选择用于过继细胞疗法的T细胞系及其供体的方法与流程

选择用于过继细胞疗法的t细胞系及其供体的方法
1.本技术是申请日为2015年11月4日，申请号为201580072206.8，名称为“选择用于过继细胞疗法的t细胞系及其供体的方法”的中国发明专利申请的分案申请。
2.相关申请的交叉引用
3.本技术要求2014年11月5日提交的临时申请号62/075,856的权益，其通过引用以其整体结合到本文中。
4.政府权利声明
5.本发明在国立卫生研究院(national institutes of health)授予的nci ca 23766、sr21 ca 162002、sp30
‑
ca08748
‑
40、p01 ca 106450、p01 ca 52477
‑
13、p01 ca54350的政府支持下完成。政府在本发明中享有一定权利。
1.发明领域
6.本文公开了选择用于治疗性给予携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的患者的同种异体t细胞系的方法。还公开了选择从中得到用于治疗性给予携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的患者的同种异体t细胞系的供体的方法。
7.2.发明背景
8.抗病毒cd8+t细胞对由病毒基因组编码的一小部分潜在肽决定簇起反应。细胞毒性t细胞通过t细胞受体(tcr)同与主要组织相容性(mhc)i类分子复合的8
‑
11个氨基酸抗原肽的相互作用识别被感染的细胞。这些mhc
‑
肽复合物产生于内源合成的病毒蛋白质的胞内加工(saveanu,l.等,immunol rev,2005.207:42
‑
59；strehl,b.等,immunol rev,2005.207:19
‑
30)。
9.肽决定簇与特定hla分子内的预测的结合基序结合。虽然可产生多个肽表位，但t细胞应答集中在多个选定表位，一种称为免疫显性的现象(sercarz,e.e.等,annu rev immunol,1993.11:729
‑
66；yewdell,j.w.和j.r.bennink,annu rev immunol,1999.17:51
‑
88)。cd8
‑
t细胞应答对病原体的高度聚焦性质表明各个表位在其诱导t细胞应答的能力上不同(yewdell,j.w.和j.r.bennink,annu rev immunol,1999.17:51
‑
88)。
10.可根据表位用于对任何特定病毒肽的整体t细胞应答的成比例的贡献，对在任何指定个体中诱导最显著的t细胞应答的肽表位进一步分类。“免疫显性”表位被最丰富的关联t细胞群识别，而“亚显性”表位被不太丰富的t细胞群识别。因此，根据其对总体t细胞应答的相对贡献，可将各个表位归类为显性、共显性或亚显性，从而建立免疫显性分层。
11.在小鼠的流感病毒感染的情况下，cd8 t细胞应答通常只针对少数特定表位(la gruta,n.l.等,proc natl acad sci u s a,2006.103:994
‑
999)。在特别极端的实例中，对小鼠副流感病毒(仙台病毒)的整个cd8
‑
t细胞应答针对单一表位cole,g.a.等,int immunol,1994.6:1767
‑
1775；kast,w.m.等,proc natl acad sci u s a,1991.88:2283
‑
2287)。
12.已表征了针对若干病毒感染的人t细胞应答。针对人免疫缺陷病毒(hiv)的t细胞应答的研究导致在该病毒的不同蛋白质中鉴定出几个表位，而且这些研究还显示，免疫显
性表位可由在共遗传这些hla等位基因的个体中普遍的人白细胞抗原(hla)等位基因例如hla a0301、b0702或a0201提呈(day,c.l.等,j virol,2001.75:6279
‑
6291)。此外，在不同的感染阶段，多个表位可由这些相同的hla等位基因提呈(yu,x.g.等,j virol,2002.76:8690
‑
8701)。对针对人巨细胞病毒(cmv)的t细胞应答的评价导致在该病毒的最有免疫原性的蛋白质(即cmvpp65和ie1)中鉴定出几个免疫显性表位，及其提呈性(presenting)hla等位基因。这随后在遗传特定hla等位基因(例如hla b0702和hla a0201)的个体中识别出，由这些等位基因提呈的表位构成免疫显性表位。当这些等位基因共遗传时，由hla b0702提呈的表位构成免疫显性t细胞应答，而hla a0201提呈的表位是亚显性的(lacey,s.f.等,hum immunol,2003.64:440
‑
452)。
13.免疫显性反映了控制抗原加工和呈递以及t细胞激活和t细胞受体亲合力的多个正因素和负因素的最终产物(yewdell,j.w.和j.r.bennink,annu rev immunol,1999.17:51
‑
88)。在这些当中，迄今在大部分研究中评价的主要因素包括受感染个体的遗传hla i类背景、病毒蛋白质的序列和病毒感染的动力学，以及hla沟中的结合亲和力以及肽
‑
mhc复合物的tcr亲和力。
14.在同种异体造血干细胞移植(hsct)后，使用供体来源的病毒特异性t细胞的过继免疫疗法在清除病毒感染例如eb病毒(ebv)和cmv中可能是有效的。供体来源的病毒特异性t细胞的适时可用性的缺乏是该治疗方法成功应用的主要限制。此外，这类细胞无法从血清反应阴性供体和脐带血供体产生。在这类情况下，对于这类患者的重度病毒感染的治疗，可容易地获得预先产生的第三方供体来源的病毒特异性t细胞。几个组群表明使用基于2个或更多个hla等位基因选配凭经验输入的ctl系，用于治疗ebv、cmv和腺病毒(adv)感染的第三方供体来源的病毒特异性细胞毒性t淋巴细胞(ctl)系的安全和潜在功效(haque,t等,lancet,2002.360:436
‑
442；barker,j.n.等,blood,2010.116:5045
‑
5049；doubrovina,e.等,blood,2012.119:2644
‑
2656；uhlin,m.等,clinical infectious diseases,2012.55:1064
‑
1073；leen,a.m.等,blood,2013.121:5113
‑
5123)。需要选择ctl系以确保ctl治疗的高度和一致功效的方法。
15.本文参考文献的引用不应解释为承认所述文献是本公开内容的先有技术。
16.3.发明概述
17.本发明提供选择用于治疗性给予携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的人类患者的同种异体t细胞系的方法，和选择所述同种异体t细胞系来源于其中的同种异体t细胞供体的方法。
18.在不同的方面，选择用于治疗性给予携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的人类患者的同种异体t细胞系的方法包括：使用(i)鉴定多个hla等位基因和任选hla等位基因组合，和(ii)揭示各个识别病原体或癌症的抗原的至少一个表位并受限于大量hla等位基因或hla等位基因组合的不同hla等位基因或hla等位基因组合的t细胞系的相对活性的指标的示图(下文为“活性示图(representation of activity)”)，选择与识别病原体或癌症的抗原的至少一个表位的患者是同种异体的t细胞系；其中在示图中各个鉴定的hla等位基因或hla等位基因组合与受限于hla等位基因或hla等位基因组合的t细胞系的相对活性的相应指标有关，所述相对活性是由t细胞系显示的针对病原体或针对癌症的已知活性的相对度量；其中(a)所选的t细胞系具有与患者或患者的患病细胞(例如癌症或与病原体的
存在有关的患病细胞)一样的示图中鉴定的t细胞系的识别受其限制的hla等位基因或hla等位基因组合；和(b)所选的t细胞系受其限制的hla等位基因或hla等位基因组合在示图中与在示图中已知与患者或患者的患病细胞(根据患者或患者的患病细胞的hla配型)一样且未以别的方式使之不合格的hla等位基因和hla等位基因组合中的最高相对活性的指标相关。
19.在某些实施方案中，选择同种异体t细胞系的方法进一步包括在选择步骤之前制作活性示图的步骤。在某些实施方案中，选择同种异体t细胞系的方法进一步包括在制作步骤之前测量相对活性的步骤。在某些实施方案中，选择同种异体t细胞系的方法进一步包括在选择步骤之前确定患者或患者的患病细胞的hla配型的步骤。在具体的实施方案中，确定的步骤包括对至少4个hla基因座分型。
20.在不同的方面，选择从其得到同种异体t细胞系用于治疗性给予携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的人类患者的同种异体t细胞供体的方法包括：使用活性示图选择对患者是同种异体的t细胞供体，所述活性示图(i)鉴定多个hla等位基因和任选hla等位基因组合，和(ii)揭示各个识别病原体或癌症的抗原的至少一个表位并受限于大量hla等位基因或hla等位基因组合的不同hla等位基因或hla等位基因组合的t细胞系的相对活性的指标；其中在示图中各个鉴定的hla等位基因或hla等位基因组合与受限于hla等位基因或hla等位基因组合的t细胞系的相对活性的相应指标有关，所述相对活性是由t细胞系显示的针对病原体或针对癌症的已知活性的相对度量；其中(a)所选的t细胞供体具有与患者或患者的患病细胞(例如癌症或与病原体的存在有关的患病细胞)一样的至少一个hla等位基因或hla等位基因组合；和(b)与患者或患者的患病细胞一样的至少一个hla等位基因或hla等位基因组合之一在示图中与在活性示图中已知与患者或患者的患病细胞一样且未以别的方式使之不合格的hla等位基因和hla等位基因组合中的最高相对活性的指标有关。
21.在某些实施方案中，选择同种异体t细胞供体的方法进一步包括在选择步骤之前制作活性示图的步骤。在某些实施方案中，选择同种异体t细胞供体的方法进一步包括在制作步骤之前测量相对活性的步骤。在某些实施方案中，选择同种异体t细胞供体的方法进一步包括在选择步骤之前确定患者或患者的患病细胞的hla配型的步骤。在某些实施方案中，选择同种异体t细胞供体的方法进一步包括在选择步骤之前确定t细胞供体的hla配型的步骤。在某些实施方案中，选择同种异体t细胞供体的方法进一步包括在选择步骤之前确定患者或患者的患病细胞的hla配型和t细胞供体的hla配型的步骤。在具体的实施方案中，确定的步骤包括对至少4个hla基因座分型。
22.在一些实施方案中，活性示图是通过相对活性排序的多个hla等位基因和任选hla等位基因组合的列表。在一些实施方案中，活性示图是多个hla等位基因和任选hla等位基因组合的数据库一览表，每一个与表明相对活性的评分有关。在一些实施方案中，活性示图是散点图。在这类实施方案的一个具体方面，散点图的第一轴表示大量hla等位基因和任选hla等位基因组合中不同的hla等位基因和任选hla等位基因组合，散点图的第二轴表示在用对各个t细胞系是自体的并负载显示病原体或癌症的抗原性的一种或多种肽的抗原呈递细胞刺激时，来源于针对其在示图中揭示相对活性的指标的各t细胞系的干扰素
‑
γ
‑
分泌cd3+细胞的百分比，作为所述相对活性的指标。在优选的实施方案中，相对活性是t细胞系在携带/患有病原体或癌症的患者的治疗中的体内临床功效。在一些实施方案中，活性示图
存储在数据库中。
23.在不同的方面，选择从其得到同种异体t细胞系用于治疗性给予携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的人类患者的同种异体t细胞供体的方法包括：使用示图(下称“频率示图(representation of frequency)”)，选择与具有与患者或患者的患病细胞(例如癌症或与病原体的存在有关的患病细胞)一样的一个或多个hla等位基因的患者是同种异体的t细胞供体，所述图(i)鉴定多个hla等位基因，和(ii)揭示各个识别病原体或癌症的抗原的至少一个表位并受限于多个所述hla等位基因的不同hla等位基因的t细胞系产生的相对频率的指标；其中在示图中各个鉴定的hla等位基因与受限于hla等位基因的所述t细胞系产生的相对频率的相应指标有关，其中：所选的t细胞供体具有与在示图中同与患者或患者的患病细胞不一样的供体的hla等位基因相比与产生的较高频率的指标有关的患者或患者的患病细胞一样的至少一个hla等位基因。
24.在某些实施方案中，选择同种异体t细胞供体的方法进一步包括在选择步骤之前制作频率示图的步骤。在某些实施方案中，选择同种异体t细胞供体的方法进一步包括在制作步骤之前测量相对频率的步骤。在某些实施方案中，选择同种异体t细胞供体的方法进一步包括在选择步骤之前确定患者或患者的患病细胞的hla配型的步骤。在某些实施方案中，选择同种异体t细胞供体的方法进一步包括在选择步骤之前确定t细胞供体的hla配型的步骤。在某些实施方案中，选择同种异体t细胞供体的方法进一步包括在选择步骤之前确定患者或患者的患病细胞的hla配型和t细胞供体的hla配型的步骤。在具体的实施方案中，确定的步骤包括对至少4个hla基因座分型。
25.在一些实施方案中，频率示图是通过相对频率排序的多个hla等位基因的列表。在一些实施方案中，频率示图是多个hla等位基因的数据库一览表，每一个与表示相对频率的评分有关。在一些实施方案中，频率示图存储在数据库中。
26.本文还提供治疗携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的人类患者的方法，所述方法包括：(a)按照本公开内容描述的方法选择同种异体t细胞系用于治疗性给予患者；和(b)将来源于所选的同种异体t细胞系的t细胞群给予患者。
27.本文还描述了获得同种异体t细胞系用于治疗性给予携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的人类患者的方法，所述方法包括：(a)按照本公开内容所描述的选择同种异体t细胞供体的方法选择同种异体t细胞供体；和(b)从所选的同种异体t细胞供体得到同种异体t细胞系，所述同种异体t细胞系识别病原体或癌症的抗原的至少一个表位。
28.在不同的方面，患者携带或疑似携带病原体，其中t细胞系识别病原体的抗原的至少一个表位。在不同的实施方案中，病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或原生生物。在某些实施方案中，病原体是病毒。
29.在一些实施方案中，病毒是巨细胞病毒(cmv)。在具体的实施方案中，患者在患者进行hsct后携带或疑似携带cmv感染。在具体的实施方案中，抗原是cmv pp65。在具体的实施方案中，抗原是cmv ie1。
30.在一些实施方案中，病毒是eb病毒(ebv)。在具体的实施方案中，抗原是ebna1、ebna2、ebna3a、ebna3b、ebna3c、lmp1或lmp2。
31.在一些实施方案中，病毒是bkv、jcv、疱疹病毒、腺病毒、人免疫缺陷病毒、流感病毒、埃博拉病毒、痘病毒、棒状病毒或副黏病毒。
32.在一些实施方案中，病毒是人疱疹病毒
‑
6(hhv
‑
6)或人疱疹病毒
‑
8(hhv
‑
8)。
33.在不同的方面，患者患有或疑似患有癌症，其中t细胞系识别癌症的抗原的至少一个表位。在一些实施方案中，癌症是乳腺、肺、卵巢、胃、胰腺、喉、食管、睾丸、肝、腮腺、胆管、结肠、直肠、宫颈、子宫、子宫内膜、肾、膀胱、前列腺、甲状腺、脑或皮肤的癌症。在一些实施方案中，癌症是血癌。在具体的实施方案中，癌症是淋巴增殖性病症。
34.在一些实施方案中，癌症是wt1阳性癌症。在一些实施方案中，抗原是wt1。
35.在一些实施方案中，癌症是ebv阳性移植后淋巴增殖性病症(ebv
‑
ptld)。在具体的实施方案中，抗原是ebna1、ebna2、ebna3a、ebna3b或ebna3c。在具体的实施方案中，抗原是lmp1或lmp2。
36.在一些实施方案中，癌症是ebv阳性鼻咽癌。在具体的实施方案中，抗原是ebna1、lmp1或lmp2。
37.在不同的实施方案中，按本公开内容所述选择同种异体t细胞系的方法是计算机执行的。在不同的实施方案中，按本公开内容所述选择同种异体t细胞供体的方法是计算机执行的。
38.本文还提供用于选择同种异体t细胞系用于治疗性给予携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的人类患者的计算机系统，其包括：中央处理器；与中央处理器连接的存储器，用于执行按照本公开内容所述选择同种异体t细胞系的任何方法或选择同种异体t细胞供体的任何方法的步骤的存储器存储指令。
39.本文还提供具有用于按本公开内容所述选择同种异体t细胞系的任何方法或选择同种异体t细胞供体的任何方法的步骤的计算机可执行指令的计算机可读介质。
40.在不同的实施方案中，患者曾是造血干细胞移植(hsct)的接受者。在具体的实施方案中，hsct是骨髓移植、外周血干细胞移植或脐带血移植。在不同的实施方案中，患者曾是实体器官移植(sot)的接受者。
41.本公开内容提及的患者是人类患者。
42.4.附图简述
43.图1是表示如第6.2.3节实施例所述受限于提呈通过其各个hla等位基因或hla等位基因组合聚簇的免疫显性表位的hla等位基因或hla等位基因组合的119个cmv特异性ctl系的库中各个t细胞系的干扰素
‑
γ
‑
分泌cd3+细胞的百分比的示图。
44.5.发明详述
45.本发明提供选择用于治疗性给予携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的人类患者的同种异体t细胞系的方法，和选择所述同种异体t细胞系来源于其中的同种异体t细胞供体的方法。按照本发明，存在提呈导致受限于特定hla等位基因的表位特异性t细胞相对于遗传和表达的其它细胞优先扩增的免疫显性表位的hla等位基因的分层。本发明利用反映这种扩增分层(通过抗病原体或抗癌活性反映)的示图以选择用于疗法的同种异体t细胞系和选择由其得到同种异体t细胞系的供体。
46.还存在提呈导致受限于特定hla等位基因的表位特异性t细胞优于遗传和表达的其它细胞的优先产生的免疫显性表位的hla等位基因的分层。本发明利用反映这种产生分层(通过产生的频率反映)的示图以选择由其得到t细胞系的供体。
47.5.1.用于过继细胞疗法的t细胞系的选择
48.本文提供选择用于治疗性给予携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的人类患者的同种异体t细胞系的方法。
49.在不同的方面，选择用于治疗性给予携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的人类患者的同种异体t细胞系的方法包括：使用示图(下称“活性示图”)，选择与识别病原体或癌症的抗原的至少一个表位的患者是同种异体的t细胞系，所述示图(i)鉴定多个hla等位基因和任选hla等位基因组合，和(ii)揭示各个识别病原体或癌症的抗原的至少一个表位并受限于大量hla等位基因或hla等位基因组合的不同hla等位基因或hla等位基因组合的t细胞系的相对活性的指标；其中在示图中各个鉴定的hla等位基因或hla等位基因组合与受限于hla等位基因或hla等位基因组合的t细胞系的相对活性的相应指标有关，所述相对活性是由t细胞系显示的针对病原体或针对癌症的已知活性的相对度量；其中(a)所选的t细胞系具有与患者或患者的患病细胞(例如癌症或与病原体的存在有关的患病细胞)一样的通过示图鉴定的t细胞系的识别受其限制的hla等位基因或hla等位基因组合；和(b)所选的t细胞系受其限制的hla等位基因或hla等位基因组合在示图中与在示图中已知与患者或患者的患病细胞(根据患者或患者的患病细胞的hla配型)一样且未以别的方式使之不合格的hla等位基因和hla等位基因组合中的最高相对活性的指标有关。不管什么原因如果已知受限于该hla等位基因或hla等位基因组合的t细胞系不适用于治疗性给予，则hla等位基因或hla等位基因组合被视为“以别的方式使之不合格”。例如，如果在细胞系样品中观察到试验性选择的t细胞系没有或具有太少的活细胞，则hla等位基因或hla等位基因组合(这类t细胞系受其限制)可被视为不合格。再举例来说，如果活性示图中的相对活性基于活性的体外或离体测定法，且已知受限于特定hla等位基因或hla等位基因组合的t细胞系的相对体内活性与用于产生活性示图的相对体外或离体测定法无关，使得活性示图中的最高相对活性不是最高相对体内活性，则特定的hla等位基因或hla等位基因组合(这类t细胞系受其限制)可被视为不合格。例如，观察到对于受限于hla
‑
b35的t细胞系，针对人类患者的cmv感染的体内活性在临床上是无效的(因此可忽略的相对体内活性)，尽管来源于受限于hla
‑
b35的t细胞系的干扰素
‑
γ分泌cd3+t细胞的百分比表明高得多的相对活性；因此，在治疗cmv感染的情况下，如果试验性选择受限于hla
‑
b35的t细胞系，则优选hla
‑
b35可为“以别的方式使之不合格”。通过使用要求保护的方法，待选择的t细胞系对病原体或癌症的表位有特异性，所述表位由同与患者的hla等位基因或hla等位基因组合中的最高活性有关的患者共有的hla等位基因或hla等位基因组合提呈。在一个相对具体的实施方案中，如果已知受限于hla等位基因或hla等位基因组合的t细胞系在携带/患有病原体或癌症的患者的治疗中是临床上无效的，则hla等位基因或hla等位基因组合被视为不合格。
50.在另一个实施方案中，本发明提供的方法是选择候选同种异体t细胞系用于治疗性给予携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的人类患者的方法，所述方法包括：使用活性示图选择与识别病原体或癌症的抗原的至少一个表位的患者是同种异体的t细胞系，所述活性示图(i)鉴定多个hla等位基因和任选hla等位基因组合，和(ii)揭示各个识别病原体或癌症的抗原的至少一个表位并受限于大量hla等位基因或hla等位基因组合的不同hla等位基因或hla等位基因组合的t细胞系的相对活性的指标；其中在示图中各个鉴定的hla等位基因或hla等位基因组合与受限于hla等位基因或hla等位基因组合的t细胞系的相对活性的相应指标有关，所述相对活性是由t细胞系显示的针对病原体或针对癌症的已知
活性的相对度量；其中(a)所选的t细胞系具有与患者或患者的患病细胞(例如癌症或与病原体的存在有关的患病细胞)一样的通过示图鉴定的t细胞系的识别受其限制的hla等位基因或hla等位基因组合；和(b)所选的t细胞系受其限制的hla等位基因或hla等位基因组合，在示图中与在示图中已知与患者或患者的患病细胞(根据患者或患者的患病细胞的hla配型)一样的hla等位基因和hla等位基因组合中的最高相对活性的指标有关。
51.在某些实施方案中，所述方法进一步包括在选择步骤之前制作活性示图的步骤。下面描述了可用于制作活性示图的方法。在某些实施方案中，所述方法进一步包括在制作步骤之前测量相对活性的步骤。在某些实施方案中，所述方法进一步包括在选择步骤之前确定患者或患者的患病细胞的hla配型的步骤。
52.在具体的实施方案中，所选的t细胞系识别病原体或癌症的抗原的至少一个表位，所述至少一个表位由与患者或患者中的患病细胞一样的hla等位基因或hla等位基因组合提呈，其中hla等位基因或hla等位基因组合与在患者或患者的患病细胞(且如上所述未以别的方式使之不合格)的hla等位基因和hla等位基因组合中的最高相对活性的指标有关。在这类实施方案的一个优选的方面，相对活性是t细胞系在携带/患有病原体或癌症的患者的治疗中的体内临床功效。
53.在本文所述方法的具体实施方案中，至少一个表位是至少一个免疫显性表位。
54.在本发明方法的某些实施方案中，所选的t细胞系具有与患者或患者的患病细胞(例如癌症或与病原体的存在有关的患病细胞)一样的由活性示图鉴定的t细胞系的识别受其限制的hla等位基因或hla等位基因组合。在一些实施方案中，患者是移植接受者。在其中患者是移植接受者的一个具体实施方案中，与患者或患者的患病细胞(例如癌性或受病原体感染的细胞)一样的hla等位基因或hla等位基因组合是指与移植之前和/或之后的患者一样的hla等位基因或hla等位基因组合。在一些实施方案中，患者的患病细胞来源于给予患者的移植物，因此表达移植物的hla等位基因；在这类实施方案中，测定患者的患病细胞的hla配型可通过对给予患者的移植物中的hla等位基因分型来进行。在其它实施方案中，患者的患病细胞不来源于给予患者的移植物，因此具有移植前的患者的hla配型。在具体的实施方案中，移植是hsct或实体器官移植。
55.5.1.1.t细胞系的产生
56.可按本文所述制备由其选择用于治疗性给予和/或使用以获得制图信息的t细胞系。识别病原体或癌症的抗原的至少一个表位的t细胞系可通过本领域已知或本文描述的任何方法产生。产生病原体或癌症的抗原的至少一个表位的t细胞系的非限制示例性方法可见于trivedi,d.等,blood,2005.105:2793
‑
2801；koehne,g.等,blood,2000.96:109
‑
117；koehne,g.等,blood,2002.99:1730
‑
1740；doubrovina,e.等,blood,2012.119:2644
‑
2656；barker,j.n.等,blood,2010.116:5045
‑
5049；o’reilly,r.j.等,immunol res,2007.38:237
‑
250；和o’reilly,r.j.等,best practice&research clinical haematology,2011.24:381
‑
391。
57.在某些实施方案中，t细胞系通过将来自血清反应阳性供体的t细胞用呈递显示(患者的)病原体或癌的抗原性的抗原的一种或多种肽的抗原呈递细胞刺激t细胞来产生。优选抗原呈递细胞对t细胞是自体的(因此来源于t细胞的供体)。在具体的实施方案中，t细胞用加载病原体或癌症的一个或多个抗原的肽库的树突细胞刺激。在一些实施方案中，树
突细胞来源于t细胞的供体。在具体的实施方案中，t细胞用加载病原体或癌症的一个或多个抗原的肽库的细胞因子激活的单核细胞(cams)刺激。在一些实施方案中，cams来源于t细胞的供体。在具体的实施方案中，t细胞用加载病原体或癌症的一个或多个抗原的肽库的外周血单核细胞(pbmc)刺激。在一些实施方案中，pbmc来源于t细胞的供体。在某些实施方案中，t细胞系通过用加载病原体或癌症的一个或多个抗原的肽库的b淋巴细胞细胞系(blcl)刺激t细胞来产生。在一些实施方案中，blcl来源于t细胞的供体。在具体的实施方案中，blcl是来源于t细胞的供体的ebv转化的blcl。在某些实施方案中，t细胞系通过用加载病原体或癌症的一个或多个抗原的肽库的人工抗原呈递细胞(aapc)刺激t细胞来产生。
58.在不同的实施方案中，肽库是跨越病原体或癌症的抗原的重叠肽库。在不同的实施方案中，肽库是跨越病原体或癌症的一个以上抗原的重叠肽库。在一个具体的实施方案中，重叠肽库是重叠十五肽库。
59.在某些实施方案中，t细胞系通过用经基因工程改造表达病原体的至少一个免疫原性肽或蛋白质的aapc刺激t细胞来产生。在某些实施方案中，t细胞系通过用病毒转化的blcl刺激t细胞来产生，其中病毒是病原体。
60.在一些实施方案中，将t细胞在培养物中刺激28
‑
40天的一段时间。在具体的实施方案中，在il
‑
2存在下刺激t细胞。在不同的实施方案中，在刺激后，将t细胞系冷藏保存。在一个具体的实施方案中，其中t细胞系按照要求保护的方法选择、被冷藏保存时，在治疗性给予之前使t细胞系融化。在又一个具体的实施方案中，融化的t细胞系任选在治疗性给予之前在培养物中扩增。
61.在不同的实施方案中，用于产生t细胞系的t细胞通过本领域已知方法纯化。在某些实施方案中，t细胞从自pbmc分离的外周血淋巴细胞中富集。在一些实施方案中，通过消耗贴壁的单核细胞接着消耗天然杀伤细胞从自pbmc分离的外周血淋巴细胞中富集t细胞。
62.可用于刺激t细胞以产生识别病原体或癌症的抗原的至少一个表位的t细胞系的树突细胞可来源于细胞因子激活的单核细胞(cams)。在一些实施方案中，cams通过将pbmc与例如gm
‑
csf、il
‑
4、tnf
‑
α、il
‑
1β、il
‑
6和/或前列腺素
‑
e2等细胞因子一起孵育来产生。
63.可采用本领域已知的任何方法，例如koehne,g.等,blood,2000.96:109
‑
117或koehne,g.等,blood,2002.99:1730
‑
1740所述，从pbmc产生可用于刺激t细胞以产生识别病原体或癌症的抗原的至少一个表位的t细胞系的blcl。
64.可通过本领域已知的任何方法，例如trivedi,d.等,blood,2005.105:2793
‑
2801；barker,j.n.等,blood,2010.116:5045
‑
5049；hasan,a.n.等,j immunol,2009.183:2837
‑
2850或doubrovina,e.等,blood,2012.120:1633
‑
1646所述，测定识别病原体或癌症的抗原的至少一个表位的所产生的t细胞系的每个受其限制的hla等位基因或hla等位基因组合。
65.5.1.2.确定hla配型
66.确定hla配型(即对hla基因座分型)的步骤可通过本领域已知的任何方法进行。确定hla配型的非限制示例性方法可见于lange,v.等,bmc genomics,2014.15:63；erlich,h.,tissue antigens,2012.80:1
‑
11；bontadini,a.,methods,2012.56:471
‑
476；dunn,p.p.,int j immunogenet,2011 38:463
‑
473；以及hurley,c.k.,“dna
‑
based typing of hla for transplantation.”载于leffell,m.s.等编辑,handbook of human immunology,1997.boca raton:crc press。在一些实施方案中，确定hla配型的步骤包括对至少4个hla
基因座分型，优选hla
‑
a、hla
‑
b、hla
‑
c和hla
‑
drb1。在一些实施方案中，确定hla配型的步骤包括对4个hla基因座分型，优选hla
‑
a、hla
‑
b、hla
‑
c和hla
‑
drb1。在一些实施方案中，确定hla配型的步骤包括对至少6个hla基因座分型。在一些实施方案中，确定hla配型的步骤包括对6个hla基因座分型。在一些实施方案中，确定hla配型的步骤包括对至少8个hla基因座分型。在一些实施方案中，确定hla配型的步骤包括对8个hla基因座分型。在一些实施方案中，确定hla配型的步骤包括对所有已知的hla基因座分型。在一些实施方案中，确定hla配型的步骤包括对少于全部已知的hla基因座分型。
67.一般而言，实施本发明优选对较多个hla基因座分型，因为被分型的hla基因座越多，相对于具有与患者或患者的患病细胞一样的hla等位基因或hla等位基因组合的其它同种异体t细胞系，所选的同种异体t细胞系越可能具有最高活性。
68.5.1.3.用于选择t细胞系的活性示图制作
69.活性示图鉴定多个hla等位基因和任选hla等位基因组合，并揭示(i)各个识别(患者的)病原体或癌症的抗原的至少一个表位，和(ii)受限于大量hla等位基因或hla等位基因组合的不同hla等位基因或hla等位基因组的t细胞系的相对活性的指标。在活性示图中，各个鉴定的hla等位基因或hla等位基因组合与受限于hla等位基因或hla等位基因组合的t细胞系的相对活性的相应指标有关，所述相对活性是由t细胞系显示的针对病原体或针对癌症的已知活性的相对度量。
70.t细胞系的相对活性可通过本领域已知的任何体外、离体或体内方法获得。
71.在优选的实施方案中，以t细胞系在携带/患有病原体或癌症的患者的治疗中的体内临床功效测量相对活性。在这类实施方案的具体方面，可以在用t细胞系治疗后达到完全缓解(cr)的携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的患者的百分比测量相对活性。在具体的实施方案中，以在用t细胞系治疗后达到cr或部分缓解(pr)的携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的患者的百分比测量相对活性。
72.在一些实施方案中，以在用呈递显示病原体或癌症的抗原性的一种或多种肽的抗原呈递细胞刺激时来源于各t细胞系的干扰素
‑
γ
‑
产生cd3+细胞的百分比测量相对活性。在具体的实施方案中，其中抗原是cmv或ebv，按自koehne,g.等,blood,2002.99:1730
‑
1740或waldrop,s.l.等,j clin invest,1997.99:1739
‑
1750改进和描述的方法测量相对活性。
73.在一些实施方案中，按当暴露于按照本领域已知方法进行的细胞毒性测定法中的各t细胞系时裂解的、表达病原体或癌症的抗原的细胞的百分比测量相对活性。
74.按照本发明，不以被各t细胞系识别的表位与提呈表位的hla等位基因的结合亲和力测量相对活性。
75.在一些方面，活性示图是通过相对活性排序的多个hla等位基因和任选hla等位基因组合的列表。在一些实施方案中，通过检查通过相对活性排序的大量hla等位基因和任选hla等位基因组合的一览表，其中一览表中的最高分层为最高相对活性的指标；确定已知与患者或患者的患病细胞一样的最高排序的hla等位基因或hla等位基因组合；并选择受限于hla等位基因或hla等位基因组合的同种异体t细胞系，来进行选择同种异体t细胞系的步骤。举例来说，在一个具体的实施方案中，活性示图是表6所示一览表。
76.在一些方面，活性示图是列举了多个hla等位基因和任选hla等位基因组合的数据库(例如表)，每一个与表明相对活性的评分有关。在一些实施方案中，通过检查多个hla等
位基因和任选hla等位基因组合的数据库一览表，每一个与表明相对活性的评分有关，其数据库中的最高评分为最高相对活性的指标；测定已知与患者或患者的患病细胞一样的最高得分的hla等位基因或hla等位基因组合；并选择受限于hla等位基因或hla等位基因组合的同种异体t细胞系，来进行选择同种异体t细胞系的步骤。在一个具体的实施方案中，可通过先滤出(排除)数据库中与患者或患者的患病细胞不一样的所有hla等位基因和hla等位基因组合，然后在余下的当中测定与最高相对活性的指标有关的hla等位基因或hla等位基因组合，然后选择受限于该hla等位基因或hla等位基因组合的同种异体t细胞系，来进行使用活性示图(即这类数据库)选择同种异体t细胞系的步骤。
77.在一些方面，活性示图是散点图。在某些实施方案中，散点图的第一轴表示大量hla等位基因和任选hla等位基因组合中的hla等位基因和任选hla等位基因组合的不同的hla等位基因和任选hla等位基因组合。在某些实施方案中，散点图的第二轴表示相对活性。在一个具体的实施方案中，散点图的第二轴表示在用呈递显示病原体或癌症的抗原性的一种或多种抗原的一种或多种肽的抗原呈递细胞刺激时，来源于在活性示图中揭示针对其的相对活性的指标的各t细胞系的干扰素
‑
γ
‑
分泌cd3+细胞的百分比。在一个具体的实施方案中，刺激是用对各个t细胞系是自体的并负载显示病原体或癌症的抗原性的一种或多种肽的抗原呈递细胞，作为所述相对活性的指标。举例来说，在一个具体的实施方案中，活性示图是图1所示的散点图。
78.在一些实施方案中，活性示图存储在数据库中。
79.在不同的实施方案中，选择同种异体t细胞系的方法是计算机执行的。在一些实施方案中，选择同种异体t细胞系的方法是使用第5.6节描述的计算机系统经计算机执行的。在一些实施方案中，选择同种异体t细胞系的方法是使用第5.6节描述的可读介质经计算机执行的。
80.一旦可获得其它数据，便可使用其它数据更新活性示图。
81.5.2.所选t细胞系的治疗应用
82.本文还提供治疗携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的人类患者的方法，所述方法包括：(a)按照第5.1节所述选择同种异体t细胞系的方法的任一种，选择同种异体t细胞系用于治疗性给予患者；和(b)将来源于所选的同种异体t细胞系的t细胞群给予患者。因此，在患有癌症的患者中，本发明提供治疗癌症的方法；在携带病原体的患者中，本发明提供治疗与病原体的存在有关的疾病、病症或病况的方法。
83.在某些实施方案中，给予通过来源于所选的同种异体t细胞系的t细胞群的输注。在一些实施方案中，给予通过来源于所选的同种异体t细胞系的t细胞群的静脉内推注。可根据患者的病况和医生的知识确定待给予的量。在某些实施方案中，给药包括将至少约1x105个t细胞/kg/剂量/周给予患者，其中t细胞群来源于所选的同种异体t细胞系。在一些实施方案中，给药包括将约1x106‑
2x106个t细胞/kg/剂量/周给予患者，其中t细胞群来源于所选的同种异体t细胞系。在一些实施方案中，给药包括将约1x106个细胞/kg/剂量/周给予患者，其中t细胞群来源于所选的同种异体t细胞系。在一些实施方案中，给药包括将约2x106个t细胞/kg/剂量/周给予患者，其中t细胞群来源于所选的同种异体t细胞系。在某些实施方案中，上述剂量方案进行至少3周，使得给予至少3次剂量。在一些实施方案中，上述剂量方案进行3周，使得给予至少3次剂量。在一些实施方案中，上述剂量方案进行6周，使得
给予6次剂量。在某些实施方案中，上述剂量方案进行3周，使得给予至少3次剂量，通过另一个剂量方案给予来源于所选的同种异体t细胞系的t细胞群至少一个周，其中第二剂量方案为约1x107个t细胞/kg/剂量/周。在某些实施方案中，上述剂量方案进行3周，使得给予至少3次剂量，通过另一个剂量方案给予来源于所选的同种异体t细胞系的t细胞群3周，其中第二剂量方案为约1x107个t细胞/kg/剂量/周。在某些实施方案中，其中患者患有癌症，给予约1x108‑
1x109个t细胞/kg/剂量/周的5个重复输注剂量。
84.5.3.用于过继细胞疗法的t细胞供体的选择
85.本文还提供选择从其得到同种异体t细胞系用于治疗性给予携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的人类患者的同种异体t细胞供体的方法。
86.5.3.1.根据活性示图的t细胞供体的选择
87.在不同的方面，选择从其得到同种异体t细胞系用于治疗性给予携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的人类患者的同种异体t细胞供体的方法包括：使用活性示图选择对患者是同种异体的t细胞供体，所述活性示图(i)鉴定多个hla等位基因和任选hla等位基因组合，和(ii)揭示各个识别病原体或癌症的抗原的至少一个表位并受限于大量hla等位基因或hla等位基因组合的不同hla等位基因或hla等位基因组合的t细胞系的相对活性的指标；其中在示图中各个鉴定的hla等位基因或hla等位基因组合与受限于hla等位基因或hla等位基因组合的t细胞系的相对活性的相应指标有关，所述相对活性是由t细胞系显示的针对病原体或针对癌症的已知活性的相对度量；其中(a)所选的t细胞供体具有与患者或患者的患病细胞(例如癌症或与病原体的存在有关的患病细胞)一样的至少一个hla等位基因或hla等位基因组合；和(b)与患者或患者的患病细胞一样的至少一个hla等位基因或hla等位基因组合之一在示图中与在活性示图中已知与患者或患者的患病细胞一样且未以别的方式使之不合格的hla等位基因和hla等位基因组合中的最高相对活性的指标有关。不管什么原因如果已知受限于该hla等位基因或hla等位基因组合的t细胞系不适用于治疗性给予，则hla等位基因或hla等位基因组合被视为“以别的方式使之不合格”。例如，如果活性示图中的相对活性基于活性的体外或离体测定法，且已知受限于特定hla等位基因或hla等位基因组合的t细胞系的相对体内活性与用于产生活性示图的相对体外或离体测定法无关，使得活性示图中的最高相对活性不是最高相对体内活性，则特定的hla等位基因或hla等位基因组合(这类t细胞系受其限制)可被视为不合格。例如，观察到对于受限于hla
‑
b35的t细胞系，针对人类患者的cmv感染的体内活性在临床上是无效的(因此是可忽略的相对体内活性)，尽管来源于受限于hla
‑
b35的t细胞系的干扰素
‑
γ分泌cd3+t细胞的百分比表明高得多的相对活性；因此，在治疗cmv感染的情况下，如果试验性地选择具有hla
‑
b35的t细胞供体，则优选hla
‑
b35可为“以别的方式不合格”。在一个相对具体的实施方案中，如果已知受限于hla等位基因或hla等位基因组合的t细胞系在携带/患有病原体或癌症的患者的治疗中是临床上无效的，则hla等位基因或hla等位基因组合会被认为不合格。
88.在另一个实施方案中，本发明提供的方法是选择从其得到同种异体t细胞系用于治疗性给予携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的人类患者的候选同种异体t细胞供体的方法，所述方法包括：使用活性示图选择对患者是同种异体的t细胞供体，所述活性示图(i)鉴定多个hla等位基因和任选hla等位基因组合，和(ii)揭示各个识别病原体或癌症的抗原的至少一个表位并受限于大量hla等位基因或hla等位基因组合的不同hla等位基因
或hla等位基因组合的t细胞系的相对活性的指标；其中在示图中各个鉴定的hla等位基因或hla等位基因组合与受限于hla等位基因或hla等位基因组合的t细胞系的相对活性的相应指标有关，所述相对活性是由t细胞系显示的针对病原体或针对癌症的已知活性的相对度量；其中(a)所选的t细胞供体具有与患者或患者的患病细胞(例如癌症或与病原体的存在有关的患病细胞)一样的至少一个hla等位基因或hla等位基因组合；和(b)与患者或患者的患病细胞一样的至少一个hla等位基因或hla等位基因组合之一在示图中与在活性示图中已知与患者或患者的患病细胞一样的hla等位基因和hla等位基因组合中的最高相对活性的指标有关。
89.在某些实施方案中，所述方法进一步包括在选择步骤之前制作活性示图的步骤。可用于制作活性示图的方法描述于第5.1.3节。在某些实施方案中，所述方法进一步包括在制作步骤之前测量相对活性的步骤。在某些实施方案中，所述方法进一步包括在选择步骤之前确定患者或患者的患病细胞的hla配型的步骤。在某些实施方案中，所述方法进一步包括在选择步骤之前确定t细胞供体的hla配型的步骤。在某些实施方案中，所述方法进一步包括在选择步骤之前确定患者或患者的患病细胞的hla配型的步骤和t细胞供体的hla配型。
90.在具体的实施方案中，所选的t细胞供体具有与患者或患者的患病细胞一样的至少一个hla等位基因或hla等位基因组合，其中至少一个hla等位基因或hla等位基因组合之一与在患者的hla等位基因和hla等位基因组合(且如上所述未以别的方式使之不合格)中的最高相对活性的指标有关。在这类实施方案的一个优选的方面，相对活性是t细胞系在携带/患有病原体或癌症的患者的治疗中的体内临床功效。
91.在本文所述方法的具体实施方案中，至少一个表位是至少一个免疫显性表位。
92.在本发明方法的某些实施方案中，所选的t细胞供体具有与患者或患者的患病细胞(例如癌症或与病原体的存在有关的患病细胞)一样的至少一个hla等位基因或hla等位基因组合。在一些实施方案中，患者是移植接受者。在其中患者是移植接受者的一个具体实施方案中，与患者或患者的患病细胞(例如癌性或受病原体感染的细胞)一样的hla等位基因或hla等位基因组合是指与移植之前和/或之后的患者一样的hla等位基因或hla等位基因组合。在一些实施方案中，患者的患病细胞来源于给予患者的移植物，因此表达移植物的hla等位基因；在这类实施方案中，测定患者的患病细胞的hla配型可通过对给予患者的移植物中的hla等位基因分型来进行。在其它实施方案中，患者的患病细胞不来源于给予患者的移植物，因此具有移植前的患者的hla配型。在具体的实施方案中，移植是hsct或实体器官移植。
93.可按第5.1.1节制备用于制作活性示图的t细胞系。
94.确定hla配型的步骤可按第5.1.2节所述进行。一般而言，对于实施本发明，优选对更多的hla基因座分型，因为经分型的hla基因座越多，相对于来源于具有与患者或患者的患病细胞一样的至少一个hla等位基因或hla等位基因组合的其它t细胞供体的其它同种异体t细胞系，越可能所选的t细胞供体可得到具有最高活性的同种异体t细胞系。
95.5.3.1.1.用于选择供体的活性示图的产生
96.活性示图可按与第5.1.3节讨论的一致并可按本文所述制作。
97.在一些方面，活性示图是通过相对活性排序的多个hla等位基因和任选hla等位基
因组合的列表。在一些实施方案中，选择同种异体t细胞供体的步骤如下进行：检查通过相对活性排序的大量hla等位基因和任选hla等位基因组合的一览表，其中一览表中的最高分层为最高相对活性的指标；确定已知与患者或患者的患病细胞一样的最高排序的hla等位基因或hla等位基因组合；并选出具有该hla等位基因或hla等位基因组合的同种异体t细胞供体。举例来说，在一个具体的实施方案中，活性示图是表6所示一览表。
98.在一些方面，活性示图是列举了多个hla等位基因和任选hla等位基因组合的数据库(例如表)，每一个与表明相对活性的评分有关。在一些实施方案中，选择同种异体t细胞供体的步骤如下进行：通过检查多个hla等位基因和任选hla等位基因组合的数据库一览表，每一个与表明相对活性的评分有关，其数据库中的最高评分为最高相对活性的指标；测定已知与患者或患者的患病细胞一样的最高得分的hla等位基因或hla等位基因组合；并选出具有该hla等位基因或hla等位基因组合的同种异体t细胞供体。在一个具体的实施方案中，使用活性示图(即这类数据库)选择同种异体t细胞供体的步骤可如下进行：先滤出(排除)数据库中与患者或患者的患病细胞不一样的所有hla等位基因和hla等位基因组合，然后在余下的当中测定与最高相对活性的指标有关的hla等位基因或hla等位基因组合，然后选出具有该hla等位基因或hla等位基因组合的同种异体t细胞供体。
99.在一些方面，活性示图是散点图。在某些实施方案中，散点图的第一轴表示大量hla等位基因和任选hla等位基因组合中的hla等位基因和任选hla等位基因组合的不同的hla等位基因和任选hla等位基因组合。在某些实施方案中，散点图的第二轴表示相对活性。在一个具体的实施方案中，散点图的第二轴表示在用呈递显示病原体或癌症的抗原性的一种或多种抗原的一种或多种肽的抗原呈递细胞刺激时，来源于在活性示图中揭示针对其的相对活性的指标的各t细胞系的干扰素
‑
γ
‑
分泌cd3+细胞的百分比。在一个具体的实施方案中，刺激是用对各个t细胞系是自体的并负载显示病原体或癌症的抗原性的一种或多种肽的抗原呈递细胞，作为所述相对活性的指标。举例来说，在具体的实施方案中，活性示图是图1所示的散点图。
100.在一些实施方案中，活性示图存储在数据库中。
101.在不同的实施方案中，选择本文所述同种异体t细胞供体的方法是计算机执行的。在一些实施方案中，选择本文所述同种异体t细胞供体的方法是使用第5.6节描述的计算机系统经计算机执行的。在一些实施方案中，选择第5.3.1节所述同种异体t细胞供体的方法是使用第5.6节描述的可读介质经计算机执行的。
102.一旦可获得其它数据，则其它数据可用来制作活性示图。
103.5.3.2.基于频率示图的t细胞供体的选择
104.在不同的方面，选择从其得到同种异体t细胞系用于治疗性给予携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的人类患者的同种异体t细胞供体的方法包括：使用示图(下称“频率示图”)，选择对与患者或患者的患病细胞(例如癌症或与病原体的存在有关的患病细胞)具有一样的一个或多个hla等位基因的患者是同种异体的t细胞供体，所述图(i)鉴定多个hla等位基因，和(ii)揭示各个识别病原体或癌症的抗原的至少一个表位并受限于多个所述hla等位基因的不同hla等位基因的t细胞系产生的相对频率的指标；其中在示图中各个鉴定的hla等位基因与受限于hla等位基因的所述t细胞系产生的相对频率的相应指标有关，其中：所选的t细胞供体具有与在示图中同与患者或患者的患病细胞不一样的供体的
hla等位基因相比与产生的较高频率的指标有关的患者或患者的患病细胞一样的至少一个hla等位基因。
105.在另一个实施方案中，本发明提供的方法是选择从其获得同种异体t细胞系用于治疗性给予携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的人类患者的候选同种异体t细胞供体的方法，所述方法包括：使用频率示图，选择对具有与患者或患者的患病细胞(例如癌症或与病原体的存在有关的患病细胞)一样的一个或多个hla等位基因的患者是同种异体的t细胞供体，所述频率示图(i)鉴定多个hla等位基因，和(ii)揭示各个识别病原体或癌症的抗原的至少一个表位并受限于多个所述hla等位基因的不同hla等位基因的t细胞系产生的相对频率的指标；其中在示图中各个鉴定的hla等位基因与受限于hla等位基因的所述t细胞系产生的相对频率的相应指标有关，其中：所选的t细胞供体具有与在示图中同与患者或患者的患病细胞不一样的供体的hla等位基因相比与产生的较高频率的指标有关的患者或患者的患病细胞一样的至少一个hla等位基因。
106.在某些实施方案中，所述方法进一步包括在选择步骤之前制作频率示图的步骤。可用于制作频率示图的方法如下所述。在某些实施方案中，所述方法进一步包括在制作步骤之前测量相对频率的步骤。在某些实施方案中，所述方法进一步包括在选择步骤之前确定患者或患者的患病细胞的hla配型的步骤。在某些实施方案中，所述方法进一步包括在选择步骤之前确定t细胞供体的hla配型的步骤。在某些实施方案中，所述方法进一步包括在选择步骤之前确定患者或患者的患病细胞的hla配型和t细胞供体的hla配型的步骤。
107.在本文所述方法的具体实施方案中，至少一个表位是至少一个免疫显性表位。
108.在本发明方法的某些实施方案中，所选的t细胞供体具有与频率示图中同与患者或患者的患病细胞不一样的供体的hla等位基因相比产生的较高频率的指标有关的患者或患者的患病细胞(例如癌症或与病原体的存在有关的患病细胞)一样的至少一个hla等位基因。在一些实施方案中，患者是移植接受者。在其中患者是移植接受者的一个具体实施方案中，与患者或患者的患病细胞(例如癌性或受病原体感染的细胞)一样的hla等位基因是指与患者在移植之前和/或之后一样的hla等位基因。在一些实施方案中，患者的患病细胞来源于给予患者的移植物，因此表达移植物的hla等位基因；在这类实施方案中，测定患者的患病细胞的hla配型可通过对给予患者的移植物中的hla等位基因分型来进行。在其它实施方案中，患者的患病细胞不来源于给予患者的移植物，因此具有移植前的患者的hla配型。在具体的实施方案中，移植是hsct或实体器官移植。
109.可按第5.1.1节所述制备用于制作频率示图的t细胞系。
110.确定hla配型的步骤可按第5.1.2节所述进行。一般而言，对于实施本发明优选对更多的hla基因座分型。
111.确定hla配型的步骤可按第5.1.2节所述进行。
112.5.3.2.1.用于选择供体的频率示图的产生
113.频率示图鉴定多个hla等位基因，并揭示t细胞系产生的相对频率的指标，所述t细胞系(i)各个识别(患者的)病原体或癌症的抗原的至少一个表位，和(ii)受限于hla等位基因的不同hla等位基因。在频率示图中，各个鉴定的hla等位基因与受限于hla等位基因的t细胞系产生的相对频率的相应指标有关。
114.在一些方面，频率示图是通过相对频率排序的多个hla等位基因的列表。在一些实
施方案中，选择同种异体t细胞供体的步骤如下进行：通过检查通过相对频率排序的多个hla等位基因的列表，其一览表中的最高分层为最高相对频率的指标；并选出同种异体t细胞供体，所述供体与在列表中同与患者或患者的患病细胞不一样的供体的hla等位基因相比的较高等级有关的患者或患者的患病细胞一样的至少一个hla等位基因。
115.在一些方面，频率示图是列出大量hla等位基因的数据库(例如表)，每一个与表示相对频率的评分有关。在一些实施方案中，选择同种异体t细胞供体的步骤如下进行：通过检查列出hla等位基因的数据库，每一个与表示相对频率的评分有关，其数据库中的最高评分为最高相对频率的指标；并选出同种异体t细胞供体，所述供体与数据库中同与患者或患者的患病细胞不一样的供体的hla等位基因相比的较高评分有关的患者或患者的患病细胞一样的至少一个hla等位基因。
116.在一些实施方案中，频率示图存储在数据库中。
117.在不同的实施方案中，选择本公开内容所述的同种异体t细胞供体的方法是计算机执行的。在一些实施方案中，选择本公开内容所述的同种异体t细胞供体的方法是使用第5.6节描述的计算机系统经计算机执行的。在一些实施方案中，选择本公开内容所述的同种异体t细胞供体的方法是使用第5.6节描述的可读介质经计算机执行的。
118.一旦可获得其它数据，则可使用其它数据更新频率示图。
119.5.4.获得t细胞系
120.本文还描述了获得同种异体t细胞系用于治疗性给予携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的人类患者的方法，所述方法包括：(a)按照第5.3节中所述方法选择同种异体t细胞供体；和(b)从所选的同种异体t细胞供体得到同种异体t细胞系，所述同种异体t细胞系识别病原体或癌症的抗原的至少一个表位。
121.5.5.患者
122.本公开内容提及的患者是人类患者。
123.在不同的实施方案中，患者曾是移植的接受者。在一个具体的实施方案中，移植是hsct。在某些实施方案中，hsct是骨髓移植(bmt)。在某些实施方案中，hsct是外周血干细胞移植(pbsct)。在某些实施方案中，hsct是脐带血移植(cbt)。在一个具体的实施方案中，移植是实体器官移植。
124.在不同的实施方案中，患者不是移植的接受者。在一个具体的实施方案中，患者不是hsct的接受者。在一个具体的实施方案中，患者不是实体器官移植的接受者。
125.在不同的方面，患者携带或疑似携带病原体。在一个具体的实施方案中，患者携带病原体。在一个具体的实施方案中，患者对病原体呈血清反应阳性，并具有由病原体感染的症状。病原体可以是病毒、细菌、真菌、寄生虫或原生生物。在某些实施方案中，病原体是病毒。
126.在一些实施方案中，病毒是巨细胞病毒(cmv)。在具体的实施方案中，患者在患者进行hsct后携带或疑似携带cmv感染。在具体的实施方案中，cmv的抗原是cmv pp65。在具体的实施方案中，cmv的抗原是cmv ie1。
127.在一些实施方案中，病毒是eb病毒(ebv)。在具体的实施方案中，ebv的抗原是ebna1、ebna2、ebna3a、ebna3b、ebna3c、lmp1或lmp2。
128.在一些实施方案中，病毒是多瘤bk病毒(bkv)、john cunningham病毒(jcv)、疱疹
病毒、腺病毒(adv)、人免疫缺陷病毒(hiv)、流感病毒、埃博拉病毒、痘病毒、棒状病毒或副黏病毒。在具体的实施方案中，病毒是bkv。在具体的实施方案中，病毒是jcv。在具体的实施方案中，病毒是adv。在具体的实施方案中，病毒是人疱疹病毒
‑
6(hhv
‑
6)或人疱疹病毒
‑
8(hhv
‑
8)。
129.在一个实施方案中，患者患有对抗病毒(小分子)药物疗法不起反应的病毒感染。
130.在不同的方面，患者患有或疑似患有癌症。在一个具体的实施方案中，患者患有癌症。癌症可包括血液、乳腺、肺、卵巢、胃、胰腺、喉、食管、睾丸、肝、腮腺、胆管、结肠、直肠、宫颈、子宫、子宫内膜、肾、膀胱、前列腺、甲状腺、脑或皮肤的癌症。在一些实施方案中，癌症是血癌。在具体的实施方案中，癌症是淋巴增殖性病症。在其它实施方案中，癌症是脑癌。
131.在一些实施方案中，癌症是wt1阳性癌症。在具体的实施方案中，癌症的抗原是wt1。
132.在一些实施方案中，癌症是ebv阳性移植后淋巴增殖性病症(ebv
‑
ptld)。在具体的实施方案中，ebv
‑
ptld的抗原是ebna1、ebna2、ebna3a、ebna3b或ebna3c。在其它具体的实施方案中，抗原是lmp1或lmp2。
133.在一些实施方案中，癌症是ebv阳性鼻咽癌。在具体的实施方案中，ebv阳性鼻咽癌的抗原是ebna1、lmp1或lmp2。
134.如本文所述癌症的抗原可为癌症特异性或癌症相关抗原，因此可以是其表达在癌组织或癌细胞比在非癌组织或非癌细胞中高的肽或蛋白质或相对于非癌组织或非癌细胞只在癌组织或癌细胞表达的肽或蛋白质。
135.5.6.计算机系统和计算机可读介质
136.在不同的实施方案中，计算机系统或计算机可读介质经配置以按本公开内容所述进行选择同种异体t细胞系的方法的任一种和选择同种异体t细胞供体的任一种。
137.本文还提供用于选择同种异体t细胞系用于治疗性给予携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的人类患者的计算机系统。在一个具体的实施方案中，这类计算机系统包括：中央处理器；与中央处理器连接的存储器、用于进行按本公开内容所述选择同种异体t细胞系的方法的任一种或选择同种异体t细胞供体的方法的任一种的步骤的存储器存储指令。在一些实施方案中，计算机系统进一步包括与中央处理器有效通信的显示设备。
138.本文还提供计算机可读介质，其具有用于按本公开内容所述进行选择同种异体t细胞系的方法的任一种或选择同种异体t细胞供体的方法的任一种的步骤的计算机可执行指令。
139.在一些实施方案中，计算机系统或计算机可读介质所载入的为在本领域是标准的软件成分。软件成分共同使计算机按照本公开内容所述选择同种异体t细胞系的方法或选择同种异体t细胞供体的方法发挥功能。在一些实施方案中，计算机系统或计算机可读介质所载入的为在本领域是标准的软件成分和是本发明特有的一个或多个计算机程序产品。在具体的实施方案中，一个或多个计算机程序产品使计算机系统按照本公开内容所述选择同种异体t细胞系的方法或选择同种异体t细胞供体的方法发挥功能。在具体的实施方案中，是本发明特有的一个或多个计算机程序产品和在本领域是标准的软件成分共同使计算机系统按照本文所述的选择同种异体t细胞系的方法或选择同种异体t细胞供体的方法发挥功能。
140.在某些实施方案中，计算机系统或计算机可读介质经配置以选择同种异体t细胞系用于以高且一致的功效治疗性给予患者。在某些实施方案中，计算机系统或计算机可读介质经配置以选择同种异体t细胞供体，从其得到同种异体t细胞系用于以高且一致的功效治疗性给予患者。
141.6.实施例
142.通过以下非限制性实施例说明本文提供的某些实施方案，其表明根据由提呈免疫显性病毒肽的供体和接受者共有的hla等位基因的分层，允许从库存的hla部分匹配的第三方供体来源的t细胞系优化选择治疗活性的cmvpp65特异性t细胞用于治疗cmv感染的技术。
143.6.1.方法:
144.6.1.1.cmv ctl库的建立：
145.所有细胞产物根据标准操作程序(sop)和fda顺应式方案于memorial sloan kettering cancer center(mskcc)的gmp设施中进行。
146.6.1.1.1.自体细胞因子激活的单核细胞(cams)的产生：
147.使用聚蔗糖
‑
泛影葡胺(ficoll hypaque)通过密度梯度离心，从血清反应阳性供体的血液中分离外周血单核细胞(pbmc)。
148.允许pbmc以悬浮于含1％自体血清的rpm
‑
1640中的107/ml的浓度在37℃下在6孔组织培养板贴壁2小时，之后轻轻除去未贴壁的单核细胞。贴壁的单核细胞用2ml无血清imdm/孔培养，每隔一天补充gm
‑
csf 2000iu(50μl)和il
‑
4的il
‑
41000u(25μl)直到第5天。在第5天，加入肿瘤坏死因子
‑
α(sigma,st.louis)达到至10ng/ml、白介素
‑
1β至400iu/ml、白介素
‑
6(r&d systems，inc，minneapolis，mn usa)至1000iu/ml和前列腺素
‑
e2(calbiochem，la jolla，ca usa)至25mm/ml的终浓度以诱导cams最终的成熟。在第7天，如下所述收获成熟的cams，按其hla ii类的表达进行表征，通过facs对cd14和共刺激分子计数，等分并用于t细胞系的敏化。
149.6.1.1.2.自体转化的b淋巴细胞细胞系(blcl)的产生：
150.按之前所述，通过用ebv毒株b95.8感染pbmc，产生来自各供体的ebv
‑
blcl(koehne,g.等,blood,2000.96:109
‑
117；koehne,g.等,blood,2002.99:1730
‑
1740)。将细胞保持在补充10％胎牛血清(fcs)和阿昔洛韦的rpmi 1640(invitrogen，inc，carlsbad，ca usa)中。
151.6.1.1.3.cmvpp65特异性t细胞的产生：
152.通过使用用免疫磁性cd56预包被的微珠(miltenyi biotech inc.)对cd56+细胞进行免疫磁性分离，通过消耗贴壁的单核细胞接着消耗天然杀伤细胞，从自pbmc分离的外周血淋巴细胞富集t细胞。按之前所述，将纯化的t细胞与加载gmp级重叠十五肽(pl cam)库的受照射的自体cams共培养(trivedi,d.等,blood,2005.105:2793
‑
2801)。按之前所述，以效应物与刺激物20:1的比率，将t细胞在il
‑
2(5
‑
40u/ml)存在下培养28
‑
40天的时间，每周用加载受照射的自体肽的cams再刺激(trivedi,d.等,blood,2005.105:2793
‑
2801)。
153.6.1.2.cmvpp65特异性t细胞的表征：
154.6.1.2.1.四聚体分析：
155.使用针对分别携带肽序列nlvpmvatv、qydpvaalf和tprvtgggam的hla a0201、a2402和b0702的市售可获得的cmvpp65 mhc
‑
肽四聚体，使用hla
‑
肽四聚体定量测定
cmvpp65表位特异性t细胞的比例(beckman coulter，inc fullerton，ca)。使t细胞与cd3 fitc、cd8 pe、cd4 percp(bd bioscience，san jose，ca)和apc缀合的四聚体复合物在冰上孵育20分钟，洗涤，随后通过facs(bd lsr ii)分析。数据应用flowjo软件(tree star inc，ashland，or)分析。测定培养物中cd4和cd8+t细胞的比例以及cd3+和与hla
‑
肽四聚体结合的cd8+t细胞的比例。
156.6.1.2.2.tcr vβ库(repertoire)
157.按照生产商提供的程序(wei,s.等,immunogenetics,1994.40:27
‑
36)，使用含有人tcr vβ区的24个亚家族的抗体的市售可获得的试剂盒(io beta mark，beckman coulter，inc，france)，通过流式细胞术，针对tcrvβ库对cmv肽
‑
hla四聚体+t细胞进行分析。
158.6.1.2.3.cmv特异性和同种异体反应性ifn
‑
γ
‑
产生t细胞的量化
159.在开始和在各cmv特异性t细胞系发育中的几个点上，将1
×
106/ml浓度的供体t淋巴细胞与以5:1的效应物
‑
刺激物细胞比加载cmvpp65肽库(20ug/ml)的自体cams混合。平行设置含有效应细胞和未加载任何肽的pbmc的对照管。将布雷菲德菌素a以10μg/ml细胞的浓度加入未刺激和肽刺激的样品中。将管在潮湿的5％co2培养箱中在37℃下孵育过夜16小时。
160.将整批未刺激和受刺激培养物的等分试样转移到管中用于用单克隆抗体染色。将细胞用5μl用别藻蓝蛋白(apc)和10μl抗cd8多甲藻黄素叶绿素蛋白(percp)标记的单克隆抗cd3或抗cd4 percp(bd biosciences，san jose，ca)染色，并在室温下避光孵育20分钟。细胞用2ml磷酸缓冲盐水(pbs)
–
牛血清白蛋白(bsa)
–
叠氮化物(az)(pbs+0.5％bsa+0.1％az)洗涤。将细胞离心，弃去上清液，并将100μl试剂a(fix&perm cell permeabilization reagents a&b；caltag laboratories，burlingame，ca)加入各管中以固定细胞。然后将这些细胞孵育15分钟。将细胞用pbs+bsa+az洗涤，加入100μl试剂b(caltag laboratories)用于透化处理。通过加入10μl小鼠igg1同种型对照异硫氰酸荧光素(fitc)或ifn
‑
γfitc(bd pharmingen，san diego，ca)单克隆抗体，进行胞内染色。将细胞在室温下避光孵育20分钟，洗涤两次，进一步固定在1％福尔马林中。
161.随后使用具有10色彩能力的三激光的lsr ii流式细胞仪(bd biosciences)获得染色和固定的细胞，并应用flowjo软件分析。细胞先通过前向散射和侧向散射鉴定，然后通过对cd3 apc与侧向散射点图中的cd3+细胞进行选通鉴定。在综合门控中获得20,000
‑
50,000个事件。对于对细胞的进一步鉴定，进行了对cd3+cd8+或cd3+cd4+细胞的选通。根据未刺激对照和同种型对照管的分析，建立象限标志物。
162.6.1.3.确立分层：对不同cmvpp65表位的抗病毒cd8+t细胞应答的量化
163.6.1.3.1.使用重叠15aa肽的文库的表位作图
164.通过按照由koehne等(koehne,g.等,blood,2002.99:1730
‑
1740)改进的waldrop等(waldrop,s.l.等,j clin invest,1997.99:1739
‑
1750)的技术，通过测量用加载目标肽或肽库(pl)的自体apc继发刺激时产生的ifnγ阳性t细胞的数目，鉴定并量化cmv pp65内的特定肽的t细胞应答。一系列重叠肽库允许鉴定诱导t细胞应答的特定表位。对t细胞供体是自体的加载肽的pbmc、对t细胞供体是自体的cams或对t细胞供体是自体的blcl被用作apc以刺激响应性t细胞用于表位作图。
165.6.1.3.2.体外细胞毒性活性
166.如前所述，采用标准
51
铬释放测定法，针对其裂解加载cmvpp65的靶标的能力，评价所有的t细胞系(koehne,g.等,blood,2002.99:1730
‑
1740；trivedi,d.等,blood,2005.105:2793
‑
2801)。用于全部实验的靶标由一组ebv
‑
blcl组成，其各自与指定供体的t细胞共有单个hla等位基因。按指定实验中的规定，这些细胞加载了完整的cmvpp65肽库或其特定的子库、单一十五肽或已知由该等位基因提呈的cmv pp65九聚体(例如hla a0201为nlvpmvatv，hla a2402为qydpvaalf和tprvtgggam和hla b0702为rpherngftv)(trivedi,d.等,blood,2005.105:2793
‑
2801；hasan,a.n.等,j immunol,2009.183:2837
‑
2850)。加载非共有hla等位基因提呈的肽的靶标用作对照。通过针对用特定共有hla等位基因提呈的已鉴定的肽表位脉冲的靶标的反应性，并针对加载携带其它共有等位基因的ebv blcl或完全错配的ebv blcl上加载的肽的反应性的缺乏，来鉴定hla限制。
167.6.2.数据:
168.6.2.1.自遗传一系列不同hla等位基因的遗传型上异源的供体群产生的gmp级cmv ctl库
169.自开始使用供体来源的cmvpp65特异性t细胞用于治疗同种异体hsct接受者的cmv病毒血症的临床试验以来，在7年的时间内产生了共119个cmvpp65特异性ctl系。
170.用于产生ctl系的供体库遗传了180个不同的hla等位基因，这代表了new york多种族人群中普遍的共同hla等位基因。hla等位基因在供体ctl库中的分布与在包括高加索人、亚洲人和黑人在内各种族群出现的hla等位基因频率密切相关，只是hla a0201和b0702除外，其过度出现；分别为33％与25％和21％与8.7％(表1)。119个供体中遗传的hla i类等位基因的频率顺序如下：a0201(n＝39)、a0301(n＝28)、b0702(n＝25)、b 44(n＝24)、hla b 0801(n＝22)、b 3501
‑
11(n＝19)、a1101(n＝16)、a2402(n＝14)、b 1501
‑
17(n＝14)、b 1801
‑
07(n＝12)、3201
‑
03(n＝11)、a3301
‑
04(n＝10)、b 4001
‑
06(n＝9)和a2601(n＝9)、b 5701(n＝9)。其它hla i类等位基因以较低频率出现，例如hla b 5201(n＝8)、b 3801(n＝6)、a6801
‑
09(n＝5)、b 5801(n＝5)。对于hla ii类等位基因，有6个高度出现的hla drb1等位基因，正如从总人群其较高频率所预期的(表1)。在频率顺序中，这些包括drb11501
‑
08、0401
‑
32、0301
‑
13、0701
‑
04、1101
‑
20、1301
‑
34。
171.表1.总人群中的hla等位基因频率和119个cmvpp65特异性ctl系的表征。
172.[0173][0174]
6.2.2.根据少数hla i类和ii类等位基因提呈的表位cmvpp65特异性t细胞应答是显性的
[0175]
在119(87％)个ctl系的103个中，免疫显性t细胞应答被hla i类等位基因限制，而在16个ctl系中，被hla ii类等位基因限制。在54％的ctl系中，免疫显性t细胞应答被3个hla i类等位基因限制：a0201(25％)、b 0702(21％)和b3501
‑
11(8％)。提呈免疫显性表位的其它等位基因包括hla a 2402、b 4001、b 4006、b 4202、b 4204、b 4402、b 4403、drb1 0401和0404、drb1 1101、drb1 1202。因此，尽管该库中提供的宽大序列的i类和ii类hla等位基因，但这些等位基因中仅19提呈诱导免疫显性t细胞应答的表位。此外，任何可检测水平的t细胞应答对由该库中的供体遗传的180个hla等位基因中的仅49个提呈的表位有特异
性。
[0176]
6.2.3.提呈免疫显性表位的hla等位基因在共遗传特定单元型的个体内以分层级次存在
[0177]
库中t细胞系的评价还表明，由特定hla等位基因提呈的表位始终是显性的，如通过表位特异性ifnγ+t细胞的量化和其hla限制的确定测量。之前的研究提供了由hla b0702提呈的cmvpp65的表位在共遗传hla a0201和b0702的患者中是显性的证据(lacey,s.f.等,hum immunol,2003.64:440
‑
452)。在该实施例的系列中，hla b0702一贯是限制在遗传该等位基因的库中的全部25个供体的免疫显性t细胞应答的等位基因(100％)，包括共遗传hla a0201的9个。因此，受hla b0702限制的应答不论遗传的其它hla i类和ii类等位基因均是显性的。
[0178]
另一方面，在遗传hla a0201的39个供体的30中(77％)，免疫显性t细胞应答被hla a0201限制。其余的9个供体是共遗传hla a0201和b0702的供体，且在这9个供体的每个中，免疫显性t细胞应答被hla b 0702限制。因此hla a0201当与任何其它hla i类或ii类等位基因共遗传(当与hla b0702共遗传除外)时，是限制免疫显性t细胞应答的等位基因。例如，在22个遗传hla b44等位基因的供体中，只有4个诱导被该等位基因限制的显性应答。当这些等位基因(b4401、b4402、b4403)与hla a0201共遗传时，在12个所述供体的11个(91.6％)免疫显性ctl应答被hla a0201限制；其它供体也共遗传hla b0702并诱导hla b0702限制的应答。
[0179]
遗传hla b 0702或a0201的供体中t细胞应答的其它显著特征是这样的事实，即所观察到的应答专门针对由这些等位基因提呈的表位。相比之下，在其中对免疫显性表位的应答被其它hla等位基因限制的t细胞系中，通常观察到对其它表位有特异性并被其它hla等位基因限制的亚显性t细胞群。该分析允许提呈如图1所示的免疫显性表位的hla等位基因的分层聚类的识别。
[0180]
提呈免疫显性表位的hla等位基因的分层只根据其在响应肽刺激时的功能活性水平。在肽对hla结合的亲和力及其诱导免疫显性t细胞应答的能力之间没有相关性(表2)。
[0181]
表2.提呈免疫显性表位的hla等位基因的表征。
[0182]
[0183]
[0184][0185]
6.2.4.构成cmv ctl库的表位库和hla等位基因可用于治疗不同的患者群
[0186]
在构成gmp库的119个ctl系内发现极有限的诱导t细胞应答的免疫显性cmvpp65表位库，其由有限的hla基因座提呈。假如t细胞应答由如此精细的特异性限定，则对于在第三方背景下是临床上有效的抗原特异性t细胞，所选的t细胞应需要对通过由患者共有的hla基因座提呈的表位起反应。在这些参数中，分析了可能使用来自该库的ctl治疗的不同种族的患者。
[0187]
对在过去3
‑
5年在memorial sloan
‑
kattering癌症中心进行的来自是hla匹配或hla错配的相关或无关的供体以及脐带血供体的一系列连续t细胞耗尽移植进行了回顾。在该中心，在一系列239个hla匹配的相关或无关的移植中，在该病例的86％中，能够鉴定出具有受患者共有的hla等位基因限制的cmv t细胞应答和1
‑
2个其它hla等位基因中匹配的ctl系。同样，在一系列的137个hla错配的移植和70个脐带血移植中，分别能够在93％和81％的病例中鉴定出适当受限制的ctl系。因此，虽然在该ctl库中hla等位基因的宽大提呈，但可鉴定受有限的hla等位基因库限制的t细胞，并用于在该种族多样化群体中治疗大多数的患者。
[0188]
6.2.5.使用新定义的表位和hla限制标准自移植供体或第三方供体选择的用于治疗的cmv ctl的临床活性
[0189]
总共54名可评价的患者接受cmv ctl作为无法响应抗病毒药物的临床感染或持续病毒血症的治疗。这些人中，19名接受了来自其hct供体(ncto1646645)的cmvpp65特异性t细胞，35名接受来自>2hla等位基因匹配的第三方供体的t细胞。结果概括于表3和表4。在该分析中，cr定义为临床感染的清除和/或可检测cmv从血液中清除。pr定义为血液中cmv的降低>2log10。sd定义为具有稳定临床状况且cmv降低<2log10的患者。pod定义为病毒血症和临床疾病持续进展。
[0190]
表2.给予的cmvpp65特异性t细胞的hla限制的反应。
[0191]
[0192][0193]
表3.在给予的其它cmvpp65特异性t细胞中检出的免疫显性hla等位基因
[0194][0195]
正如所见的，接受对由hla a201提呈的cmvpp65表位有特异性的t细胞的19名患者中，14达到了cr或pr。用由hla b0702提呈的免疫显性表位有特异性的t细胞治疗的9人中，8人达到了cr。同样，在治疗的5个病例的每个中，免疫显性t细胞受hla a2402限制(n＝2)，且b0801(n＝3)诱导cr。
[0196]
相比之下，7/7对hla b35的等位位基因变体提呈的免疫显性表位有特异性的cmvpp65特异性t细胞的接受者不起反应。同样，对a2601(n＝3)、a2407(n＝1)和b5001(n＝1)的表位有特异性的免疫显性t细胞无法清除感染或减轻病毒血症。
[0197]
这些预期的结果提供免疫显性由特定hla等位基因提呈的表位体内诱导具有更好的治疗活性的t细胞的证据。
[0198]
还对接受来自供体的移植物的患者进行了回顾性检查，所述供体还同意将其cmvpp65特异性t细胞包括在库中用于他们还向其捐赠hla相容性hct以外的个体。原因是来自这类供体的t细胞耗尽移植物，其通常含有2
‑
8x103个t细胞/kg接受者体重，还可提供少数免疫显性cmv特异性t细胞，因为血清反应阳性供体的血液中ifnγ+cmv特异性t细胞的频率在循环t细胞的0.1
‑
1％的范围。表5提供该初步分析的结果。
[0199]
表4.接受来自还向库中贡献细胞作为第三方供体的hla相容供体的移植物的患者中cmv再激活、疾病和对cmv定向疗法的最终反应的分析。
[0200][0201]
此外，如在用cmvpp65特异性t细胞治疗的患者中所见，来自共有hla b0702和a0201等位基因的供体的移植物接受者具有发生cmv疾病的较小风险，且病毒血症持续对治疗起反应，而接受来自缺乏这些等位基因的供体的移植物的人具有明显感染的重大发生率。这在携带缺乏hla b0702或a0201的hla b35的变体的患者中再次特别观察到。
[0202]
临床数据允许我们确定提呈诱导肽特异性t细胞应答的cmvpp65的免疫显性表位的某些hla等位基因的分层(参见表6)，一个活性示图的实例。
[0203]
表5.提呈诱导肽特异性t细胞应答的cmvpp65的免疫显性表位的hla等位基因的分层。
[0204]
[0205][0206]
a
较高等级相当于在治疗患有对抗病毒药物不起反应的cmv感染或持续病毒血症的患者中被hla等位基因限制的t细胞系的更好的临床效果。
[0207]
我们的数据表明，不应使用hla
‑
b35变体(因此可视为在出现的hla等位基因中“不合格”)。
[0208]
6.3.数据表明：
[0209]
1.有限的cmvpp65表位库诱导功能性cmv特异性细胞毒性t细胞应答，且该ctl库内出现的181个等位基因中共49个hla等位基因提呈这些免疫显性cmvpp65表位。
[0210]
2.鉴定的肽表位可用于开发有效的多肽疫苗，或用作在未来产生用于过继免疫疗法的高功能性cmv ctl的有限肽库。
[0211]
3.hla分层的分析并入用于治疗的ctl系的选择中可促进第三方ctl治疗的更高和更一致的功效。
[0212]
6.4.临床和实验结果的概要
[0213]
有效的过继转移的病毒特异性t细胞必须对病毒肽表位有特异性，所述病毒肽表位由被病毒感染的宿主细胞表达又被感染的宿主细胞和hla限制性供体t细胞通过其识别病毒表位的供体t细胞表达的hla等位基因提呈。
[0214]
在解决用cmv的最初感染后，最初大的应答t细胞库缩小，使得保持只对少数免疫显性表位有特异性的t细胞。因此，自潜伏感染的cmv血清反应阳性正常供体扩增的cmvpp65特异性t细胞系通常对由供体表达的仅1
‑
2个hla等位基因提呈的仅1
‑
2种免疫显性cmvpp65肽有特异性。
[0215]
我们发现，提呈诱导肽特异性t细胞应答的cmvpp65的免疫显性表位的hla等位基因有分层，这导致特定hla等位基因提呈的cmvpp65特异性t细胞相对于遗传和表达的所有其它细胞优先扩增。这种分层不是基于肽与提呈性等位基因的结合亲和力。作为hla限制的这种分层的结果：
[0216]
1.在体外扩增的t细胞系中检出的诱导cmvpp65特异性t细胞的免疫显性表位只从由少数hla等位基因提呈。
[0217]
2.此外，在遗传来自提呈免疫显性肽表位的该有限的hla等位基因库的两个或多个hla等位基因的个体中，某些hla等位基因(例如hla b0702或hla a0201)始终提呈诱导排他应答的表位。
[0218]
ii期试验的早期结果进一步表明，对于抗病毒药物疗法失败、然后由用受宿主的感染细胞表达的hla等位基因限制的第三方供体来源的cmvpp65特异性t细胞治疗的cmv感染或持续病毒血症的患者，接受被该分层中的同一最高hla等位基因(例如hla b0702或hla a0201)限制的cmvpp65特异性t细胞的那些患者始终起反应，而用被分层中低等的hla等位基因限制的cmvpp65特异性t细胞治疗可清除感染，反应不太一致。
[0219]
7.援引加入
[0220]
本文引用了不同的出版物，其公开内容通过引用以其整体并入到本文中。
具体实施方式：
[0221]
1.一种选择用于治疗性给予携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的人类患者的同种异体t细胞系的方法，所述方法包括：
[0222]
使用示图选择与识别病原体或癌症的抗原的至少一个表位的患者是同种异体的t细胞系，所述示图(i)鉴定多个hla等位基因和任选hla等位基因组合，和(ii)揭示各个识别病原体或癌症的抗原的至少一个表位并受限于大量hla等位基因或hla等位基因组合的不同hla等位基因或hla等位基因组合的t细胞系的相对活性的指标；其中在示图中各个鉴定的hla等位基因或hla等位基因组合与受限于hla等位基因或hla等位基因组合的t细胞系的相对活性的相应指标有关，所述相对活性是由t细胞系显示的针对病原体或针对癌症的已知活性的相对度量；其中
[0223]
(a)所选的t细胞系具有与患者或患者中的患病细胞一样的通过示图鉴定的t细胞系的识别受其限制的hla等位基因或hla等位基因组合；和
[0224]
(b)所选的t细胞系受其限制的hla等位基因或hla等位基因组合在示图中与在示图中已知与患者或患者的患病细胞一致且未以别的方式使之不合格的hla等位基因和hla等位基因组合中的最高相对活性的指标有关。
[0225]
2.实施方案1的方法，所述方法进一步包括在选择步骤之前制作示图的步骤。
[0226]
3.实施方案2的方法，所述方法进一步包括在制作步骤之前测量相对活性的步骤。
[0227]
4.实施方案1
‑
3中任一项的方法，所述方法进一步包括在选择步骤之前确定患者或患者的患病细胞的hla配型的步骤。
[0228]
5.实施方案4的方法，其中确定的步骤包括对至少4个hla基因座分型。
[0229]
6.实施方案1
‑
5中任一项的方法，其中所述示图是通过相对活性排序的大量hla等位基因和任选hla等位基因组合的一览表。
[0230]
7.实施方案1
‑
5中任一项的方法，其中所述示图是列举大量hla等位基因和任选hla等位基因组合的数据库，每一个与表明相对活性的评分有关。
[0231]
8.实施方案1
‑
5中任一项的方法，其中所述示图是散点图。
[0232]
9.实施方案8的方法，其中散点图的第一轴表示大量hla等位基因和任选hla等位基因组合中不同的hla等位基因和任选hla等位基因组合；且其中散点图的第二轴表示在用对各个t细胞系是自体的并负载显示病原体或癌症的抗原性的一种或多种肽的抗原呈递细胞刺激时，来源于针对其在示图中揭示相对活性的指标的各t细胞系的干扰素
‑
γ
‑
分泌cd3
+
细胞的百分比，作为所述相对活性的指标。
[0233]
10.实施方案1
‑
8中任一项的方法，其中所述相对活性是t细胞系在携带/患有病原体或癌症的患者的治疗中的体内临床功效。
[0234]
11.实施方案1
‑
10中任一项的方法，其中所述示图存储在数据库中。
[0235]
12.实施方案1
‑
11中任一项的方法，其中所述方法是计算机执行的。
[0236]
13.实施方案1
‑
12中任一项的方法，其中所述患者携带或疑似携带病原体，其中所述t细胞系识别病原体的抗原的至少一个表位，且其中所述相对活性是针对病原体的已知活性的相对度量。
[0237]
14.实施方案13的方法，其中所述病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或原生生物。
[0238]
15.实施方案14的方法，其中所述病原体是病毒。
[0239]
16.实施方案15的方法，其中所述病毒是cmv。
[0240]
17.实施方案16的方法，其中所述患者在患者进行造血干细胞移植(下称“hsct”)之后患有或疑似患有cmv感染。
[0241]
18.实施方案16或17的方法，其中所述抗原是cmv pp65。
[0242]
19.实施方案16或17的方法，其中所述抗原是cmv ie1。
[0243]
20.实施方案15的方法，其中所述病毒是ebv。
[0244]
21.实施方案20的方法，其中所述抗原是ebna1、ebna2、ebna3a、ebna3b、ebna3c、lmp1或lmp2。
[0245]
22.实施方案15的方法，其中所述病毒是bkv、jcv、疱疹病毒、腺病毒、人免疫缺陷病毒、流感病毒、埃博拉病毒、痘病毒、棒状病毒或副黏病毒。
[0246]
23.实施方案15的方法，其中所述病毒是人疱疹病毒
‑
6(hhv
‑
6)或人疱疹病毒
‑
8(hhv
‑
8)。
[0247]
24.实施方案1
‑
12中任一项的方法，其中所述患者患有或疑似患有癌症，其中所述t细胞系识别癌症的抗原的至少一个表位，且其中所述相对活性是针对癌症的已知活性的相对度量。
[0248]
25.实施方案24的方法，其中所述癌症是血癌。
[0249]
26.实施方案24的方法，其中所述癌症是乳腺、肺、卵巢、胃、胰腺、喉、食管、睾丸、肝、腮腺、胆管、结肠、直肠、宫颈、子宫、子宫内膜、肾、膀胱、前列腺、甲状腺、脑或皮肤的癌症。
[0250]
27.实施方案24的方法，其中所述抗原是wt1。
[0251]
28.实施方案24的方法，其中所述癌症是淋巴增殖性病症。
[0252]
29.实施方案28的方法，其中所述癌症是ebv阳性移植后淋巴增殖性病症。
[0253]
30.实施方案29的方法，其中所述抗原是ebna1、ebna2、ebna3a、ebna3b或ebna3c。
[0254]
31.实施方案29的方法，其中所述抗原是lmp1或lmp2。
[0255]
32.实施方案24的方法，其中所述癌症是ebv阳性鼻咽癌。
[0256]
33.实施方案32的方法，其中所述抗原是ebna1、lmp1或lmp2。
[0257]
34.一种选择从其得到同种异体t细胞系用于治疗性给予携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的人类患者的同种异体t细胞供体的方法，所述方法包括：
[0258]
使用示图，选择对患者是同种异体的t细胞供体，所述示图(i)鉴定多个hla等位基因和任选hla等位基因组合，和(ii)揭示各个识别病原体或癌症的抗原的至少一个表位并受限于大量hla等位基因或hla等位基因组合的不同hla等位基因或hla等位基因组合的t细胞系的相对活性的指标；其中在示图中各个鉴定的hla等位基因或hla等位基因组合与受限于hla等位基因或hla等位基因组合的t细胞系的相对活性的相应指标有关，所述相对活性是由t细胞系显示的针对病原体或针对癌症的已知活性的相对度量；其中
[0259]
(a)所选的t细胞供体具有与患者或患者中的患病细胞一样的至少一个hla等位基因或hla等位基因组合；和
[0260]
(b)与患者或患者的患病细胞一样的至少一个hla等位基因或hla等位基因组合之一在示图中与在示图中已知与患者或患者的患病细胞一样且未以别的方式使之不合格的hla等位基因和hla等位基因组合中的最高相对活性的指标有关。
[0261]
35.实施方案34的方法，所述方法进一步包括在选择步骤之前制作示图的步骤。
[0262]
36.实施方案35的方法，所述方法进一步包括在制作步骤之前测量相对活性的步骤。
[0263]
37.实施方案34
‑
36中任一项的方法，所述方法进一步包括在选择步骤之前确定患者或患者的患病细胞的hla配型和t细胞供体的hla配型的步骤。
[0264]
38.实施方案37的方法，其中确定的步骤包括对至少4个hla基因座分型。
[0265]
39.实施方案34
‑
38中任一项的方法，其中所述示图是通过相对活性排序的大量hla等位基因和任选hla等位基因组合的一览表。
[0266]
40.实施方案34
‑
38中任一项的方法，其中所述示图是列举大量hla等位基因和任选hla等位基因组合的数据库，每一个与表明相对活性的评分有关。
[0267]
41.实施方案34
‑
38中任一项的方法，其中所述示图是散点图。
[0268]
42.实施方案41的方法，其中散点图的第一轴表示大量hla等位基因和任选hla等位基因组合中不同的hla等位基因和任选hla等位基因组合；且其中散点图的第二轴表示在用对各个t细胞系是自体的并负载显示病原体或癌症的抗原性的一种或多种肽的抗原呈递细胞刺激时，来源于针对其在示图中揭示相对活性的指标的各t细胞系的干扰素
‑
γ
‑
分泌cd3
+
细胞的百分比，作为所述相对活性的指标。
[0269]
43.实施方案34
‑
41中任一项的方法，其中所述相对活性是t细胞系在携带/患有病原体或癌症的患者的治疗中的体内临床功效。
[0270]
44.实施方案34
‑
43中任一项的方法，其中所述示图存储在数据库中。
[0271]
45.实施方案34
‑
44中任一项的方法，其中所述方法是计算机执行的。
[0272]
46.实施方案34
‑
45中任一项的方法，其中所述患者携带或疑似携带病原体，其中所述t细胞系识别病原体的抗原的至少一个表位，且其中所述相对活性是针对病原体的已知活性的相对度量。
[0273]
47.实施方案46的方法，其中所述病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或原生生物。
[0274]
48.实施方案46的方法，其中所述病原体是病毒。
[0275]
49.实施方案48的方法，其中所述病毒是cmv。
[0276]
50.实施方案49的方法，其中所述患者在患者进行hsct后携带或疑似携带cmv感染。
[0277]
51.实施方案49或50的方法，其中所述抗原是cmv pp65。
[0278]
52.实施方案49或50的方法，其中所述抗原是cmv ie1。
[0279]
53.实施方案48的方法，其中所述病毒是ebv。
[0280]
54.实施方案53的方法，其中所述抗原是ebna1、ebna2、ebna3a、ebna3b、ebna3c、lmp1或lmp2。
[0281]
55.实施方案48的方法，其中所述病毒是bkv、jcv、疱疹病毒、腺病毒、人免疫缺陷病毒、流感病毒、埃博拉病毒、痘病毒、棒状病毒或副黏病毒。
[0282]
56.实施方案48的方法，其中所述病毒是人疱疹病毒
‑
6(hhv
‑
6)或人疱疹病毒
‑
8(hhv
‑
8)。
[0283]
57.实施方案34
‑
45中任一项的方法，其中所述患者患有或疑似患有癌症，其中所述t细胞系识别癌症的抗原的至少一个表位，且其中所述相对活性是针对癌症的已知活性
的相对度量。
[0284]
58.实施方案57的方法，其中所述癌症是血癌。
[0285]
59.实施方案57的方法，其中所述癌症是乳腺、肺、卵巢、胃、胰腺、喉、食管、睾丸、肝、腮腺、胆管、结肠、直肠、宫颈、子宫、子宫内膜、肾、膀胱、前列腺、甲状腺、脑或皮肤的癌症。
[0286]
60.实施方案57的方法，其中所述抗原是wt1。
[0287]
61.实施方案57的方法，其中所述癌症是淋巴增殖性病症。
[0288]
62.实施方案61的方法，其中所述癌症是ebv阳性移植后淋巴增殖性病症。
[0289]
63.实施方案62的方法，其中所述抗原是ebna1、ebna2、ebna3a、ebna3b或ebna3c。
[0290]
64.实施方案62的方法，其中所述抗原是lmp1或lmp2。
[0291]
65.实施方案57的方法，其中所述癌症是ebv阳性鼻咽癌。
[0292]
66.实施方案65的方法，其中所述抗原是ebna1、lmp1或lmp2。
[0293]
67.一种选择从其得到同种异体t细胞系用于治疗性给予携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的人类患者的同种异体t细胞供体的方法，所述方法包括：
[0294]
使用示图选择对具有与患者或患者中的患病细胞一样的一个或多个hla等位基因的患者是同种异体的t细胞供体，所述示图(i)鉴定多个hla等位基因，和(ii)揭示各个识别病原体或癌症的抗原的至少一个表位并受限于大量所述hla等位基因的不同hla等位基因的t细胞系产生的相对频率的指标；其中在示图中各个鉴定的hla等位基因与受限于hla等位基因的所述t细胞系产生的相对频率的相应指标有关，其中:
[0295]
所选的t细胞供体具有与在示图中同与患者或患者的患病细胞不一样的供体的hla等位基因相比与产生的较高频率的指标有关的患者或患者的患病细胞一样的至少一个hla等位基因。
[0296]
68.实施方案67的方法，所述方法进一步包括在选择步骤之前制作示图的步骤。
[0297]
69.实施方案68的方法，所述方法进一步包括在制作步骤之前测量相对频率的步骤。
[0298]
70.实施方案67
‑
69中任一项的方法，所述方法进一步包括在选择步骤之前确定患者或患者的患病细胞的hla配型和t细胞供体的hla配型的步骤。
[0299]
71.实施方案70的方法，其中确定的步骤包括对至少4个hla基因座分型。
[0300]
72.实施方案67
‑
71中任一项的方法，其中所述示图是通过所述相对频率排序的大量hla等位基因的一览表。
[0301]
73.实施方案67
‑
71中任一项的方法，其中所述示图是列举大量hla等位基因的数据库，每一个与表示相对频率的评分有关。
[0302]
74.实施方案67
‑
73中任一项的方法，其中所述示图存储在数据库中。
[0303]
75.实施方案67
‑
74中任一项的方法，其中所述方法是计算机执行的。
[0304]
76.实施方案67
‑
75中任一项的方法，其中所述患者携带或疑似携带病原体，且其中所述t细胞系识别病原体的抗原的至少一个表位。
[0305]
77.实施方案76的方法，其中所述病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或原生生物。
[0306]
78.实施方案76的方法，其中所述病原体是病毒。
[0307]
79.实施方案78的方法，其中所述病毒是cmv。
[0308]
80.实施方案79的方法，其中所述患者在患者进行hsct后携带或疑似携带cmv感染。
[0309]
81.实施方案79或80的方法，其中所述抗原是cmv pp65。
[0310]
82.实施方案79或80的方法，其中所述抗原是cmv ie1。
[0311]
83.实施方案78的方法，其中所述病毒是ebv。
[0312]
84.实施方案83的方法，其中所述抗原是ebna1、ebna2、ebna3a、ebna3b、ebna3c、lmp1或lmp2。
[0313]
85.实施方案78的方法，其中所述病毒是bkv、jcv、疱疹病毒、腺病毒、人免疫缺陷病毒、流感病毒、埃博拉病毒、痘病毒、棒状病毒或副黏病毒。
[0314]
86.实施方案78的方法，其中所述病毒是人疱疹病毒
‑
6(hhv
‑
6)或人疱疹病毒
‑
8(hhv
‑
8)。
[0315]
87.实施方案67
‑
75中任一项的方法，其中所述患者患有或疑似患有癌症，其中所述t细胞系识别癌症的抗原的至少一个表位。
[0316]
88.实施方案87的方法，其中所述癌症是血癌。
[0317]
89.实施方案87的方法，其中所述癌症是乳腺、肺、卵巢、胃、胰腺、喉、食管、睾丸、肝、腮腺、胆管、结肠、直肠、宫颈、子宫、子宫内膜、肾、膀胱、前列腺、甲状腺、脑或皮肤的癌症。
[0318]
90.实施方案87的方法，其中所述抗原是wt1。
[0319]
91.实施方案87的方法，其中所述癌症是淋巴增殖性病症。
[0320]
92.实施方案91的方法，其中所述癌症是ebv阳性移植后淋巴增殖性病症。
[0321]
93.实施方案92的方法，其中所述抗原是ebna1、ebna2、ebna3a、ebna3b或ebna3c。
[0322]
94.实施方案92的方法，其中所述抗原是lmp1或lmp2。
[0323]
95.实施方案87的方法，其中所述癌症是ebv阳性鼻咽癌。
[0324]
96.实施方案95的方法，其中所述抗原是ebna1、lmp1或lmp2。
[0325]
97.实施方案1
‑
96中任一项的方法，其中所述患者曾是hsct的接受者。
[0326]
98.实施方案97的方法，其中hsct是骨髓移植、外周血干细胞移植或脐带血移植。
[0327]
99.实施方案1
‑
96中任一项的方法，其中所述患者曾是实体器官移植的接受者。
[0328]
100.一种选择同种异体t细胞系用于治疗性给予携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的人类患者的计算机系统，其包括：
[0329]
中央处理器；
[0330]
与中央处理器连接的存储器，存储器存储用于执行实施方案1
‑
99中任一项的方法的步骤的指令。
[0331]
101.一种计算机可读介质，其具有用于执行实施方案1
‑
99中任一项的方法的步骤的计算机可执行指令。
[0332]
102.一种治疗携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的人类患者的方法，所述方法包括：
[0333]
(a)按照实施方案1
‑
33中任一项的方法选择同种异体t细胞系用于治疗性给予患者；和
[0334]
(b)将来源于所选的同种异体t细胞系的t细胞群给予患者。
[0335]
103.实施方案102的方法，其中所述患者曾是hsct的接受者。
[0336]
104.实施方案103的方法，其中hsct是骨髓移植、外周血干细胞移植或脐带血移植。
[0337]
105.实施方案102的方法，其中所述患者曾是实体器官移植的接受者。
[0338]
106.一种获得同种异体t细胞系用于治疗性给予携带/患有或疑似携带/患有病原体或癌症的人类患者的方法，所述方法包括：
[0339]
(a)按照实施方案34
‑
99中任一项的方法选择同种异体t细胞供体；和
[0340]
(b)从所选的同种异体t细胞供体得到同种异体t细胞系，所述同种异体t细胞系识别病原体或癌症的抗原的至少一个表位。