甘草查尔酮A在抗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染中的应用的制作方法

甘草查尔酮a在抗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染中的应用
技术领域
1.本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及甘草查尔酮a在抗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染中的应用。


背景技术：

2.甘草查尔酮a是一种黄酮类化合物，是中药甘草的主要活性成分，具有多种生物学活性，如抗菌、抗炎和抗病毒等。甘草，味甘，性平，是一种常见的中药材，在我国分布广泛，具有补脾益气、清热解毒、却痰止咳等功效，可用于治疗咳嗽痰多、痈肿疮毒、脾胃虚弱等疾病。
3.嗜水气单胞菌是一种常见的条件性致病菌，广泛分布于自然界中，能导致陆生动物、鱼类和人的多种疾病，其中对水产养殖业的危害最大。嗜水气单胞菌是淡水水产养殖的主要条件性致病菌之一，能导致多种淡水养殖动物的感染性疾病，对水产养殖业的健康发展造成了极大的威胁。长期以来，水产养殖业嗜水气单胞菌感染的治疗均依赖于化学抗菌药物，但由于药物的不合理使用导致了耐药性的产生和药物的残留，限制了化学抗菌药物的使用。
4.嗜水气单胞菌的致病力是由其携带的毒力因子、粘附因子等所组成，大量研究表明嗜水气单胞菌缺失气溶素后其致病力显著下降。气溶素是一种成孔毒素，具有溶血性、肠毒性和细胞毒性，其可在易感细胞的细胞膜上形成七聚体，从而导致细胞内容物外流而导致死亡。因此，气溶素成为研究抗嗜水气单胞菌感染药物的新靶标。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供了甘草查尔酮a在抗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染中的应用，甘草查尔酮a对嗜水气单胞菌的生长几乎没有抑制作用，但能直接抑制嗜水气单胞菌气溶素的活性和细胞毒性，提高斑点叉尾鮰嗜水气单胞菌感染模型的存活率。
6.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.甘草查尔酮a在抗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染中的应用：经试验验证，甘草查尔酮a对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度大于256μg/ml，在本试验浓度下对嗜水气单胞菌的生长没有任何影响，但其能剂量依赖性的抑制气溶素的溶血活性，当甘草查尔酮a浓度超过0.5μg/ml以后在统计学上具有显著性。进一步实验研究发现，1μg/ml及以上浓度的甘草查尔酮a可显著抑制气溶素介导的a549细胞的细胞损伤，提示其对嗜水气单胞菌感染具有保护作用。另外，建立了斑点叉尾鮰嗜水气单胞菌感染模型，结果发现口灌25mg/kg剂量的甘草查尔酮a，每12h使用一次，连续3天，可显著提高感染动物的存活率，其存活率可达到70％，而阳性对照组全部死亡。通过以上研究表明，甘草查尔酮a可作为一种渔药或饲料添加剂用于防治水产养殖动物的嗜水气单胞菌感染。
8.甘草查尔酮a是一种来源于药用植物甘草的天然化合物，对动物和人没有毒副作用，可广泛用于制备抗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染的药物和饲料添加剂。
9.与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：甘草查尔酮a抗感染作用并非直接抑制病原菌的生长，因此不会对病原菌造成选择性压力，不易产生耐药性，此外由于该药的作用非抑菌，因此对耐药菌仍有较好的治疗作用；甘草查尔酮a为天然化合物，对动物、人和生态环境均无毒性作用，药物残留风险较低。
附图说明
10.图1为甘草查尔酮a与嗜水气单胞菌168菌株共培养的生长曲线。
11.图2为甘草查尔酮a对嗜水气单胞菌培养物上清液溶血活性的影响。
12.图3为甘草查尔酮a对纯化气溶素溶血活性的影响。
13.图4为甘草查尔酮a对气溶素诱导的a549细胞损伤的影响。
具体实施方式
14.实施例1：
15.甘草查尔酮a对嗜水气单胞菌最小抑菌浓度测定
16.本发明所涉及的嗜水气单胞菌168菌株由长江水产研究所水产动物药理与药残控制技术实验室保存。采用clsi推荐的肉汤微量稀释法测定了甘草查尔酮a对168菌株的最小抑菌浓度。步骤如下：
17.(1)将配置好的甘草查尔酮a(四川维克奇生物技术有限公司，纯度＞98％，cas no.58749
‑
22
‑
7)在96孔细胞培养板中倍比稀释，使第1至10孔中浓度分别为512μg/ml、256μg/ml、128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml；每孔药物体积100μl；
18.(2)分别无菌接种168菌株的单菌落至mh培养基中30℃培养过夜，离心取菌体用无菌生理盐水调整浓度为0.5麦氏比浊度，然后用培养基稀释至1
×
106cfu/ml，在96孔细胞培养板中加入菌液，使其最终浓度达到5
×
105cfu/ml，分别设置阴性和阳性对照组(阴性对照组不加药物不加菌液，阳性对照组只加菌液不加药物)，每个药物重复三次，在30℃生化培养箱中培养18
‑
24h后观察结果，以没有细菌生长的最低药物浓度判定为该药物的最低抑菌浓度。结果发现，甘草查尔酮a对嗜水气单胞菌168菌株的最小抑菌浓度大于256μg/ml。
19.实施例2：
20.甘草查尔酮a对嗜水气单胞菌生长的影响
21.本发明所涉及的嗜水气单胞菌168菌株由长江水产研究所水产动物药理与药残控制技术实验室保存。将168菌株在bhi液体培养基中培养至对数生长前期(od
600nm
＝0.3，28℃)，将培养菌分别置于6个50ml的锥形瓶中，每瓶20ml，分别加入不同浓度(0，1，2，4，8μg/ml)的甘草查尔酮a，28℃条件下继续培养5h，每30min取菌液测定一次od
600nm
的吸收值。附图1所示为不同浓度甘草查尔酮a与嗜水气单胞菌168菌株共培养的生长曲线，从图中可以看出甘草查尔酮a在浓度为8μg/ml及以下时对嗜水气单胞菌的生长没有影响。
22.实施例3：
23.甘草查尔酮a对嗜水气单胞菌培养物上清液溶血活性的影响
24.本发明所涉及的嗜水气单胞菌168菌株由长江水产研究所水产动物药理与药残控制技术实验室保存。将嗜水气单胞菌168在bhi液体培养基中培养至对数生长前期，将菌液
分装于5个50ml的锥形瓶中，每瓶菌液10ml，然后分别加入甘草查尔酮a，使菌液中药物浓度分别达到8、4、2、1、0.5、0μg/ml，28℃继续培养至od
600nm
至1.5，12000g离心1min收集上清液。向上清液中加入胰蛋白酶在室温反应10min以激活上清液中的气溶素。向1.5ml离心管中加入100μl激活的上清液，875μl溶血缓冲液，25μl脱纤维绵羊红细胞，充分混匀，在37℃条件下孵育20min后10000g离心1min，取上清液测定od543nm的吸收值。去离子水作为阳性对照(100％溶血组)，溶血缓冲液作为阴性对照(0％溶血组)。结果如附图2所示，0.5μg/ml及以上浓度的甘草查尔酮a能显著降低嗜水气单胞菌共培养物上清液的溶血活性，且该抑制作用呈剂量依赖性。该结果提示甘草查尔酮a可通过抑制气溶素表达或活性降低培养物上清液的溶血活性。
25.实施例4：
26.甘草查尔酮a对嗜水气单胞菌气溶素溶血活性的影响
27.本发明中所涉及的气溶素由长江水产研究所水产动物药理与药残控制技术实验室制备并保存。具体步骤如下：975μl pbs溶液加至5个1.5ml离心管中，分别加入2μl浓度为100μg/ml纯化气溶素，然后加入甘草查尔酮a使不同离心管中的浓度分别达到0，0.5，1，2，4，8μg/ml，混合均匀后放入37℃培养箱中；孵育15min后加入25μl脱纤维绵羊红细胞(上海源叶生物技术有限公司)，继续在37℃条件下孵育15min，高速离心后测量od
543nm
吸收度，去离子水作为阳性对照。如附图3所示，随着甘草查尔酮a浓度增加气溶素的溶血作用呈剂量依赖性的降低，当甘草查尔酮a浓度达到0.5μg/ml及以上时能显著抑制气溶素的活性。结合实施例3和4可知甘草查尔酮a可通过直接抑制气溶素活性降低嗜水气单胞菌培养物上清液的溶血活性。
28.实施例5：
29.甘草查尔酮a对嗜水气单胞菌气溶素引起a549细胞损伤的保护作用
30.本发明所涉及的气溶素和a549细胞由长江水产研究所保存。a549细胞培养在含有5％二氧化碳的培养箱中，培养基为dmem，添加10％胎牛血清，青链霉素双抗。试验时将细胞以1.5
×
105个/孔的浓度平铺于96孔细胞培养板上，在37℃二氧化碳培养箱中培养过夜。次日，向培养板中加入2μl浓度为100μg/ml纯化气溶素，随后分别加入甘草查尔酮a，使其终浓度达到0，0.5，1，2，4，8μg/ml；细胞继续置于二氧化碳培养箱中培养2h后取上清采用乳酸脱氢酶(ldh)释放试剂盒测定不同处理组ldh释放量。结果如附图4所示，甘草查尔酮a可剂量依赖性的降低气溶素诱导的a549细胞ldh释放，当浓度在1μg/ml及以上时能显著抑制a549细胞ldh的释放。结果表明，甘草查尔酮a能抑制气溶素引起的a549细胞损伤。
31.实施例6：
32.甘草查尔酮a对斑点叉尾鮰嗜水气单胞菌感染模型的治疗作用
33.本发明所涉及的嗜水气单胞菌168菌株由长江水产研究所水产动物药理与药残控制技术实验室保存。试验在100cm
×
50cm
×
60cm的玻璃水族箱中进行，每天换水并保持水温在28
±
2℃左右。100g左右的健康斑点叉尾鮰经麻醉后通过腹腔注射嗜水气单胞菌168菌株建立人工感染模型。感染后2h开始对感染斑点叉尾鮰灌服25mg/kg剂量的甘草查尔酮a，每12h给药一次，连续给药3d，阳性对照组感染后灌服pbs作为对照。每个实验组使用斑点叉尾鮰20尾，感染后即开始记录死亡情况，结果见表1。该结果表明，斑点叉尾鮰人工感染嗜水气单胞菌后在8d内全部死亡；给予25mg/kg甘草查尔酮a治疗的斑点叉尾鮰死亡率降至30％，
其存活率远高于阳性对照组。通过以上研究充分表明，当斑点叉尾鮰感染嗜水气单胞菌后可通过给予25mg/kg剂量的甘草查尔酮a进行治疗，且该药物能取得较好的治疗效果。
34.表1甘草查尔酮a治疗斑点叉尾鮰嗜水气单胞菌感染模型后的死亡率
[0035][0036]
近年来研究表面，病原菌的致病力与其携带的毒力因子的数量和种类相关。气溶素是嗜水气单胞菌的主要毒力因子，气溶素缺失的菌株在体内外的毒力显著下降。因此，气溶素成为鉴别致病性嗜水气单胞菌的分子标志，也成为研究抗嗜水气单胞菌感染药物的研发的潜在靶标。传统抗菌药物以抑菌或杀菌为目的，极易导致病原菌产生耐药性，本发明以气溶素为靶标，从天然化合物中筛选不抑制病原菌生长但抑制其主要毒力因子气溶素活性的化合物，不易产生耐药性。通过实施例1和2发现，甘草查尔酮a在本发明的使用浓度下(0.5
‑
8μg/ml)对嗜水气单胞菌的生长没有抑制作用，但通过实施例3发现甘草查尔酮a与细菌共培养后可显著降低共培养物上清液的溶血活性，通过实施例4发现甘草查尔酮a对纯化的气溶素的溶血活性有显著抑制作用，提示甘草查尔酮a能直接抑制气溶素的活性。进一步通过实施例5发现甘草查尔酮a对气溶素诱导的a549细胞损伤具有显著的保护作用，提示其对鱼类感染嗜水气单胞菌有潜在的治疗作用。因此，实施例6建立了斑点叉尾鮰嗜水气单胞菌感染模型，发现感染后的斑点叉尾鮰灌服25mg/kg剂量的甘草查尔酮a后8d其存活率仍可达到70％，而感染后不给药组8d内全部死亡。通过以上实施例表明，甘草查尔酮a是一种有效地治疗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染的药物。
[0037]
嗜水气单胞菌是淡水养殖环境中常见的条件性致病菌，可感染多种水产养殖动物，是严重威胁淡水水产养殖健康发现的因素之一。而气溶素广泛存在于致病性嗜水气单胞菌中，是鉴别嗜水气单胞菌是否具有致病力的关键因素。因此，可推断甘草查尔酮a对水产养殖动物的嗜水气单胞菌感染均具有治疗作用。