一种纳米药物制剂及其制备方法和应用

1.本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种纳米药物制剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.神经退行性疾病是困扰现代社会中老年人群的重大脑疾病，帕金森病(parkinson’s disease，pd)是第二大神经退行性疾病，主要病理变化为黑质多巴胺能神经元丢失，多巴胺递质含量减少。
3.研究表明，大部分神经退行性疾病的发生都伴随着错误折叠蛋白形成的聚集体在神经细胞中的异常积累，从而对神经元产生毒性作用。α
‑
突触核蛋白(α
‑
synuclein)是帕金森病的发病机制中最重要的蛋白，α
‑
synuclein的错误折叠与聚集形成淀粉样纤维是帕金森病的主要病理进程，α
‑
突触核蛋白聚集与路易小体的形成及多巴胺能神经元的死亡密切相关。至今尚无成熟有效的药物或方法能阻止或逆转pd病情的发展。开发新型的能够防治pd及具有神经保护作用的药物尤其是天然提取物将对保护人类健康具有重要的现实社会意义和应用经济价值。
4.细胞自噬(autophagy)是近年来提出的与帕金森病发病密切相关的分子机制，自噬诱导剂作为神经保护类药物广泛应用于抗帕金森病药物研发。自噬可以清除错误折叠的蛋白质，减少蛋白质在神经元内聚集，能够有效预防帕金森病等神经退行性病变的发生。beclin1作为自噬调节因子提供相互作用的平台，因此它在自噬调控中扮演着独特而重要的角色，是调控信号汇聚的关键点。研究表明，通过药物激活细胞自噬可以降低胞内致病性α
‑
突触核蛋白(α
‑
synuclein)蛋白聚集体的水平，从而有效缓解这些蛋白聚集体对神经细胞的毒性。同时也有研究表明，氧化应激、线粒体功能障碍和自噬缺陷在pd形成过程中起重要作用。在pink1和parkin基因突变的pd患者中，线粒体中出现自噬缺陷，从而引起氧化应激以及线粒体供应能量障碍，进而致使多巴胺能神经元坏死引起pd。在pd动物模型中α
‑
synuclein折叠错误导致黑质多巴胺能神经元的线粒体水肿，从而引起da神经细胞凋亡。
5.目前公开报道了多种自噬促进剂，但这些药物由于其物理化学性质，口服利用率较低，体内清除与代谢速率较高，生物利用度有限并不能在神经元中诱导高度自噬，起不到很好的治疗效果。目前在神经退行性疾病中，纳米药物联合协同治疗方案正逐渐替代单一药物方案，其可以增加穿过bbb效率提高疗效的同时减少副作用。因此，本发明开发一种积极的治疗策略和安全和有效的药物组合递送系统以克服这些临床限制。


技术实现要素：

6.为了解决现有技术的问题，本发明提供一种纳米药物制剂及其制备方法和应用，通过协同迷迭香酸和尼洛替尼清除ros减少炎症反应，减少神经退行性疾病的病理进程中对于多巴胺能神经元的毒性，为pd靶向治疗提供新的思路。
7.第一方面，本发明提供一种组合物，包括：迷迭香酸和尼洛替尼；
8.所述迷迭香酸的化学式如式i所示：
[0009][0010]
和/或，所述尼洛替尼的化学式如式ii所示：
[0011][0012]
进一步地，所述迷迭香酸和所述尼洛替尼的质量比为1:0.1～2。
[0013]
进一步地，所述迷迭香酸和所述尼洛替尼的质量比为1:1～2。
[0014]
第二方面，本发明提供一种纳米药物制剂，所述纳米药物制剂的活性成分包括所述组合物。
[0015]
进一步地，所述纳米药物制剂中使用的纳米粒子为plga
‑
peg2000
‑
ang2、dspe
‑
peg2000
‑
ang2或mpeg
‑
pla中的一种或多种。
[0016]
进一步地，所述纳米药物制剂还包括药学上可接受的辅料；所述药学上可接受的辅料优选为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂或填充剂中的任意一种或多种。
[0017]
例如可采用水或生理盐水作为稀释剂，可采用聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物作为载体，可采用明胶或纤维素衍生物作为粘合剂。
[0018]
第三方面，本发明提供所述纳米药物制剂的制备方法，包括：
[0019]
通过纳米乳共沉淀法使得纳米粒子负载所述组合物。
[0020]
进一步地，所述制备方法包括如下步骤：
[0021]
将组合物和纳米粒子置于溶剂中得到纳米材料溶液，添加去离子水后混匀2～8h；
[0022]
通过沉淀法制备成纳米颗粒悬乳液；
[0023]
纯化后冷冻干燥。
[0024]
进一步地，所述溶剂为有机溶剂，例如二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙腈或二甲基亚砜；优选为二氯甲烷；
[0025]
进一步地，所述纳米颗粒悬乳液粒径为20～200nm。
[0026]
进一步地，所述纳米材料溶液和所述去离子水的体积比为1：10～50。
[0027]
作为一种优选的实施方式，本发明提供所述纳米药物制剂的制备方法，包括：
[0028]
(1)将plga
‑
peg2000
‑
ang2聚合物和nilotinib溶于dmso中作为有机相，将ra溶于
水后作为水相，一边搅拌，一边将有机相滴缓慢滴加到水相中，搅拌至有机溶剂完成挥发；
[0029]
所述plga
‑
peg2000
‑
ang2聚合物和所述nilotinib的质量比为10:1～20；
[0030]
所述nilotinib和所述ra的质量比为1:1～5；
[0031]
(2)在24000～28000rpm，2～6℃下离心15～30 min，洗去未负载的药物，100k超滤管离心纯化获得形成的纳米颗粒。
[0032]
本发明进一步提供所述组合物，或所述纳米药物制剂在制备用于预防或治疗疾病的药物中的应用；
[0033]
所述疾病为阿尔茨海默病或帕金森病。
[0034]
本发明进一步提供所述组合物，或所述纳米药物制剂在促进自噬体形成中的应用。
[0035]
本发明进一步提供所述组合物，或所述纳米药物制剂在制备促进自噬体形成的药物中的应用。
[0036]
本发明进一步提供所述组合物，或所述纳米药物制剂在制备抗氧化应激药物中的应用。
[0037]
本发明进一步提供所述组合物，或所述纳米药物制剂在制备降低α
‑
synuclein的表达水平的药物中的应用。
[0038]
本发明具备如下有益效果：
[0039]
本发明提供一种同时包含迷迭香酸和尼洛替尼的纳米药物制剂，通过协同这两种成分，可以有效减缓帕金森小鼠运动能力障碍及改善步态异常，并通过诱导脑组织细胞自噬水平升高，起到保护神经细胞的作用。
[0040]
本发明提供的纳米药物制剂在用于动物模型上时可以改善动物的运动能力和保护黑质th神经元的活性，其机制可能是通过激活大脑黑质致密部神经元细胞的自噬活性和降低氧化应激水平来协同促进α
‑
synuclein蛋白的降解，从而减少神经元细胞的损伤，实现pd症状的有效缓解。
[0041]
本发明提供的纳米药物制剂在angiopep2多肽的协助下可以高效的透过血脑屏障，药物用量显著减少，从而毒副作用也相应降低。
[0042]
本发明提供的纳米药物制剂调控自噬对帕金森病进行干预，实现了脑部疾病药物递送的高效、低毒的联合给药，高病灶富集，可控释药和可视化递送，为pd靶向治疗提供前瞻性方案。
附图说明
[0043]
图1为本发明实施例1提供的p@rnp纳米药物的tem和dls表征示意图；其中左为tem表征示意图，右为dls表征示意图。
[0044]
图2为本发明实施例2提供的p@rnp纳米药物中迷迭香酸和尼罗替尼的体外释放图。
[0045]
图3为本发明实施例3提供的p@rnp纳米药物对sh
‑
sy5y细胞中ros水平的清除能力成像示意图。
[0046]
图4为本发明实施例4提供的p@rnp治疗后帕金森模型小鼠旷场行为图；其中a为小鼠运动轨迹图，b为旷场试验中小鼠移动总距离的统计结果，c为转棒实验中停留在转棒上
时间的统计结果。
[0047]
图5为本发明实施例4提供的p@rnp治疗后帕金森模型小鼠步态行为图；其中a为运动速度，b为回转速度，c为三爪支撑，d为四爪支撑。
[0048]
图6为本发明实施例5提供的p@rnp治疗后pd鼠脑部黑质组织中自噬相关蛋白的表达示意图。
[0049]
图7为本发明实施例6提供的p@rnp治疗后pd鼠脑组织中的th，iba
‑
1，neun和gfap免疫荧光分析结果示意图。
具体实施方式
[0050]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0051]
以下实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规方法。
[0052]
以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过市售购得。
[0053]
以下实施例中所用试剂和仪器设备购买厂家如下：
[0054][0055][0056]
实施例1
[0057]
本实施例提供plga负载迷迭香酸
‑
尼洛替尼纳米药物p@rnp的制备方法，并对其进
行表征，具体包括如下流程：
[0058]
1、angiopep2(ang2)多肽的设计合成与鉴定
[0059]
采用fmoc多肽固相合成法，合成ang2多肽tffyggsrgkrnn fkteeyc。氨基酸的α
‑
氨基保护基团fmoc在碱性条件下使用脱保护试剂(六氢吡啶/dmf，20％，v/v)可以迅速脱除，并同经n
‑
甲基吗啡啉(nmm/dmf，4％，v/v)活化的过量的氨基酸在活化试剂hbt u催化条件下反应来延长肽链。最终，将树脂在裂解液(92.5％tfa:2.5％h2o:2.5％tis:2.5％)中裂解。经hplc和esi
‑
ms质谱分析鉴定ang2多肽的纯度和分子量。
[0060]
2、p@rnp纳米药物的制备与表征
[0061]
功能两亲性分子plga
‑
peg2000
‑
ang2合成。具体步骤：以摩尔比1:2称取ang2和plga
‑
peg2000
‑
mal，分别溶于水溶液中混合，室温下温和搅拌48小时。反应产物plga
‑
peg2000
‑
ang2经截留分子量为3500da的透析袋透析纯化，冷冻干燥得干粉样品。
[0062]
本发明通过纳米乳共沉淀法制备nilotinib和ra负载plga多功能纳米颗粒plga@nilotinib/ra(简称p@rnp)具体包括如下流程：
[0063]
(1)将100mg的plga
‑
peg2000
‑
ang2聚合物和溶于5ml的二氯甲烷和10mg的nilotinib溶于dmso中。20mg的ra溶于水后6ml的pva(2％w/v)水溶液作为水相，在磁力搅拌下，有机相滴缓慢滴加到水相中，搅拌过夜挥发完有机溶剂。
[0064]
(2)第二天，在24000rpm，4℃下离心20min，用双蒸馏水洗涤以去除未负载的药物，100k超滤管离心纯化获得形成的纳米颗粒备用。
[0065]
(3)用与步骤(1)和(2)同样的方法制备只负载一种药物的plga@nilotinib(简称p@n)和plga@ra的(p@r)作为对照。取p@rnp(1mg/ml)置于样品池中通过动态光散射(dynamic light scattering,dls)测试粒径大小。
[0066]
(4)实验数据通过软件zetasizer software处理。p@rnp的形貌通过透射电镜表征，具体包括如下流程：
[0067]
取p@rnp(1mg/ml)2μl滴于普通碳膜支持的铜网上，2分钟后滤纸吸走多余的样品，之后滴加1μl的1％醋酸铀负染5分钟后滤纸吸走多余的液体，干燥后在120kv电压下用透射电镜观察纳米颗粒形貌。
[0068]
结果如图1所示，由图1可以看出动态光散射(dls)和透射电子显微镜观察p@rnp的形态为均匀的纳米胶束颗粒，约75nm与dls结果相对应，该尺寸的纳米颗粒具有高效的组织和细胞渗透能力。将药物纳米化可通过持续释放药物来减少或避免不良反应。
[0069]
本实施例进一步尝试了改变原料nilotinib的用量为1mg，ra用量为10mg以及nilotinib的用量为10mg，ra用量为10mg后进行相同的实验，得到的纳米颗粒显示出和图1类似的结构。
[0070]
实施例2
[0071]
本实施例对实施例1制备得到的p@rnp纳米颗粒进行体外药物释放研究，具体流程如下：
[0072]
将p@rnp纳米颗粒溶液(1mg/ml，2ml)置于透析袋中，放在含透析液(ph 7.4含10％血清的pbs，50ml)的烧杯中。
[0073]
释放装置置于水平振荡器中，在37℃条件下持续温和震荡。在不同时间点(0，1，2，6，8，12，24，36，48小时)，取透析液中的溶液0.1ml于96孔板，通过高效液相检测方法测定迷
迭香酸和尼洛替尼含量(迷迭香酸检测波长330nm；尼洛替尼检测波长240nm)。
[0074]
高效液相色谱法的检测条件如下：c18柱，流动相为甲醇
‑
1％甲酸水(60:40，v/v)(38:62)，流速为1.0ml/min，柱温25℃，在ph7.4时的环境下通过透析方法评价释放药物的速率。
[0075]
结果如图2所示，p@rnp在ph7.4的时候，0
‑
48小时内具有很高的药物可控释放能力，没有显示初始爆发性药物释放，而是缓慢地释放，避免在体内被快速清除，提高药物的利用度，可降低药物毒性。
[0076]
实施例3
[0077]
本实施例检测实施例1制备得到的p@rnp纳米颗粒对于细胞内ros水平的影响，具体流程如下：
[0078]
将sh
‑
sy5y细胞接种在10mm玻底培养皿中，待细胞长到60％左右时，使用10mm的1
‑
甲基
‑4‑
苯基吡啶离子(mpp+)预处理细胞12h，再用p@rnp纳米颗粒处理细胞24h。
[0079]
然后用pbs洗细胞三次，加入含有10μm dcfh
‑
da探针的培养基放入培养箱孵育30min，之后用pbs洗细胞三次，共聚焦显微镜下成像。
[0080]
ros过氧化物的堆积是pd重要的病变原因，消除过量的ros对保持健康至关重要。本发明首先以2,7
‑
二氯荧光素二乙酸酯(dcfh
‑
da)为探针，测试了p@rnp纳米颗粒对ros的清除能力，dcfh
‑
da可与ros发生反应，表现出较强的荧光。用无血清培养液稀释dcfh
‑
da到10μmol/l的浓度，6孔板中的细胞培养液被弃，然后用pbs液清洗后，加入dcfh
‑
da 1ml到每孔，20min的孵育，全程避光。本发明通过监测dcf的荧光来检测sh
‑
sy5y细胞清除ros的能力。
[0081]
结果如图3所示，与对照组比较，mpp+处理sh
‑
sy5y细胞内ros水平明显升高，p@rnp纳米颗粒处理组sh
‑
sy5y细胞内的荧光强度最低，体外实验结果表明p@rnp纳米颗粒具有有效清除ros的能力和降低其对神经元的损伤，可减少pd中的ros引起的相关症状。
[0082]
实施例4
[0083]
本实施例针对实施例1制备得到的p@rnp治疗mptp诱导pd模型鼠后的神经行为学进行评估，具体流程如下：
[0084]
1、将健康小鼠和pd小鼠随机分为5组:
[0085]
(1)正常健康小鼠(正常组，n＝7)；
[0086]
(2)pd小鼠静脉注射磷酸盐生理盐水pbs(pbs组，n＝7)；
[0087]
(3)pd小鼠静脉注射p@n(p@n组，n＝7)；
[0088]
(4)pd小鼠静脉注射p@r纳米颗粒(p@r组，n＝7)；
[0089]
(5)pd小鼠静脉注射p@rnp纳米颗粒(p@rnp组，n＝7)，药物浓度5mg/kg。
[0090]
治疗结束两周后进行行为学观测，后解剖小鼠，分离脑组织，做各项药理学检测。
[0091]
2、mptp帕金森小鼠模型有探索运动障碍和显著焦虑等症状，可由旷场试验检测。旷场实验的具体流程如下：
[0092]
mptp诱导pd模型鼠在治疗前和治疗后各进行一次测试，小鼠旷场反应箱高25～30cm，底边长72cm，内壁涂黑，底面平均分为64个小方格。实验在安静的环境下进行。将动物放入箱内底面中心，同时进行摄像和计时。观察一定时间后停止摄像，观察时间可根据实验拟定，一般为3～5min。更换动物，继续实验。根据计算机软件设计不同可观察的参数不同，
如单位时间内动物在中央格停留时间，某一肢体越过的格子数为水平得分(crossing)，后肢站立次数为垂直得分(rearing)，还可参考修饰次数，尿便次数，运动速度，运动距离，休息时间，沿边运动距离和中央运动距离等。
[0093]
3、转棒实验：mptp诱导pd模型鼠在治疗前和治疗后各进行一次测试，采用旋转棒实验观察小鼠的疲劳程度和握力。每只老鼠在旋转杆上行走的时间(30转/分)训练后至少记录3次。
[0094]
结果如图4所示，本发明通过转棒实验和旷场试验记录了帕金森病小鼠的行为。与对照组野生型小鼠相比，模型小鼠运动轨迹显著改变，而经纳米药物治疗后，轨迹趋于正常。与正常健康小鼠相比，pbs组(pd+pbs)小鼠运动距离增加且焦虑样情感状态明显异常。
[0095]
图4结果表明了使用p@rnp纳米颗粒治疗的pd小鼠与未治疗的pbs组小鼠相比旷场的运动距离增加且焦虑样情感状态明显改善，这表明它们的pd症状明显改善。与正常健康小鼠相比，pd+pbs组小鼠平均停留在转棒上的时间约为130秒左右，明显短于正常小鼠(210s左右)。p@rnp组观察到了明显的改善效果，该组老鼠在转棒上的时间旋接近正常小鼠的(p<0.01)。动物实验表明p@rnp处理后能够改善pd鼠的运动症状。
[0096]
4、步态障碍是帕金森病一个重要指标，本发明进一步通过步态分析仪记录了帕金森病小鼠的行为(图5)。与正常健康小鼠相比，pbs组小鼠平均运动速度(9.7cm/s)明显短于正常小鼠(13.9cm/s)，但p@rnp组观察到了明显的治疗效果，该组老鼠在运动速度达到20cm/s(图5中的a和b)。摆动速度也可以观察到pbs组小鼠比正常小鼠差，而相应的，p@rnp组得到了改善。此外，pbs组的三爪支撑和四爪支撑均比正常组小鼠明显增多，p@rnp组观察到了明显改善效果(图5中的c和d)。
[0097]
从这些结果中可以得出结论，与未治疗的小鼠相比，使用p@rnp纳米颗粒治疗的pd小鼠更容易越过靶象限，这表明它们的pd症状明显改善，即动物实验表明p@rnp治疗后能够改善pd鼠的运动症状。
[0098]
实施例5
[0099]
本实施例针对实施例1制备得到的p@rnp纳米颗粒进行western blot(wb)分析，具体流程如下：
[0100]
将pd鼠黑质组织在ripa裂解液中裂解；离心后收集蛋白质，并使用bca蛋白质检测试剂盒(pierce)测定；通过sds
‑
page分离样品，后转移至pvdf膜上，使用脱脂牛奶封闭后，将pvdf膜先后与第一抗体和第二抗体孵育；最后采用化学发光试剂对免疫反应带进行检测，内参使用β
‑
actin。
[0101]
beclin1是调控自噬的关键因子，自噬体膜上的一种重要标志蛋白质是微管相关蛋白1轻链3(lc3)，分为lc3
‑
i和lc3
‑
ii之分。自噬活性可以通过lc3
‑
ii的含量变化体现。文献报道a
‑
synuclein清除是通过beclin
‑
1通路介导的，因此可以通过beclin1水平的变化反应a
‑
synuclein蛋白水平的变化。如图6所示，与对照组相比，p@rnp组小鼠黑质中beclin
‑
1上调，lc3ii/lc3
‑
i比值升高，说明p@rnp激活了自噬下调a
‑
synuclein，减少了对多巴胺能神经元的毒性。
[0102]
实施例6
[0103]
本实施例针对实施例1制备得到的p@rnp纳米颗粒进行免疫荧光法疗效评估，具体流程如下：
[0104]
小鼠灌注固定后取脑、脱水、oct包埋，冰冻切片机切片(20
‑
25um厚)，贴片、
‑
80℃保存。
[0105]
后针对冰冻切片的染色具体操作如下：
[0106]
(1)切片从
‑
80℃取出后室温平衡30min；
[0107]
(2)pbs清洗5min
×
3；
[0108]
(3)0.2％triton x
‑
100处理切片10min(目的是增加细胞膜通透性)后pbs清洗3次，每次5min；
[0109]
(4)血清室温封闭30min；
[0110]
(5)一抗混合液4℃孵育过夜；
[0111]
(6)第二天室温pbs清洗5min
×
3；
[0112]
(7)二抗混合液室温孵育30min；
[0113]
(8)pbs清洗5min
×
3；
[0114]
(9)dapi复染核；
[0115]
(10)抗淬灭封片剂封片，荧光显微镜拍照。
[0116]
为了进一步评价治疗效果，并且确定p@rnp是否对mptp处理后da神经元的损伤有保护作用，本发明通过免疫荧光评估了酪氨酸羟化酶(th)阳性神经元细胞的数量。结果如图7所示，图7的结果显示出p@rnp治疗后可以抑制mptp诱导的th+神经元数目减少效应，从图中可以看出，其它三组(pd+pbs、pd+p@n以及pd+p@r)中小鼠脑黑质中th阳性染色神经元细胞的数量明显减少，这说明了本发明实施例1制备的p@rnp纳米颗粒可减轻模型小鼠多巴胺能神经元损伤并有保护作用。
[0117]
此外，本发明还分析了小胶质细胞激活的标记物iba
‑
1和星形胶质细胞活化的标志物gfap(通常用于反映神经炎症反应)的水平。结果显示p@rnp组小鼠大脑中iba
‑
1和gfap的表达与正常小鼠相似，说明通过尼洛替尼和迷迭香酸的协同作用可以减少脑内的氧化应激所导致的神经炎症。相反，另三组中iba
‑
1和gfap水平明显上调高于正常组小鼠。此外，本发明还通过neun染色发现p@rnp处理可以减少mptp引起的神经元毒性。
[0118]
综上所述，本发明从实验例1
‑
6实验表明，迷迭香酸
‑
尼洛替尼组合纳米药物能对sh
‑
sy5y细胞发挥神经保护作用。该纳米药物配方可以明显减轻mpp+诱导的毒性，减少ros的生成，激活了自噬下调了α
‑
synuclein的水平，进而减少了对多巴胺能神经元的毒性。
[0119]
本发明提供的p@rnp无细胞毒性，副作用小，具有神经保护及抗氧化应激的作用。
[0120]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。