一种蜂房醇提物的制备方法及其应用与流程

1.本发明涉及蜂房提取物技术领域，更具体地说，尤其涉及一种蜂房醇提物的制备方法及其应用。


背景技术：

2.高尿酸血症是由于嘌呤代谢障碍，尿酸生成增多或排泄减少，导致血尿酸增高的一种疾病。近年来随着人们生活水平提高和生活方式改变，高尿酸血症的发病率呈逐年上升趋势。但高尿酸血症早期仅有血尿酸增高，并无自觉症状，从血尿酸升高至症状出现的时间可长达数年甚至数十年，因此，高尿酸血症是常被忽视的慢性病。高尿酸血症不仅是痛风产生的病理基础，还与高血压、冠心病、动脉硬化、心力衰竭、心肌梗死以及脑卒中等多种心脑血管疾病密切相关，同时会累及肾脏、肝脏、关节等人体多器官组织，因此重视血尿酸的控制具有重要意义。在治疗无症状高尿酸血症时，需要限制高嘌呤食物的摄入，增加具有降尿酸作用的食品摄入。
3.中药蜂房别名为黄蜂窝、野蜂窝、马蜂窝、露蜂房。性平，味甘，归胃经，用于疮疡肿毒，乳痈，瘰疬，皮肤顽癣，鹅掌风，牙痛，风湿痹痛等。蜂房中含有蜂胶、蜂蜡、树脂、黄酮类、挥发性、苯丙素类以及蛋白质、肽类、糖类等多种化学成分。具有抗肿瘤、抗菌、抗炎等多种药理作用，用于治疗肝癌、肺癌、骨癌、胃癌、乳腺癌等多种癌症以及关节炎、支气管炎等。
4.蜂房中的各种有效成分有益于治疗人体疾病，虽然现在有将蜂房可用于治疗痛风的复方中，但未见露蜂房提取物降尿酸治疗痛风的报道，为此，我们提出一种蜂房醇提物的制备方法及其应用。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种蜂房醇提物的制备方法及其应用。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种蜂房醇提物的制备方法，包括如下步骤：
7.s1、原料选择：将选取的无病变、杂质的蜂房，并将选取的蜂房进行清洗；
8.s2、蜂房干燥：将清洗后阴干水分的蜂房放入干燥设备中，在80℃的温度下进行干燥，并将干燥后的蜂房粉碎；
9.s3、制备蜂房醇提物：按比例选取蜂房和溶剂，向蜂房加溶剂，得到混合物，将该混合物加热到60～80℃后回流两次，并进行抽滤，抽滤后合并滤液，并减压回收溶剂，将剔除溶剂的滤液放入真空干燥的设备中，进行真空干燥，得蜂房醇提物；
10.s4、制备蜂房水醇提物：按比例选取蜂房和溶剂，将溶剂加入蜂房中，并浸泡1小时，在60～80℃的文火下煎煮两次，并进行抽滤，抽滤后合并滤液，对滤液进行减压浓缩，浓缩后进行真空干燥，得蜂房水醇提物。
11.s5.保存：将步骤s3和s4制备的蜂房水醇提物和蜂房水醇提物在4℃的温度下保
存。
12.作为本技术方案的进一步优选的：在步骤s3、制备蜂房醇提物中，蜂房醇提物的得率为15.7％。
13.作为本技术方案的进一步优选的：在步骤s4、制备蜂房水醇提物中，蜂房醇提物的得率为10.2％。
14.作为本技术方案的进一步优选的：在步骤s3、制备蜂房醇提物中，溶剂采用95％乙醇。
15.作为本技术方案的进一步优选的：在步骤s4、制备蜂房水醇提物中，溶剂采用水。
16.作为本技术方案的进一步优选的：所述蜂房和溶剂的比例为1：10。
17.作为本技术方案的进一步优选的：在对蜂房进行清洗时，包括如下步骤：
18.(1)配置淡盐水，并将淡盐水的浓度设定在3～5％范围内；(2)浸泡，将蜂房放置在淡盐水内浸泡40～50分钟，浸泡结束后，取出蜂房并在清水下冲洗3分钟。
19.一种蜂房醇提物在抑制黄嘌呤氧化酶活性中的应用。
20.一种蜂房醇提物在预防、治疗高尿酸血症中的应用。
21.一种蜂房醇提物在预防、治疗痛风中的应用。
22.本发明的技术效果和优点：
23.本发明制备的蜂房醇提物和蜂房水醇提物对黄嘌呤氧化酶活性均有抑制作用，其ic50分别为162.17、248.35μg/ml；蜂房醇提物和蜂房水醇提物具有降尿酸作用，对高尿酸血症大鼠、痛风大鼠血清尿酸和痛风大鼠关节尿酸均有降低作用，且蜂房提取物增加了尿酸钠刺激huvec细胞后的细胞活力，减轻了急性痛风性关节炎大鼠关节足肿胀度，降低了关节尿酸水平，再者蜂房提取物具有更好xod抑制活性和降尿酸作用，从而蜂房醇提物、蜂房水醇提物可用于预防、治疗高尿酸血症和痛风。
具体实施方式
24.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.实施例1
26.蜂房醇提物的制备方法，包括如下步骤：
27.s1、原料选择：将选取的无病变、杂质的蜂房，并将选取的蜂房进行清洗，在对蜂房进行清洗时，先配置淡盐水，并将淡盐水的浓度设定在3～5％范围内；然后将蜂房放置在淡盐水内浸泡40～50分钟，浸泡结束后，取出蜂房并在清水下冲洗3分钟；
28.s2、蜂房干燥：将清洗后阴干水分的蜂房放入干燥设备中，在80℃的温度下进行干燥，并将干燥后的蜂房粉碎；
29.s3、制备蜂房醇提物：按1：10的比例选取蜂房和95％乙醇，向蜂房加10倍的95％乙醇，得到混合物，将该混合物加热到60℃后回流两次，并进行抽滤，抽滤后合并滤液，并减压回收乙醇，将剔除乙醇的滤液放入真空干燥的设备中，进行真空干燥，得蜂房醇提物，蜂房醇提物的得率为15.7％；
30.s4、制备蜂房水醇提物：按1：10的比例选取蜂房和水，将10倍的水加入蜂房中，并浸泡1小时，在65℃的文火下煎煮两次，并进行抽滤，抽滤后合并滤液，对滤液进行减压浓缩，浓缩后进行真空干燥，得蜂房水醇提物，蜂房醇提物的得率为10.2％。
31.s5.保存：将步骤s3和s4制备的蜂房水醇提物和蜂房水醇提物在4℃的温度下保存。
32.实施例2
33.蜂房醇提物的制备方法，包括如下步骤：
34.s1、原料选择：将选取的无病变、杂质的蜂房，并将选取的蜂房进行清洗，在对蜂房进行清洗时，先配置淡盐水，并将淡盐水的浓度设定在3～5％范围内；然后将蜂房放置在淡盐水内浸泡40～50分钟，浸泡结束后，取出蜂房并在清水下冲洗3分钟；
35.s2、蜂房干燥：将清洗后阴干水分的蜂房放入干燥设备中，在80℃的温度下进行干燥，并将干燥后的蜂房粉碎；
36.s3、制备蜂房醇提物：按1：10的比例选取蜂房和95％乙醇，向蜂房加10倍的95％乙醇，得到混合物，将该混合物加热到70℃后回流两次，并进行抽滤，抽滤后合并滤液，并减压回收乙醇，将剔除乙醇的滤液放入真空干燥的设备中，进行真空干燥，得蜂房醇提物，蜂房醇提物的得率为15.7％；
37.s4、制备蜂房水醇提物：按1：10的比例选取蜂房和水，将10倍的水加入蜂房中，并浸泡1小时，在70℃的文火下煎煮两次，并进行抽滤，抽滤后合并滤液，对滤液进行减压浓缩，浓缩后进行真空干燥，得蜂房水醇提物，蜂房醇提物的得率为10.2％。
38.s5.保存：将步骤s3和s4制备的蜂房水醇提物和蜂房水醇提物在4℃的温度下保存。
39.实施例3
40.蜂房醇提物的制备方法，包括如下步骤：
41.s1、原料选择：将选取的无病变、杂质的蜂房，并将选取的蜂房进行清洗，在对蜂房进行清洗时，先配置淡盐水，并将淡盐水的浓度设定在3～5％范围内；然后将蜂房放置在淡盐水内浸泡40～50分钟，浸泡结束后，取出蜂房并在清水下冲洗3分钟；
42.s2、蜂房干燥：将清洗后阴干水分的蜂房放入干燥设备中，在80℃的温度下进行干燥，并将干燥后的蜂房粉碎；
43.s3、制备蜂房醇提物：按1：10的比例选取蜂房和95％乙醇，向蜂房加10倍的95％乙醇，得到混合物，将该混合物加热到78℃后回流两次，并进行抽滤，抽滤后合并滤液，并减压回收乙醇，将剔除乙醇的滤液放入真空干燥的设备中，进行真空干燥，得蜂房醇提物，蜂房醇提物的得率为15.7％；
44.s4、制备蜂房水醇提物：按1：10的比例选取蜂房和水，将10倍的水加入蜂房中，并浸泡1小时，在75℃的文火下煎煮两次，并进行抽滤，抽滤后合并滤液，对滤液进行减压浓缩，浓缩后进行真空干燥，得蜂房水醇提物，蜂房醇提物的得率为10.2％。
45.s5.保存：将步骤s3和s4制备的蜂房醇提物和蜂房水醇提物在4℃的温度下保存。
46.实施例4
47.通过实验例对蜂房提取物在预防和治疗高尿酸血症、痛风中的应用进行证明，详情如下：
48.1.仪器与材料：
49.1.1材料：实施例1
‑
3制备的蜂房提取物。
50.1.2药物及试剂
51.黄嘌呤，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氧嗪酸钾，上海麦克林生化科技有限公司；尿酸检测试剂盒、黄嘌呤氧化酶、黄嘌呤氧化酶试剂盒，南京建成生物工程研究所；尿酸钠，美国sigma公司。
52.1.3实验动物
53.sd大鼠，雌雄各半，体重180
±
20g。实验动物由三峡大学动物实验中心提供，实验动物许可证号：scxk(鄂)2017
‑
0012，实验单位使用许可证号：syxk(鄂)2017
‑
0061。温度20～26℃，湿度40％～70％，正常喂养，自由饮水。
54.1.4仪器
55.ja2003型电子分析天平(上海天平仪器厂)；infinite m200pro酶联免疫检测仪，ati公司；centrifuge 5415r高速冷冻离心机，eppendorf公司；kfs
‑
c电子数字秤，凯丰集团有限公司。ph计(上海仪电科学仪器有限公司)；超纯水仪(美国aquapro国际有限公司)。
56.1.5溶液配制
57.体外实验用样品用dmso溶解，配置成储备液，临用前稀释至不同浓度。体内实验用样品用0.5％羧甲基纤维素钠溶液制成均匀混悬液。
58.底物溶液配制：黄嘌呤用1mol/l氢氧化钠溶解加入蒸馏水30ml，1mol/l盐酸调节ph至7.5，配置成1.5mmol/l的储备液。
59.酶液配置：xod以pbs溶解，配置成0.4u的xod储备液于
‑
80℃保存。临用前稀释成不同梯度并于冰水浴中保存。
60.2方法
61.2.1黄嘌呤氧化酶活力测定：
62.体外条件下，xod在适合条件下可将黄嘌呤氧化成尿酸。尿酸在295nm处具有特征吸收峰，记录295nm处每分钟增加的od值来计算xod酶活(δod/min,δod为od值增加值)，以此来测定各组样品对xod的影响。将样品及空白溶液100μl，浓度0.1u/l的xod 50μl,依次加入96孔板，37℃孵育5min，加入0.05mmol/l的底物黄嘌呤溶液。混匀，295nm处每隔15秒读数一次记录od值，监测5min。
63.抑制率％＝[(δod/min)空白]
‑
[(δod/min)样品]/(δod/min)空白x100
[0064]
(δod/min)空白：空白组反应速率；
[0065]
(δod/min)样品：样品反应速率；
[0066]
2.2蜂房提取物对高尿酸血症动物模型的影响
[0067]
2.2.1高尿酸血症大鼠模型建立
[0068]
将42只大鼠按体重随机分为空白组、模型组、别嘌呤醇组(5mg/kg)、蜂房醇提物低、高剂量组，蜂房水醇提物低、高剂量组，每组6只。实验组大鼠灌胃氧嗪酸钾500mg/kg复制高尿酸血症模型。造模1h后，各实验组灌胃给相应样品，空白组和模型组大鼠灌胃等体积0.5％羧甲基纤维素钠溶液。每天1次，连续14天。末次给样1h后，各组大鼠眼球静脉丛取血，3000r/min离心10min，取血清，置于
‑
20℃冰箱备用。之后脱颈椎处死大鼠，取大鼠肝脏组织，
‑
80℃冰箱保存，备用。
[0069]
2.3.2大鼠血清尿酸含量和肝脏黄嘌呤氧化酶活性测定
[0070]
取大鼠血清按照尿酸检测试剂盒说明书进行检测。准确称取肝组织并按重量(g)：体积(ml)＝1：9的比例加入生理盐水，
‑
20℃机械匀浆，制备成10％的匀浆液，2500～3000r/min，离心10分钟，取上清液进行测定。使用黄嘌呤氧化酶测定试剂盒按照说明书测定。
[0071]
2.3蜂房提取物对急性痛风细胞模型的影响
[0072]
2.3.1急性痛风细胞模型建立
[0073]
人脐静脉内皮细胞(huvec)，贴壁生长，用dmem培养基于37℃、5％co2、饱和湿度条件下的细胞培养箱中无菌培养。培养液为含10％nbs、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素的完全dmem细胞培养基，细胞单层长到培养瓶80％时传代。培养细胞按1
×
105个/ml的密度种植于96孔培养板中，加入终浓度为100μg/ml msu,37℃，5％co2培养箱中培养24h，建立急性痛风细胞模型。
[0074]
2.3.2蜂房提取物对急性痛风细胞模型影响
[0075]
建立急性痛风细胞模型，并将不同的浓度样品，加入到96孔培养板中，每个浓度梯度设4个复孔，继续培养48h后。四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(mtt)，490nm波长下测其od值，计算细胞活力。
[0076]
2.4蜂房提取物对急性痛风性关节炎大鼠模型的影响
[0077]
2.4.1痛风大鼠模型建立
[0078]
将42只大鼠按体重随机分为空白组、模型组、别嘌呤醇组(5mg/kg)、蜂房醇提物低、高剂量组，蜂房水醇提物低、高剂量组，每组6只。各实验组灌胃给相应样品，空白组和模型组大鼠灌胃等体积0.5％羧甲基纤维素钠溶液。每天1次，连续14天。第12天灌胃后，各组大鼠仰卧固定，剔除右后肢小腿关节毛，消毒，麻醉后用6号注射针以大鼠右深关节外侧后方为穿刺点，距小腿关节背后从45
°
方向插入至胫骨肌腱内侧，注入25mg/ml尿酸钠溶液200μl，对照组给予等量无菌生理盐水。末次灌胃1h后，10％水合氯醛麻醉过量处死大鼠，取大鼠受试关节，
‑
80℃冰箱保存，备用。
[0079]
2.4.2蜂房提取物对急性痛风性大鼠足肿胀度的影响
[0080]
用缚线法测量造模前1小时和造模后第48小时大鼠右踝关节同一部位的周径，计算肿胀指数。肿胀指数＝(致炎后踝关节周径
‑
致炎前踝关节周径)/致炎前踝关节周径。
[0081]
2.4.3蜂房提取物对急性痛风性大鼠关节尿酸含量的影响
[0082]
取大鼠大鼠受试关节，于踝关节上0.5cm处剪下，剥皮剪碎放于3ml生理盐水中浸泡1小时，将浸泡液离心，取上清液，使用尿酸检测试剂盒检测尿酸含量。
[0083]
3.结果
[0084]
3.1蜂房提取物体外对黄嘌呤氧化酶抑制作用
[0085]
体外测定各样品对xod活性的抑制率，使用graphpad prism 7软件计算ic50(半数抑制浓度)。结果如表1：
[0086]
表1.蜂房提取物体外对黄嘌呤氧化酶活性的影响
[0087][0088]
由表1可知，别嘌呤醇对黄嘌呤氧化酶有抑制作用，其ic50为12.44μg/ml，与文献所述相近，蜂房醇提物，蜂房水醇提物对黄嘌呤氧化酶活性均有抑制作用，其ic50分别为162.17、248.35μg/ml。
[0089]
3.2蜂房提取物对高尿酸血症大鼠血尿酸含量及肝脏嘌呤氧化酶活性的的影响
[0090]
测定大鼠血清尿酸浓度和肝脏、血xod活性，结果如表2。
[0091][0092][0093][0094]
与模型组比较*p<0.05
[0095]
由表2可知，高尿酸血症模型组与空白对照组比，血尿酸、血xod、肝脏xod显著升高，有显著性差异(p<0.05)，别嘌呤醇和各样品组均降低血尿酸、血xod、肝脏xod水平，与模型组相比差异有显著性(p<0.05)。
[0096]
3.3蜂房提取物对急性痛风细胞模型的影响
[0097]
mtt检测msu刺激48h后各组细胞od值，计算细胞活力：细胞活力＝各组细胞od值/空白组
×
100％。得到表3：
[0098]
表3.蜂房提取物对急性痛风
[0099][0100][0101]
与模型组比较*p<0.05
[0102]
由表3可知，msu刺激huvec细胞48h后，细胞活力与空白组比较显著降低，给药后各组huvec细胞活力显著升高(p<0.05)。
[0103]
3.3蜂房提取物对对急性痛风大鼠的影
[0104]
表4.蜂房提取物对急性痛风大鼠关节肿
[0105][0106]
与模型组比较*p<0.05
[0107]
如表4所示，与模型比较，空白组大鼠踝关节肿胀度明显低于模型组组(p<0.05)，这说明尿酸钠造痛风模型成功，与模型组比较，各实验组大鼠踝关节肿胀度显著降低(p<0.05)
[0108]
表5.蜂房提取物对急性痛风大鼠关节尿酸
[0109]
[0110]
与模型组比较*p<0.05
[0111]
由表5所示可知，与模型比较，空白组大鼠踝关节尿酸含量明显低于模型组组(p<0.05)，与模型组比较，各实验组大鼠踝关节尿酸含量显著降低(p<0.05)。
[0112]
结论：
[0113]
1、蜂房醇提物，蜂房水醇提物体内外对黄嘌呤氧化酶活性均有抑制作用。
[0114]
2、蜂房醇提物，蜂房水醇提物具有降尿酸作用，对高尿酸血症大鼠、痛风大鼠血清尿酸和痛风大鼠关节尿酸均有降低作用。
[0115]
3、蜂房醇提物，蜂房水醇提物具有减轻了急性痛风性关节炎大鼠关节足肿胀的作用。
[0116]
4、蜂房醇提物，蜂房水醇提物可用于预防、治疗高尿酸血症和痛风。
[0117]
在实际应用中，可将蜂房醇提物、蜂房水醇提物体加工制成膏、饼、片、酒、代用茶、口服液、冲剂等功能食品，也可加工制成膏剂、片剂、口服液、冲剂、丸剂等药品。
[0118]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。