一种鸡屎藤酚类物质的提取方法及其应用

1.本发明涉及鸡屎藤提取技术领域，尤其涉及一种鸡屎藤酚类物质的 提取方法及其应用。


背景技术：

2.本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理 解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一 般技术人员所公知的现有技术。
3.鸡屎藤为茜草科鸡屎藤属植物，主要生长在中国南方、越南、日本 和印度，已被用作治疗消化不良、黄疸、疼痛和痢疾的中药，也长期被 用于许多地方性传统食品的制作。现代药理实验已在鸡屎藤中鉴定出环 烯醚萜苷、挥发油、酚酸、黄酮类化合物等植物化学成分，这些化合物 可能是鸡屎藤药理活性的主要来源。其中环烯醚萜苷类化合物的结构和 药理活性研究较多，其他化合物的研究较少。植物多酚物质具有天然的 抗氧化活性，对于防止食品氧化和促进人体健康有着重要的作用，是鸡 屎藤中主要活性成分之一。
4.目前，主要采用微波辅助提取或传统有机溶剂浸提鸡屎藤中的多酚 物质，然而，这类方法存在许多固有的缺点，例如：有机溶剂具有强挥 发性、高毒性、不易被生物降解、易燃等弊端；浸提的提取效率低，提 取得到的物质含量低、种类少。


技术实现要素：

5.针对上述的问题，本发明进一步研究发现：这是由于常规提取溶剂本 身理化性质存在弊端以及提取方法对鸡屎藤茎、叶细胞壁的破坏程度不足 等原因导致的，在此基础上，本发明提出一种能够有效克服上述问题的鸡 屎藤酚类物质的提取方法，该方法能够从鸡屎藤中提取到更高的酚类物质 含量，而且还增强了提取物的抗氧化活性，且这种方法相对于传统的方法 更加绿色环保。
6.具体地，为实现上述目的，本发明的技术方案如下所示：
7.在本发明的第一方面，公开一种鸡屎藤酚类物质的提取方法，包括步 骤：
8.(1)将鸡屎藤粉与深度共熔溶液混合后进行超声处理，得粗提取液；
9.(2)去除所述粗提取液中固体物质，取清液，得含酚类物质的提取液。
10.进一步地，步骤(1)中，所述深度共熔溶液是由深度共熔溶剂溶于水 形成溶液，所述深度共熔溶液的质量浓度为50～80％，优选地，所述深度共 熔溶液的质量浓度为50.8％，即含水量为49.2％。
11.进一步地，所述深度共熔溶剂包括氢受体和氢供体。优选地，所述深 度共熔溶剂包括：氯化胆碱和乙二醇的组合、氯化胆碱和三甘醇的组合、 氯化胆碱和甘油的组合、l
‑
脯氨酸和乙二醇等的组合中的任意一种。
12.更优选地，所述深度共熔溶剂为氯化胆碱和乙二醇的组合。实验表明， 这种深度共熔溶剂对鸡屎藤酚类物质的提取效果更佳，这是由于dess具有 较高的氢键碱度，它对细
胞壁具有高效的溶解作用，使得其与纤维素链之 间产生更高效的分子间相互作用。另外，氯化胆碱和乙二醇组成的深度共 熔溶剂的极性与鸡屎藤酚类化合物的极性更为接近，更有利于酚类物质的 提取。
13.进一步地，所述深度共熔溶剂的各组合中，前一组分(即氢键受体) 与后一组分(即氢键供体)的摩尔比为1:2～4。试验证明，保持在该范围内 时具有更好的提取效果。
14.进一步地，将所述氢受体和氢供体按比例混合后进行水浴加热(优选 为80℃加热)并不断搅拌，直至形成具有一定粘性的均一透明液体，冷却 至室温，加水混匀，得深度共熔溶液。
15.进一步地，步骤(1)中，所述鸡屎藤粉与深度共熔溶液的质量体积比 为1:10～40(g/ml)，优选为1:20(g/ml)，试验证明，该比例下具有更 佳的提取效果。
16.进一步地，步骤(1)中，所述超声处理的功率为240～360w，时间为 10～40min，温度为30～60℃，优选地，超声处理的功率为300.6w，时间为 9.7min，温度为40℃。通过超声辅助提取，可以有效提高提取效果，这是 因为超声辅助提取不仅可以降低溶剂和能量的消耗，而且可以通过声空化 作用破坏植物细胞壁的结构，从而增加生物活性物质的释放量，而且有助 于提高酚类物质的抗氧化活性。
17.进一步地，步骤(1)中，所述鸡屎藤粉是鸡屎藤茎、叶的粉末。
18.进一步地，步骤(2)中，将所述粗提取液经过离心或过滤，然后取清 液，即得含酚类物质的提取液。
19.在本发明的第二方面，公开所述鸡屎藤酚类物质的提取方法提取的含 酚类物质的提取液在调节免疫功能药物、预防慢性疾病药物、抗氧化活性 药物等的制备中的应用。
20.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
21.(1)本发明采用深度共熔溶剂耦合超声辅助提取工艺提取鸡屎藤中的 酚类化合物的方法，比常规提取方法得到更高的酚类物质含量，而且所获 得的酚类物质具有更高的抗氧化活性，且这种工艺相对于传统的工艺更加 绿色环保。
22.(2)本发明首次发现并验证了以氯化胆碱作为氢受体，乙二醇作为氢 供体制得的深度共熔溶液在提取鸡屎藤酚类物质上的高效性与环保性。本 发明的工艺提取得到了此前未报道的成分：原儿茶醛、迷迭香酸、反式肉 桂酸，共3种酚酸类物质，以及儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、杨梅 苷(五羟基黄酮
‑3‑
鼠李糖苷)、金丝桃苷、槲皮素
‑3‑
o
‑
β
‑
d
‑
吡喃半乳糖苷、 番石榴苷、异鼠李素
‑3‑
o
‑
葡萄糖苷、水仙苷、芹菜素、金合欢素、香叶木 素、木犀草苷、芹菜素
‑7‑
o
‑
葡萄糖甙，共14种黄酮类物质；从而实现了对 鸡屎藤的成分更加全面、准确的检测。
具体实施方式
23.在接下来的描述中进一步阐述了本发明的具体细节用于充分理解本发 明。本发明中的说明书所使用的术语只是为了用于说明本发明的优点和特 点，不是旨在于限制本发明。
24.除非另行定义，本发明中所使用的所有专业与科学术语属于本发明 的技术领域的技术人员所理解的含义相同。如无特殊说明，本发明所使 用的药品或试剂均按照产品说明书使用或采用所属领域的常规使用方 法。现根据具体实施方式对本发明的技术方案作
进一步说明。
25.第一实施例
26.一种鸡屎藤酚类物质的提取方法，包括步骤：
27.(1)深度共熔溶液的制备：将不同的氢键受体和氢键供体按比例混合 后在80℃水浴中加热并不断搅拌，直至形成具有一定粘度的均一透明液体， 冷却至室温(约25℃)，加水混匀，得到含水量均为40％(质量浓度)的不 同组分的深度共熔溶液(dess)，具体如表1所示。
28.(2)将0.5g鸡屎藤粉末与5ml步骤(1)制备的dess混合，将得 到的混合物在40℃下用320w的超声功率提取30min，然后将得到的粗提 取液在离心机中以13000rpm的速率离心10min，取上清液，即得鸡屎藤 提取液。
29.(3)利用硝酸铝
‑
亚硝酸钠比色法测定鸡屎藤提取液中总黄酮含量。
30.表1不同dess的组成及其鸡屎藤提取液的总黄酮含量
[0031][0032]
(表1中数据为平均值
±
标准偏差(n＝3)。最后一列中不同小写字母表示有显著差异(p<0.05))。
[0033]
表1显示了采用不同的dess提取获得的鸡屎藤提取液中总黄酮含量。 可以看出，由氯化胆碱与乙二醇合成的des提取的鸡屎藤提取液中总黄酮 含量(19.43
±
0.53mg ce/g dw)最高。与总黄酮含量最低两组分柠檬酸
‑ꢀ
甘油(3.63
±
0.34mg ce/g dw)和氯化胆碱
‑
苹果酸(4.85
±
0.29mg ce/g dw) 相比，氯化胆碱
‑
乙二醇提取得到总黄酮含量提高4～6倍。此外，氯化胆碱
‑ꢀ
木糖醇、氯化胆碱
‑
乙酰丙酸和氯化胆碱
‑
葡萄糖三组总黄酮含量之间无显著 差异(p>0.05)。氯化胆碱
‑
苹果酸与脯氨酸
‑
乙酰丙酸两组总黄酮含量也无 显著差异(p>0.05)，但均显著低于氯化胆碱
‑
乙二醇组总黄酮含量。因此， 用氯化胆碱与乙二醇合成的des为最佳深度共熔溶剂。
[0034]
第二实施例
[0035]
以第一实施例中chcl
‑
eg为深度共熔溶剂(即摩尔比为1:2的氯化胆碱 和乙二醇)，将其制备成含水量为40％(质量浓度)的深度共熔溶液，然后 采用步骤(2)的方法获得鸡屎藤提取液。
[0036]
进一步地，在步骤(2)中，由minitab 17软件生成的采用2
k
因子实 验设计构建的设计矩阵，综合考察了5个因素，包括des的含水量(a)、 深度共熔溶液与鸡屎藤粉的质量体积比(b)、超声功率(c)、超声时间(d)、 超声温度(e)及其交互作用对鸡屎藤提取物总黄酮含量的影响。以总黄酮 含量作为因变量，选择对鸡屎藤的总黄酮含量有显著影响的关键因素进行 进一步的响应面分析。实验完成后采用第一实施例步骤(3)的方法对各实 验组获得的鸡屎藤提取液中的总黄酮含量进行测定。结果如表2所示，可 以看出，第8至13组取得了更好的提取效果，尤其是第九组的提取效果远 优于其他实验组。
[0037]
表2 2
k
因子实验设计与提取的鸡屎藤提取液中总黄酮含量结果
[0038][0039]
(表2中数据为平均值
±
标准偏差(n＝3)。ce：儿茶素当量；dw：干重)。
[0040]
第三实施例
[0041]
将0.5g鸡屎藤粉与10ml第一实施例中提取效果最佳的des(摩尔比 为1:2的氯化胆碱和乙二醇，chcl
‑
eg)制成的深度共熔溶液混合，在优 选超声条件下(des中的含水量49.2％，超声功率300.6w，超声时间9.7 min，超声温度40℃)下，采用第一实施例步骤(2)的方法获得鸡屎藤提 取液，记为des
‑
uae。
[0042]
利用硝酸铝
‑
亚硝酸钠比色法测定得到的鸡屎藤提取液中总黄酮含量， 并进一步采用超高效液相色谱
‑
xevo triple quadrupole质谱联用仪对对酚类 物质进行鉴定和定量，具体条件如下：acquity uhpl cbeh
‑
c18色谱柱(2.1 i.d.
×
100mm，1.7μm，waters，usa)，以0.25％乙酸水溶液(a)、0.25％ 乙酸甲醇溶液(b)为流动相，洗脱程序如下：0
‑
3min，5％b；10min，25％b； 16min，50％b；20min，70％b；26
‑
30min，100％b；31
‑
36min，5％b，检 测波长280nm。物质组成采用多反应监测(mrm)进行鉴定，获得基本结 构信息后购买相关标准品，通过与各标准品的标定曲线比较进行定量，定 量结果以每微克(μg)鸡屎藤干粉(μg/g dw)表示。
[0043]
第四实施例
[0044]
将0.5g鸡屎藤粉分别与10ml超纯水、80％乙醇、70％甲醇混合，在优 选超声条件下(des中的含水量49.2％，超声功率300.6w，超声时间9.7 min，超声温度40℃)下，采用第一实施例步骤(2)的方法获得鸡屎藤提 取液，且由本实施例所述超纯水、80％乙醇、70％甲醇作为溶剂得到的鸡屎 藤提取液分别记为w
‑
uae、etoh
‑
uae、metoh
‑
uae。
[0045]
利用硝酸铝
‑
亚硝酸钠比色法测定得到的鸡屎藤提取液中总黄酮含量， 并进一步采用超高效液相色谱
‑
xevo triple quadrupole质谱联用仪对对酚类 物质进行鉴定和定量，具体条件如下：acquity uhpl cbeh
‑
c18色谱柱(2.1 i.d.
×
100mm，1.7μm，waters，usa)，以0.25％乙酸水溶液(a)、0.25％乙 酸甲醇溶液(b)为流动相，洗脱程序如下：0
‑
3min，5％b；10min，25％b； 16min，50％b；20min，70％b；26
‑
30min，100％b；31
‑
36min，5％b，检 测波长280nm。物质组成采用多反应监测(mrm)进行鉴定，获得基本结 构信息后购买相关标准品，通过与各标准品的标定曲线比较进行定量，定 量结果以每微克(μg)鸡屎藤干粉(μg/g dw)表示。
[0046]
第五实施例
[0047]
将0.5g鸡屎藤粉分别与10ml超纯水、80％乙醇、70％甲醇混合后在 4℃下均质5min，作为一次提取操作，然后将得到的粗提取液在离心机中 以13000rpm的速率离心10min，取上清液，即得鸡屎藤提取液，且由本 实施例所述超纯水、80％乙醇、70％甲醇作为溶剂得到的鸡屎藤提取液分别 记为w
‑
hae、etoh
‑
hae、metoh
‑
hae。
[0048]
利用硝酸铝
‑
亚硝酸钠比色法测定得到的鸡屎藤提取液中总黄酮含量， 并进一步采用超高效液相色谱
‑
xevo triple quadrupole质谱联用仪对对酚类 物质进行鉴定和定量，具体条件如下：acquity uhpl cbeh
‑
c18色谱柱(2.1 i.d.
×
100mm，1.7μm，waters，usa)，以0.25％乙酸水溶液(a)、0.25％ 乙酸甲醇溶液(b)为流动相，洗脱程序如下：0
‑
3min，5％b；10min，25％b； 16min，50％b；20min，70％b；26
‑
30min，100％b；31
‑
36min，5％b，检 测波长280nm。物质组成采用多反应监测(mrm)进行鉴定，获得基本结 构信息后购买相关标准品，通过与各标准品的标定曲线比较进行定量，定 量结果以每微克(μg)鸡屎藤干粉(μg/g dw)表示。
[0049]
提取效果检测
[0050]
(1)利用硝酸铝
‑
亚硝酸钠比色法，测定第三实施例、第四实施例、第 五实施例中得到的七种鸡屎藤提取液中总黄酮含量，结果如表3所示。可 以看出，第三实施例中des
‑
uae的总黄酮含量高达27.09
±
0.48mg ce/gdw。与w
‑
uae、etoh
‑
uae、metoh
‑
uae相比，本发明提出的方法对鸡 屎藤中总黄酮的提取效果达到了常规提取方法的1.5～2倍。这表明了本发明 提出的提取方法的高效性。此外，从第四实施例和第五实施例的测试结果 可以看出，在提取溶剂相同的条件下，与均质辅助提取相比，超声辅助提 取可以得到更高的总黄酮含量。水作为提取溶剂时，超声辅助提取比均质 辅助提取的总黄酮含量高出6个百分点；80％乙醇作为提取溶剂时，超声辅 助提取比均质辅助提取的总黄酮含量高出21个百分点，
表明超声辅助提取 的效果优于均质辅助提取。
[0051]
(2)采用超高效液相色谱
‑
xevo triple quadrupole质谱联用系统对第三 实施例、第四实施例、第五实施例中得到的七种鸡屎藤提取液中的酚物质 进行鉴定(表4)。结果显示：从des
‑
uae中鉴定出36种酚类物质，包括： 5种苯甲酸、5种羟基肉桂酸、15种黄酮醇、4种黄酮、1种异黄酮、3种 黄烷酮、1种原花青素、1种花青素和1种二苯乙烯。des
‑
uae中除没食 子酸乙酯、(
‑
)
‑
表没食子儿茶素、染料木素、橙皮苷、异牡荆素、反式没食 子酸外，其余酚类化合物均可检测到。而w
‑
uae、etoh
‑
uae、metoh
‑
uae、 w
‑
hae、etoh
‑
hae和metoh
‑
hae只能鉴定出21～30种酚类化合物。从 metoh
‑
uae中得到的酚类化合物有30种，其次为etoh
‑
uae、etoh
‑
hae、 metoh
‑
hae、w
‑
uae、w
‑
hae。w
‑
hae仅提取出21种酚类化合物。 des
‑
uae的黄酮类和酚酸类化合物含量总和最高，为905.62
±
25.85e，是 w
‑
uae的1.13～1.16倍(p<0.05)。其中w
‑
hae的黄酮类和酚酸类化合物 含量总和最低，为des
‑
uae的65.09～67.63％(p<0.05)。可以看出，与常 规提取方法相比，本发明提出的深度共熔溶剂耦合超声辅助提取能使鸡屎 藤释放出更多的酚类化合物，包括迷迭香酸、没食子儿茶素、芦丁、番石 榴苷、水仙苷、金合欢素、芹菜素
‑7‑
o
‑
葡萄糖甙。这是因为：超声辅助提 取不仅降低了溶剂和能量的消耗，而且可以通过声空化作用破坏植物细胞 壁的结构，从而增加生物活性物质的释放量；而深度共熔溶剂具有较高的 氢键碱度，它对细胞壁具有有效的溶解作用，使得其与纤维素链之间产生 更高效的分子间相互作用，而氯化胆碱和乙二醇组成的深度共熔溶剂的极 性与鸡屎藤中一些酚类化合物的极性更为接近，更有利于这些酚类物质在 提取过程中与溶剂相溶，从而提升了提取效果。另外，鸡屎藤提取液中丰 富的黄酮类物质具有软化血管、降低其通透性等作用，可以有效预防心脑 血管病等慢性疾病。
[0052]
(3)提取物具备更高的抗氧化活性：对第三实施例、第四实施例、第 五实施例中得到的七种鸡屎藤提取液的抗氧化活性(frap和abts
+
)相 关性分析进行测试，结果见表3。可以看出：与w
‑
uae、etoh
‑
uae、 metoh
‑
uae相比，des
‑
uae鸡屎藤提取液的frap、abts
+
分别为其他几 种鸡屎藤提取液的1.37～1.8倍、1.06～1.3倍；由此表明，本发明提出的深度 共熔溶剂耦合超声辅助提取的鸡屎藤提取液中的酚类物质具有更高的抗氧 化活性，从而有助于通过降低细胞过氧化物含量或通过清除免疫反应途径 中生成的过量自由基来调节机体免疫。
[0053]
表3第三至第五实施例中鸡屎藤提取物中总黄酮含量及抗氧化活性结果
[0054]
[0055][0056]
(表3中数据为平均值
±
标准偏差(n＝3)。每列中不同小写字母表示有显著差异(p<0.05，其中： ce：儿茶素当量；fe(ⅱ)e：硫酸亚铁当量；te：trolox当量。des
‑
uae：深度共熔溶剂耦合超声 辅助提取物；w
‑
uae：超声辅助水提取物；w
‑
hae：均质辅助水提取物；etoh
‑
uae：超声辅助80％ 乙醇提取物；etoh
‑
hae：均质辅助80％乙醇提取物；metoh
‑
uae：超声辅助70％甲醇提取物； metoh
‑
hae：均质辅助70％甲醇提取物)。
[0057]
表4uhplc
‑
ms测定鸡屎藤中的酚类成分的含量
[0058]
[0059][0060]
(表4中，同一列不同小写字母(a
‑
g)表示差异显著(p<0.05)。nd,未发现：des
‑
uae：深度共熔溶剂 耦合超声辅助提取物；w
‑
uae：超声辅助水提取物；w
‑
hae：均质辅助水提取物；etoh
‑
uae：超 声辅助80％乙醇提取物；etoh
‑
hae：均质辅助80％乙醇提取物；metoh
‑
uae：超声辅助70％甲 醇提取物；metoh
‑
hae：均质辅助70％甲醇提取物。)
[0061]
以上所述仅说明了本发明的几个实施方式，并不能因此而理解是对本 发明专利范围的限制。应当指出，对于本领域的其他人员来说，在不脱离 本发明的构思和范围的情况下，还可进行修改替换改进等，这些都属于本 发明的保护范围。因此，本发明的专利保护范围应以所描述的根据权利要 求为准。