗，收集滤液于无菌的离心管中，离心洗涤后即可得到用于细胞培养的柔嫩艾美耳球虫子孢子，子孢子一般是现用现制，可置于4℃短时间保存。
65.1.2.4df
‑
1细胞培养与制备：df
‑
1细胞在使用前一个星期进行复苏，将细胞从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中融化，将细胞转入10ml无菌离心管中，1000r/min离心5min，用含10％胎牛血清的dmem培养基悬浮细胞，转入50ml细胞培养瓶中，置于37℃，5％co2浓度的二氧化碳培养箱中培养，每两天更换一次培养基，待细胞铺满培养瓶壁后，用0.25％胰蛋白酶
‑
edta消化液37℃消化3
‑
5min，倒去消化液，加入培养基，用吸管反复吹打，使细胞脱离培养瓶壁，转入新的培养瓶中继续培养，待细胞生长状态旺盛后，将细胞从细胞培养瓶中消化下来，用细胞计数仪对df
‑
1细胞进行计数后，以适量的细胞包被24孔细胞培养板，置于37℃二氧化碳培养箱中培养。
66.1.2.5柔嫩艾美耳球虫的df
‑
1细胞培养体系建立：将纯化后的子孢子用血球计数板进行计数，定量后用含500u/ml双抗的dmem培养基悬浮子孢子，置37℃孵育1h左右。倒去24孔细胞板中的细胞培养基，更换新的细胞培养基，每孔接入2倍于细胞数的子孢子，置于41℃，5％co2的二氧化碳培养箱中培养，观察子孢子在df
‑
1细胞中的发育情况。
67.(二)体外试验
68.2.1细胞毒性试验是使用cck
‑
8试剂盒检测的，20为石榴提取物0.01mg/ml，鬼针草提取物0.8mg/ml，铁苋菜提取物0.8mg/ml，凤尾草提取物0.1mg/ml，马齿苋提取物0.05mg/ml，艾叶油0.02μl/ml，茶树精油0.1μl/ml，以含5％胎牛血清的dmem培养基配制，往下2倍倍比稀释7个梯度进行的细胞毒性试验，纵坐标为细胞活力，横坐标为加入后24小时收集样品。结果见图1。
69.图1试验结果表明，最大安全浓度为石榴提取物0.005mg/ml，鬼针草提取物0.4mg/ml，铁苋菜提取物0.4mg/ml，凤尾草提取物0.05mg/ml，马齿苋提取物0.025mg/ml，艾叶油0.01μl/ml，茶树精油0.05μl/ml。
70.2.2对子孢子入侵的抑制试验：取生长状态较佳的df
‑
1细胞，用含10％胎牛血清的dmem培养基悬浮后，以每孔10万个细胞剂量铺被24孔板，于37℃，5％co2培养24h后，使用500μl 1
×
pbs清洗细胞培养液，提取物组每孔接入30万子孢子(根据碧云天cfda
‑
se荧光标记试剂盒说明书对子孢子进行荧光标记)以及分别加入500μl最大安全浓度的本发明实施例2及对比例1组溶液的10倍稀释液(5％胎牛血清浓度的dmem培养基配制)，阳性组每孔接入30万子孢子(cfda
‑
se荧光标记)，阴性组加入500μl 5％胎牛血清浓度的dmem，于41℃，5％co2培养12h，去掉细胞培养液，使用500μl 1
×
pbs清洗细胞培养液，再每孔加入100μl 0.25％胰蛋白酶
‑
edta胰酶消化，细胞开始脱落后将胰酶去掉，加入10％胎牛血清的dmem中和胰酶，去掉中和液，加入500μl 1
×
pbs收集df
‑
1细胞，并进行细胞计数，使细胞数量不少于1
×
105个/ml，移入流式细胞仪进样管，使用贝克曼公司的moflo tmxdp高速细胞分选仪检测子孢子入侵df
‑
1细胞的入侵率，利用summit 5.5软件对依次通过的细胞进行分析，区分未入侵的子孢子、正常的df
‑
1细胞和子孢子入侵的df
‑
1细胞，根据公式：子孢子的入侵率＝[入侵细胞数/(未入侵细胞数+入侵细胞数)]
×
100％，计算子孢子的入侵率，提取物组、
阳性组和阴性组均设计3个重复试验，结果见图2(红色方框代表阳性率，即子孢子入侵率)。如图2a(差异性分析)、图2
‑
b1，b2，b3(阴性组三个重复)、图2
‑
c1，c2，c3(阳性组三个重复)、图2
‑
d1，d2，d3(药物组三个重复)，求平均值，子孢子入侵率结果见表1。
[0071]
表1不同组别的子孢子入侵率
[0072]
组别实施例2对比例1阳性组阴性组子孢子的入侵率％17.8822.6446.430
[0073]
结果表明：本发明实施例2组合物的子孢子入侵率显著低于阳性组，由于对比例1组合物中缺少部分天然提取物，虽有一定的抑制作用，但效果不如实施例2组；实施例2组合物中各组份之间协同增效，能够更有效抑制子孢子入侵df
‑
1细胞，抑制效果更优，后续均采用实施例2配方进行动物临床疗效试验。
[0074]
(三)临床疗效试验
[0075]
3.1、试验分组及给药：将11日龄spf鸡随机分成7组，每组20羽供试，每组实验动物进行逐一称重，确保每组平均体重相近，没有显著差异。以最优体外抑制效果的实施例2组合物给药设置为感染前3天给药组、感染后1天给药组，其他组别设置为：抗生素(尼卡巴嗪)组、阳性组(攻毒不给药)、阴性组(不攻毒不给药)、对比例1给药组、对比例2给药组，每日给药剂量5ml，一日1次，连用5日，按照下表2实验方案进行给药及攻毒。
[0076]
表2动物试验分组及实验方案
[0077][0078]
3.2、试验过程：等到感染后第7天，将每组实验动物进行逐一称重，剖杀，观察盲肠病变，收集需要计算抗球虫指数(aci)的相关材料和数据并进行处理和分析，评价各组药物疗效。
[0079]
3.3、试验效果评估：
[0080]
①
相对增重率：接种球虫前和接种球虫7天后(安乐死前)分别对实验动物进行逐一称重，计算平均增重和相对增重率，结果见表3。计算公式如下：
[0081]
平均增重＝试验末平均体重－接种球虫前平均体重
[0082]
相对增重率(％)＝(感染各组鸡平均增重/不感染不给药组鸡平均增重)
×
100％
[0083]
表3各组增重数据
[0084][0085]
试验结果显示，本发明实施例2组合物在感染前3天给药组和感染后1天给药组均能有效提高饲料转化率，提高感染鸡只体重，效果优于抗生素对照组及对比例组。
[0086]
②
卵囊计数与卵囊值换算标准
[0087]
收集感染球虫7天后各组实验动物的粪便，用macmaster’s方法对粪便中的卵囊进行计数：将每份粪便搅匀后分别称取2g，放入装有玻璃珠的小瓶内，加入饱和盐水58ml充分震荡混合，通过粪筛过滤。然后将滤液边摇晃边用移液器吸取少量加入计数室，放于显微镜载物台上，静置几分钟后，用低倍镜将两个计数室内见到的虫卵全部数完，取平均值乘以200，即为每克粪便中的球虫opg。
[0088]
并根据公式计算卵囊比数：卵囊比数＝(不感染不给药组或者感染给药组opg值/阳性组opg值)
×
100％。卵囊值通过卵囊比数结果换算，换算标准详见表4，计算结果见表5。
[0089]
表4卵囊比数与卵囊值的换算标准
[0090][0091]
表5 opg指数及卵囊比数
[0092][0093]
试验结果表明，本发明组合物预防和治疗给药组的卵囊数均显著低于阳性组，效果优于抗生素，说明组合物能有效降低感染鸡只排出球虫卵囊，可抑制球虫的传播。
[0094]
③
盲肠病变计分的判定标准
[0095]
接种球虫后第7天进行鸡只剖检，观察鸡只盲肠病变情况，收取阴性组、阳性组和感染后1天给药组试验动物的盲肠，送去武汉赛维尔生物科技有限公司进行组织切片观察，结果均由武汉赛维尔生物科技有限公司评定。结果见图3、图4。
[0096]
图3b(各组20份样本盲肠溃疡情况)、图3c(阴性组，40
×
)，图3d(阴性组，200
×
)；图3e(阳性组，40
×
)，图3f(阳性组，200
×
)；图3g(药物组，200
×
)，图3h(药物组，200
×
)。
[0097]
其中，图3b盲肠溃疡情况(结缔组织增生及损伤累及粘膜下层情况均归于溃疡进行统计)：++++：阳性组12份，药物组4份，阴性组0份；+++：阳性组1份，药物与3份，阴性组0份；++：阳性组2份，药物组3份，阴性组0份；+：阳性组0份，药物组1份，阴性组0份；无溃疡：阳性组5份，药物组9份，阴性组20份。
[0098]
组织切片结果显示，图3c阴性组未见明显寄生虫，仅能观察到肠腺减少(黑色箭头)，图3d阴性组固有层少量淋巴组织弥散浸润(红色箭头)，可能为收集盲肠时操作所致；图3e、3f阳性组能观察到粘膜层及粘膜下层可见大量虫体，聚集或散在分布(黑色箭头)，粘膜层广泛见上皮丧失，肠腺减少，结缔组织增生(红色箭头)，少量肠腺扩张，腺腔见虫体(黄色箭头)，粘膜层多量淋巴组织浸润(绿色箭头)，少量异嗜性粒细胞浸润(紫色箭头)，较大范围损伤累及粘膜下层，粘膜下层结缔组织增生，间隙增宽，炎性细胞浸润(蓝色箭头)，溃疡形成；粘膜层小范围可见组织坏死，细胞碎裂(橙色箭头)；药物组图3g为组织损伤轻微，图3h为组织损伤较严重，图3g未见明显虫体，粘膜层局部见较多淋巴组织浸润(红色箭头)，图3h能观察到粘膜层肠腺上皮可见虫体(黑色箭头)，固有层及粘膜下层可见较多淋巴组织浸润(黄色箭头)，粘膜层可见几处坏死小灶，嗜酸性增强(绿色箭头)。表明组合物有效减少球虫卵囊在盲肠中的增殖，减轻球虫对盲肠的损伤，保护肠道粘膜完整。
[0099]
观察图4结果显示，药物组的盲肠病变均轻于阳性组，说明药物组能有效减轻球虫对盲肠的广泛损伤，减轻盲肠病变(药物组：图4i、图4j；阳性组：图4k、图4l；阴性组：图4m、图4n)。
[0100]
按johnson方法进行盲肠病变计分，判定标准详见表6，判定结果见表7。
[0101]
表6盲肠病变记分的判定标准
[0102][0103]
表7盲肠病变值
[0104][0105][0106]
试验结果显示，预防和治疗给药组盲肠病变均轻于阳性组、抗生素组及对比例组，说明本发明实施例2组合物能够有效减轻球虫对盲肠的广泛损伤，减轻盲肠病变，而缺少部分原料的对比例组无法实现此有益效果。
[0107]
④
存活率：接种球虫后每天观察各组鸡只存活情况，根据公式统计存活率：存活率(％)＝(组内鸡存活数/组内鸡总数)
×
100％，统计结果见表8。
[0108]
表8存活率
[0109][0110]
试验结果显示，采用本发明实施例2组合物预防和治疗给药组的存活率达到100％，均高于对比例给药组和抗生素组，说明本发明组合物可以有效提高感染球虫鸡只的存活率。
[0111]
⑤
aci(抗球虫)指数
[0112]
aci是存活率、增重、病变、卵囊产量和粪便记分等多项参数综合判定抗球虫效应的指标，本研究采用aci＝(相对增重率+存活率)
‑
(病变分值+卵囊值)，aci≥180为具有高度保护效果；160≤aci≤179，具有中度保护效果；120≤aci＜160，具有低保护效果；aci＜120，不具有保护效果。结果见表9。
[0113]
表9 aci指数
[0114][0115]
试验结果表明，本发明实施例2组合物配方效果最佳，对预防和治疗鸡球虫病都有较好的疗效，使用效果优于抗生素及对比例给药组，实施例2组合物感染前给药及感染后给药组的抗球虫指数均大于160，具有中度保护效果。
[0116]
本发明的上述实施例仅仅是为了清楚地说明本发明技术方案的所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任
何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。