一种甲基丁香酚在制备减轻肾脏缺血再灌注损伤的药物中的应用的制作方法

1.本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种甲基丁香酚在制备减轻肾脏缺血再灌注损伤的药物中的应用。


背景技术：

2.血供中断会导致组织或器官缺血性损伤，及时恢复血流灌注有助于保存组织或器官功能。然而，在一些情况下，组织或器官的血流再灌注能进一步加重损伤，即缺血再灌注损伤(肾脏缺血/再灌注(i/r)损伤是急性肾损伤aki的最常见临床原因之一，主要表现为氧化应激和炎性细胞浸润。肾脏i/r的主要特征是减少了对肾脏组织的动脉血供，血流再灌注造成肾脏组织进一步损伤。近年来，肾脏i/r损伤的发病率和死亡率增加，住院时间延长，给整个社会，尤其是医疗体系造成沉重负担。开发新的治疗策略对于尽可能提高预后至关重要。
3.天然化合物甲基丁香酚(me)是一种与丁香酚结构相似的物质，是一种烯基苯化合物，已在450多种植物中检测到，其中许多被用作食物、精油或药物的来源。me作为中药配方的主要成分，用于组织修复和创面愈合已有十年的历史有报道称，啮齿动物代谢能的主要靶器官和代谢部位是肝脏。但至今，现有技术中尚未有me对减轻肾脏缺血再灌注损伤方面的报道和记载。


技术实现要素：

4.鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种甲基丁香酚在制备减轻肾脏缺血再灌注损伤的药物中的应用。
5.本发明的目的通过如下技术方案得以实现：
6.本发明的目的之一在于，甲基丁香酚在制备减轻肾脏缺血再灌注损伤的药物中的应用。
7.优选的，该药物的给药剂量为不小于3mg/kg/天。
8.本发明的目的之二在于，含有甲基丁香酚的药物组合物在制备减轻肾脏缺血再灌注损伤的药物中的应用。
9.本发明的目的之三在于，一种减轻肾脏缺血再灌注损伤的药物制剂，其包含注射剂、口服制剂、粉针剂、凝胶剂、胶囊剂和贴剂；所述制剂中甲基丁香酚的含量为80％以上。
10.本发明的突出效果为：
11.本发明提供了甲基丁香酚在制备减轻肾脏缺血再灌注损伤的药物中的应用，包括含有甲基丁香酚的药物组合物以及甲基丁香酚的各种药学上可接受的药物制剂，对肾脏缺血再灌注损伤有保护作用，可减轻损伤，本发明对进一步开发与应用具有临床实际意义与价值。
附图说明
12.图1a再灌注24h后，假手术组、iri组、iri+me组血尿素氮(bun)的测定结果图；
13.图1b再灌注24h后，假手术组、iri组、iri+me组血肌酐(cr)的测定结果图；
14.图1c肾组织h&e染色组织图像；
15.图2a为假手术组、iri组、iri+me组肾组织图像；
16.图2b为假手术组、iri组、iri+me组tunel阳性细胞的数量图；
17.图2c为再灌注24h后，假手术组、iri组、iri+me组的cas3、c
‑
cas3和β
‑
actin的水平图；
18.图3为流式细胞仪检测细胞凋亡结果图；
19.图4为dcfh
‑
da荧光探针测量细胞内活性氧ros含量的结果图。
具体实施方式
20.为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对发明的可实施范围的限定。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
21.实施例1
22.1、小鼠肾脏缺血再灌注(i/r)损伤模型建立
23.实验选用雄性c57bl/6j小鼠(6
‑
8周龄，体重20g～22g，北京hfk bioscience)。将小鼠随机分为sham(假手术组)、iri组、iri+me组。小鼠通过腹腔内(ip)注射1％戊巴比妥(80mg/kg体重)麻醉小鼠，使用恒温毯将核心体温保持在32℃，中线开腹后，iri组显微镜下结扎右肾肾蒂并切除右肾，采用显微动脉瘤钳夹闭左肾蒂35min，取下钳夹后双线缝合切口。假手术组切除右肾，不夹闭左肾肾蒂，开腹30min。手术后，小鼠可以随意进食和饮水。再灌注后24小时处死小鼠。收集血浆样品和肾组织用于实验检测。
24.2、实验结果
25.1)本实施例的实验结果见图1a
‑
1c。
26.(a)再灌注24h后，测定sham(假手术组)、iri组、iri+me组血尿素氮(bun)的测定结果，用于检查排尿功能是否正常。
27.(b)再灌注24h后，测定sham(假手术组)、iri组、iri+me组血肌酐(cr)的测定结果，用于衡量肾功能是否正常。
28.(c)肾组织h&e染色200倍，比例尺:50μm。使用铃木评分对肾脏损伤进行量化。
29.与假手术组相比，iri组的bun和cr水平显著升高，而iri+me组的水平相较有明显降低。病理评估显示，与iri+me组相比，iri组肾损伤严重，坏死面积增加，并通过铃木评分进一步量化。me保护肾脏免受缺血再灌注损伤，保护肾脏功能。
30.2)tunel法(脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法)：
31.使用原位细胞死亡检测试剂盒，pod(罗氏，巴塞尔，瑞士)通过tunel测定评估石蜡切片中的细胞凋亡。福尔马林固定和石蜡包埋的肾组织切片通过在二甲苯中洗涤脱蜡，并通过一系列渐进的乙醇和蒸馏水再水化。按照出产说明，使用tunel技术对蛋白酶k透化的切片进行dna链断裂的酶促原位标记。使用olympus bx
‑
51光学显微镜评估细胞凋亡，从每
个切片随机选择的视野中捕获6张图像(图2a)，并计算tunel阳性细胞的数量(图2b)。如图2a
‑
2c所示，与假手术组相比，iri组的tunel阳性细胞数量显著增加；而经me处理后，tunel阳性细胞数减少。此外，ir增加了肾组织中凋亡蛋白cas3、c
‑
cas3和β
‑
actin的的表达，经me处理后，这一结果显著逆转(图2c)。由此可以证实me缓解了iri引起的细胞凋亡。
32.3)抑制i/r损伤后hk
‑
2细胞的凋亡
33.利用磷脂结合蛋白
ⅴ
(annexin
ⅴ
)和碘化丙啶(pi)双重染色，流式细胞仪检测细胞凋亡，如图3所示，结果表明，和nc组相比，i/r模型组hk
‑
2凋亡细胞明显增多；ir+me组可显著降低hk
‑
2细胞凋亡，且呈剂量依赖性，表明me预处理可改善hk
‑
2细胞i/r损伤，抑制hk
‑
2细胞凋亡。
34.4)抑制i/r损伤后hk
‑
2细胞内ros的产生
35.利用dcfh
‑
da荧光探针检测细胞内的ros水平，如图4所示，结果显示，i/r模型组荧光强度明显高于nc组；ir+me组ros平均荧光强度显著低于i/r模型组，表明me可抑制i/r损伤后细胞内ros的产生。
36.5)本实施例中，对于肾脏缺血再灌注损伤模型使用大剂量甲基丁香酚进行急性保护实验。对肾脏缺血再灌注损伤模型使用20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg的甲基丁香酚进行灌胃，12h后，中性粒细胞浸润受到明显抑制，在24h后，中性粒细胞浸润保持较好的抑制效果，同时，在80mg/kg的给药剂量下，未发现模型组存在中毒的异常表现，说明，在大剂量给药的情况下，能够明显减轻iri期间肾脏的炎症反应，缓解了iri引起的细胞凋亡，在长时间未给药的情况下，仍旧能够保持效果，说明本说明书的甲基丁香酚能够作为治疗肾脏缺血再灌注损伤的急救用药，且毒性很低。
37.综上所述，本发明的甲基丁香酚在肾脏缺血再灌注损伤模型中，me能保护肾脏免受缺血再灌注损伤，减轻iri期间肾脏的炎症反应，缓解了iri引起的细胞凋亡，因此me可以用于缓解肾脏缺血再灌注损伤。
38.实施例2
39.本实施例提供一种含有甲基丁香酚的药物组合物，用于减轻肾脏缺血再灌注损伤。所述药物组合物还可以制成能够接受的药物制剂，其包含注射剂、口服制剂、粉针剂、凝胶剂、胶囊剂和贴剂；所述药物制剂中甲基丁香酚的含量为80％以上。