一种用于治疗感染性骨缺损的负载聚乙烯吡咯烷酮碘的仿生矿化微球的制备方法

1.本发明属于生物医药材料技术领域，具体涉及一种用于治疗感染性骨缺损的负载聚乙烯吡咯烷酮碘的仿生矿化微球的制备方法。


背景技术：

2.目前，当患者特别是骨科患者发生感染后，临床上主要采取全身应用抗生素的方法来进行治疗。对于保留假体抗生素治疗效果不佳的患者，临床必须采用一期或者二期的翻修手术联合抗生素进行治疗。然而，这些治疗措施必须长期大量的应用抗生素，进行原来假体的拆除和多次的手术，这些干预很容易造成人体正常菌群失调，使原本感染的细菌出现耐药性，出现二重感染和多重耐药细菌的感染，严重时威胁患者生命。除了传统的治疗方式以外，广大的医生和科学家正在积极探究通过对内植物材料进行表面改性以获得具有抑菌或者杀菌的表面。
3.很多金属离子具有抗菌效果，目前已有文献报道的具有明显抗菌效果金属离子有：银，铜，锌，金，镓，铁等等。比如，银(ag)对包括耐药菌在内的多种细菌均有较强的抗菌活性并被广泛用于提高移植物的抗菌能力。银离子注入的钛植入物在体内和体外均表现出良好的抗菌能力。银抗菌的第一种机制认为，释放出来的ag+离子可以与细胞表面蛋白质和酶的巯基(
‑
sh)结合，从而导致细胞膜失稳，atp合成途径被破坏。第二种机制可能是活性氧(ros)，如单线态氧，ros可作用于细菌的细胞膜上，对细菌dna复制造成不可逆的破坏，影响细菌的代谢和分裂过程。
4.多篇文献报道锌(zn)是机体细胞的一些关键蛋白的结构或功能成分，其可通过促进细胞增殖、分化和骨相关基因的表达，从而促进成骨分化和骨整合。此外，锌还是一种广谱的抗菌剂，可以有效地抑制多种细菌菌株引起的感染，而且应用锌不会引起细菌突变。由此可见，使用合理剂量的zn掺入到植入内植物材料上可以达到促进骨形成和抑制细菌生物膜的双重目的。已有研究报道锌离子对金黄色葡萄球菌(s.aureus)，大肠杆菌(e.coli)和多重耐药细菌(mrsa)均具有明显的抗菌作用。也有文献报道，将两种或多种金属离子混杂掺入植入材料内，从而发挥更强杀菌功能的报道，比如zn/ag共掺杂的植入物在体外和体内观察到优异的抗菌性能。另外，锌、银、镁、镓、铜离子均报道具有高效的抗菌效应，而且这些金属离子不仅可以作为光谱的抗菌剂，且不易引起细菌耐药性的产生。此外，镁(mg)、锶(sr)、铜(cu)、锌(zn)等均被报道具有高效的促进成骨分化和诱导骨整合的作用，另外，锶离子报道具有抗骨质疏松效应。
5.普遍认为，骨科填充材料在植入体内后的在早期和晚期持续拥有较强的抑菌和杀菌效果，将会很大程度上降低患者的感染率，也可以有效地的治疗骨科难治性的感染。但是，临床上特别缺少这些具有抗菌效能的材料，临床上偶有抗菌填充材料报道，但是存在很多缺点：载药量不够，抗菌剂的爆发性释放、抗菌时效过短，骨延迟愈合等等。如有研究将抗生素负载到骨科填充材料表面，但是这种负载含量非常有限，爆发性释放的问题使得这些
材料只能针对早期的感染，没有持久的抗菌功能，而且越来越多的抗生素负载也出现了细菌耐药性的问题。如授权公告号为：cn1140299 c公开了水热合成纳米羟基磷灰石生物涂层的复合制备工艺，这些方案仅能在短期内发挥抗菌效应，缺乏长期和持续的抗感染效应，并且耐药性的出现、制备成本过高等都限制了临床应用。因此，临床上迫切需要开发出能够克服现有技术缺点和临床感染问题的新技术和新填充材料，获得具有长效抗菌性能的骨科填充材料，探索出适用于骨科感染患者，感染合并糖尿病患者，或接受免疫抑制治疗的患者。


技术实现要素：

6.本发明的目的是针对现有的问题，提供了一种用于治疗感染性骨缺损的负载聚乙烯吡咯烷酮碘的仿生矿化微球的制备方法。上述的聚乙烯吡咯烷酮碘的缩写为pvpi，文中两种表述代报的意义相同。通过在改良的模拟体液中掺杂抗菌金属离子，然后在高温高压的条件下进行磷酸钙盐仿生矿化反应，形成含有特定抗菌金属离子的具有特殊微纳拓扑结构的磷酸钙微颗粒。然后将微颗粒悬浮在聚乙烯吡咯烷酮碘溶液中进行聚乙烯吡咯烷酮碘的负载，形成具有负载聚乙烯吡咯烷酮碘的含抗菌金属离子的磷酸钙微球。据此，本发明发展的一种制备含有金属离子的具有特殊微纳拓扑结构的磷酸钙微颗粒，并在微纳结构中负载聚乙烯吡咯烷酮碘的络合物，可以在早期释放聚乙烯吡咯烷酮碘发挥抗菌效应并连续控释微粒中的多功能性金属离子，并极大发挥持续的抗感染效应及骨整合能力。
7.本发明是通过以下技术方案实现的：
8.一种用于治疗感染性骨缺损的负载聚乙烯吡咯烷酮碘的仿生矿化微球的制备方法，包括如下步骤：
9.(1)1.2
‑
msbf溶液配制：
10.a.称取各原料配制模拟体液备用；
11.b.对操作a制得的模拟体液进行离子掺杂，制得1.2
‑
msbf溶液备用；
12.(2)生物仿生矿化处理：
13.将步骤(1)所得的1.2
‑
msbf溶液装入广口瓶中，进行高温高压处理，1～8h后取出，冷却过滤后得仿生矿化微颗粒备用；
14.(3)5wt％聚乙烯吡咯烷酮碘溶液配制：
15.称量5g聚乙烯吡咯烷酮碘粉末溶于100ml超纯水中，磁力搅拌充分使其完全溶解后得5wt％聚乙烯吡咯烷酮碘溶液备用；
16.(4)共混反应处理：
17.称取步骤(2)制得的仿生矿化微颗粒，放置于步骤(3)所得的5wt％聚乙烯吡咯烷酮碘溶液中，然后在避光条件下用磁力缓慢搅拌，共混反应处理8
‑
10h；
18.(5)清洗处理：
19.共混反应处理后，过滤收集反应产生的微粒，再将微粒经过超纯水流水清洗3遍，每遍3min，最后于阴凉处晾干；
20.(6)消毒储存：
21.对步骤(5)制得的微粒进行辐照灭菌，之后密封干燥避光保存。
22.进一步，步骤(1)操作a中所述的模拟体液的成分组成为：na
+
142mmol/l、mg
2+
1.5mmol/l、k
+
5.0mmol/l、ca
2+
2.5～5.0mmol/l、(hpo4)2‑
1.0～2.0mmol/l、cl
‑
147.8mmol/l、
(hco3)
‑
4.2mmol/l、(so4)2‑
0.5mmol/l、聚羧酸盐1μmol/l～1mmol/l。
23.进一步，所述模拟体液是以超纯水作为溶剂；所述聚羧酸盐为聚天冬氨酸、聚丙烯酸中的一种或者两种任意比的混合物。
24.进一步，所述的离子掺杂具体是将无机金属离子溶解在模拟体液中进行掺杂；所述的无机金属离子可为锌离子、铜离子、镓离子、镁离子、锶离子中的一种或多种。
25.进一步，所述无机金属离子在1.2
‑
msbf溶液中的浓度为1μmol/l～10mmol/l。
26.进一步，步骤(2)中所述的高温高压处理的温度控制为60～220℃；所述的冷却过滤处理是先自然冷却至室温，然后在超滤设备中用滤纸进行过滤，所得的粉末即为仿生矿化微颗粒。
27.进一步，所述的仿生矿化微颗粒的成分及对应重量份如下：2
‑
80份羟基磷灰石、0
‑
60份白磷钙石、0
‑
30份磷酸三钙、20
‑
80份碳酸羟基磷灰石、0
‑
40份无定型磷酸钙；同时，所述白磷钙石、磷酸三钙、无定型磷酸钙三者的质量份数不同时为0。
28.本发明相比现有技术具有以下优点：
29.1、本发明的磷酸钙盐微颗粒由不同纳米颗粒度水平的钙磷酸盐超细颗粒物呈梯度水平的浓聚而成，这样的颗粒结构自内而外呈致密化梯度变化结构，有利于在表面形成具有高比表面积的特殊拓扑结构的表面结构，从而有利于聚乙烯吡咯烷酮碘的负载，同时具有稳定聚乙烯吡咯烷酮碘的作用，防止聚乙烯吡咯烷酮碘因为不稳定而挥发或升华等。
30.2.微颗粒表面为负载的聚乙烯吡咯烷酮碘，内核为掺杂抗菌活性离子的磷酸钙矿物颗粒，有利于术后早期阶段表面聚乙烯吡咯烷酮碘溶解和碘的释放从而发挥早期的抗菌效应。植入后期，内核的微颗粒在植入体内后生理环境中逐渐溶解并释放钠离子、钙离子、镁离子、磷酸根离子等过程中，也逐渐释放出掺杂其中的抗菌性能的锌离子和成骨性能的锶离子，这样的核壳结构有利于保证表层的聚乙烯吡咯烷酮碘的释放与内核的多功能性离子长期稳定释放，从而达到早期抗菌和长期持续抗菌及高效骨整合效应的协同解决。
31.3、本发明的载聚乙烯吡咯烷酮碘的微球制备工艺简便，原料易得，不苛求昂贵的仪器设备和其它限制严格的特种设备和特殊条件，整个微球制备工艺条件较为温和，三废排放量较少，属于环保型制备工艺，符合大规模低成本加工生产的经济效益指标。
附图说明
32.图1是生物矿化制备zn
‑
sr
‑
cap
‑
pvpi微球路线图。
33.图2是聚乙烯吡咯烷酮碘溶液配制是用到的pvpi粉末的扫描电镜图。
34.图3是zn
‑
sr
‑
cap
‑
pvpi微球的透射电镜图。微球在透射电镜下表现为表面具有微突起的晶粒，有一定的介孔表现，晶向分布方向整齐。
35.图4是zn
‑
sr
‑
cap
‑
pvpi微球在扫描电镜能谱元素含量分析图。可见微球中zn元素的含量约占2.35wt％,i元素的含量约占4.72wt％。
36.图5是zn
‑
sr
‑
cap
‑
pvpi微球与两种骨科常见易感菌液共培养后的细菌涂板效果图片。
具体实施方式
37.下面通过具体实施例对本发明进一步进行描述，但本发明的保护范围并不仅限于
此。
38.下述实施例所使用试剂纯度指标均不低于其分析纯水平。
39.下述实施例中所用的改良模拟体液的组成与含量如下表：
40.表1模拟体液与人类血浆中的离子浓度
[0041][0042]
表2 1l 1.2
‑
msbf模拟体液配制
[0043][0044][0045]
实施例1
[0046]
一种用于治疗感染性骨缺损的负载聚乙烯吡咯烷酮碘的仿生矿化微球的制备方法，包括如下步骤：
[0047]
(1)1.2
‑
msbf溶液配制：
[0048]
a.称取各原料配制模拟体液备用；
[0049]
b.对操作a制得的模拟体液进行离子掺杂，制得1.2
‑
msbf溶液备用；
[0050]
(2)生物仿生矿化处理：
[0051]
将步骤(1)所得的1.2
‑
msbf溶液装入广口瓶中，进行高温高压处理，1h后取出，冷却过滤后得仿生矿化微颗粒备用；
[0052]
(3)5wt％聚乙烯吡咯烷酮碘溶液配制：
[0053]
称量5g聚乙烯吡咯烷酮碘粉末溶于100ml超纯水中，磁力搅拌充分使其完全溶解后得5wt％聚乙烯吡咯烷酮碘溶液备用；
[0054]
(4)共混反应处理：
[0055]
称取步骤(2)制得的仿生矿化微颗粒，放置于步骤(3)所得的5wt％聚乙烯吡咯烷酮碘溶液中，然后在避光条件下用磁力缓慢搅拌，共混反应处理8h；
[0056]
(5)清洗处理：
[0057]
共混反应处理后，过滤收集反应产生的微粒，再将微粒经过超纯水流水清洗3遍，每遍3min，最后于阴凉处晾干；
[0058]
(6)消毒储存：
[0059]
对步骤(5)制得的微粒进行辐照灭菌，之后密封干燥避光保存。
[0060]
步骤(1)操作a中的模拟体液的成分组成为：na
+
142mmol/l、mg
2+
1.5mmol/l、k
+
5.0mmol/l、ca
2+
2.5mmol/l、(hpo4)2‑
1.0mmol/l、cl
‑
147.8mmol/l、(hco3)
‑
4.2mmol/l、(so4)2‑
0.5mmol/l、聚羧酸盐1μmol/l。
[0061]
模拟体液是以超纯水作为溶剂；聚羧酸盐为聚天冬氨酸。
[0062]
离子掺杂具体是将无机金属离子溶解在模拟体液中进行掺杂；无机金属离子可为锌离子。
[0063]
无机金属离子在1.2
‑
msbf溶液中的浓度为1μmol/l。
[0064]
步骤(2)中的高温高压处理的温度控制为60℃；冷却过滤处理是先自然冷却至室温，然后在超滤设备中用滤纸进行过滤，所得的粉末即为仿生矿化微颗粒。
[0065]
仿生矿化微颗粒的成分及对应重量份如下：2份羟基磷灰石、20份碳酸羟基磷灰石、10份无定型磷酸钙。
[0066]
实施例2
[0067]
一种用于治疗感染性骨缺损的负载聚乙烯吡咯烷酮碘的仿生矿化微球的制备方法，包括如下步骤：
[0068]
(1)1.2
‑
msbf溶液配制：
[0069]
a.称取各原料配制模拟体液备用；
[0070]
b.对操作a制得的模拟体液进行离子掺杂，制得1.2
‑
msbf溶液备用；
[0071]
(2)生物仿生矿化处理：
[0072]
将步骤(1)所得的1.2
‑
msbf溶液装入广口瓶中，进行高温高压处理，5h后取出，冷却过滤后得仿生矿化微颗粒备用；
[0073]
(3)5wt％聚乙烯吡咯烷酮碘溶液配制：
[0074]
称量5g聚乙烯吡咯烷酮碘粉末溶于100ml超纯水中，磁力搅拌充分使其完全溶解
后得5wt％聚乙烯吡咯烷酮碘溶液备用；
[0075]
(4)共混反应处理：
[0076]
称取步骤(2)制得的仿生矿化微颗粒，放置于步骤(3)所得的5wt％聚乙烯吡咯烷酮碘溶液中，然后在避光条件下用磁力缓慢搅拌，共混反应处理9h；
[0077]
(5)清洗处理：
[0078]
共混反应处理后，过滤收集反应产生的微粒，再将微粒经过超纯水流水清洗3遍，每遍3min，最后于阴凉处晾干；
[0079]
(6)消毒储存：
[0080]
对步骤(5)制得的微粒进行辐照灭菌，之后密封干燥避光保存。
[0081]
步骤(1)操作a中的模拟体液的成分组成为：na
+
142mmol/l、mg
2+
1.5mmol/l、k
+
5.0mmol/l、ca
2+
2.5mmol/l、(hpo4)2‑
1.5mmol/l、cl
‑
147.8mmol/l、(hco3)
‑
4.2mmol/l、(so4)2‑
0.5mmol/l、聚羧酸盐1mmol/l。
[0082]
模拟体液是以超纯水作为溶剂；聚羧酸盐为聚丙烯酸。
[0083]
离子掺杂具体是将无机金属离子溶解在模拟体液中进行掺杂；无机金属离子可为铜离子和锌离子。
[0084]
无机金属离子在1.2
‑
msbf溶液中的浓度为1mmol/l。
[0085]
步骤(2)中的高温高压处理的温度控制为180℃；冷却过滤处理是先自然冷却至室温，然后在超滤设备中用滤纸进行过滤，所得的粉末即为仿生矿化微颗粒。
[0086]
仿生矿化微颗粒的成分及对应重量份如下：40份羟基磷灰石、20份白磷钙石、50份碳酸羟基磷灰石。
[0087]
实施例3
[0088]
一种用于治疗感染性骨缺损的负载聚乙烯吡咯烷酮碘的仿生矿化微球的制备方法，包括如下步骤：
[0089]
(1)1.2
‑
msbf溶液配制：
[0090]
a.称取各原料配制模拟体液备用；
[0091]
b.对操作a制得的模拟体液进行离子掺杂，制得1.2
‑
msbf溶液备用；
[0092]
(2)生物仿生矿化处理：
[0093]
将步骤(1)所得的1.2
‑
msbf溶液装入广口瓶中，进行高温高压处理，8h后取出，冷却过滤后得仿生矿化微颗粒备用；
[0094]
(3)5wt％聚乙烯吡咯烷酮碘溶液配制：
[0095]
称量5g聚乙烯吡咯烷酮碘粉末溶于100ml超纯水中，磁力搅拌充分使其完全溶解后得5wt％聚乙烯吡咯烷酮碘溶液备用；
[0096]
(4)共混反应处理：
[0097]
称取步骤(2)制得的仿生矿化微颗粒，放置于步骤(3)所得的5wt％聚乙烯吡咯烷酮碘溶液中，然后在避光条件下用磁力缓慢搅拌，共混反应处理10h；
[0098]
(5)清洗处理：
[0099]
共混反应处理后，过滤收集反应产生的微粒，再将微粒经过超纯水流水清洗3遍，每遍3min，最后于阴凉处晾干；
[0100]
(6)消毒储存：
[0101]
对步骤(5)制得的微粒进行辐照灭菌，之后密封干燥避光保存。
[0102]
步骤(1)操作a中的模拟体液的成分组成为：na
+
142mmol/l、mg
2+
1.5mmol/l、k
+
5.0mmol/l、ca
2+
2.5mmol/l、(hpo4)2‑
2.0mmol/l、cl
‑
147.8mmol/l、(hco3)
‑
4.2mmol/l、(so4)2‑
0.5mmol/l、聚羧酸盐1mmol/l。
[0103]
模拟体液是以超纯水作为溶剂；聚羧酸盐为聚天冬氨酸、聚丙烯酸对应按照重量比1：1的混合物。
[0104]
离子掺杂具体是将无机金属离子溶解在模拟体液中进行掺杂；无机金属离子可为锌离子、锶离子。
[0105]
无机金属离子在1.2
‑
msbf溶液中的浓度为10mmol/l。
[0106]
步骤(2)中的高温高压处理的温度控制为220℃；冷却过滤处理是先自然冷却至室温，然后在超滤设备中用滤纸进行过滤，所得的粉末即为仿生矿化微颗粒。
[0107]
仿生矿化微颗粒的成分及对应重量份如下：80份羟基磷灰石、60份白磷钙石、30份磷酸三钙、80份碳酸羟基磷灰石、40份无定型磷酸钙。
[0108]
实施例4
[0109]
zn
‑
sr
‑
cap
‑
聚乙烯吡咯烷酮碘微粒的制备：
[0110]
(1)1.2
‑
msbf溶液配制：按表2中的成分，分别用天平称取对应质量的物质，溶于800ml超纯水中，磁力搅拌使其完全溶解，然后向sbf溶液中加入适量srno3,zncl2,pasp(srno3,zncl2最终浓度均为0.05mmol/l pasp最终浓度为10μmol/l)，用hcl调节ph值为7.8，定容至1l，充分搅拌溶解均匀,制备的溶液即为1.2msbf。
[0111]
(2)生物仿生矿化：将1.2
‑
msbf溶液(含有0.05mmol/l锌离子，0.05mmol/l锶离子和10μmol/l pasp)装入广口瓶中，瓶盖不完全密封，置于高温高压蒸汽灭菌锅中，120℃高温高压处理4小时，即可广口瓶中制备出磷酸钙的矿化微粒。
[0112]
(3)5wt％聚乙烯吡咯烷酮碘溶液配制：称量5g的聚乙烯吡咯烷酮碘粉末溶于100ml超纯水中，采用磁力搅拌充分使其完全溶解。
[0113]
(4)称量上述制备的矿化微粒1g置于5wt％的聚乙烯吡咯烷酮碘水溶液中，避光条件下用磁力搅拌缓慢搅拌过夜处理。
[0114]
(5)清洗：过夜处理结束后，过滤收集微粒，将微粒经过超纯水流水清洗3遍，每遍3分钟，然后低温条件下晾干处理。
[0115]
(6)消毒储存：将制备的zn
‑
sr
‑
cap
‑
聚乙烯吡咯烷酮碘的微粒进行辐照灭菌，之后密封干燥避光保存。
[0116]
说明：实施例中相应的ph值和相应的元素含量可以依照下表3中列出的数据进行替换，在ph值和离子含量的最优值和两侧端值条件下均可成功制备。
[0117]
表3实例元素与ph值
[0118]
[0119]
[0120][0121]
本发明配置的sbf溶液在特定ph值下的高温高压仿生矿化形成具有微纳拓扑结构的cap微颗粒；特定微纳拓扑结构的cap微颗粒可以稳定聚乙烯吡咯烷酮碘(此处的聚乙烯吡咯烷酮碘可以用抗菌肽或其他抗菌效应的物质代替)，保持其长期的抗菌效应；cap负载zn离子(此处zn离子可被ga离子、cu离子等具有抗菌效应的金属离子代替)，zn离子缓慢降解，可以在全生命周期发挥抗菌效应；cap负载sr离子，可以发挥高效骨整合效果。
[0122]
为了对比本发明效果，对上述实施例1方法进行测试，具体对应实验测试结果和数据见附图。其中：
[0123]
附图1是生物矿化制备zn
‑
sr
‑
cap
‑
pvpi微球路线图。msbf溶液中含有锶离子(sr)和锌离子(zn)以及聚天冬氨酸。矿化后形成的zn
‑
sr
‑
cap微球表面具有各种微纳拓扑结构的突起，具有极大的比表面积(实施例1)。聚乙烯吡咯烷酮碘负载后，聚乙烯吡咯烷酮碘被包绕在zn
‑
sr
‑
cap的这些微突起中，具有极大的保护聚乙烯吡咯烷酮碘的效应。
[0124]
附图2是聚乙烯吡咯烷酮碘溶液配制是用到的pvpi粉末的扫描电镜图。
[0125]
附图3是zn
‑
sr
‑
cap
‑
pvpi微球的透射电镜图。微球在透射电镜下表现为表面具有
微突起的晶粒，有一定的介孔表现，晶向分布方向整齐。
[0126]
附图4是zn
‑
sr
‑
cap
‑
pvpi微球在扫描电镜能谱元素含量分析图。可见微球中zn元素的含量约占2.35wt％,i元素的含量约占4.72wt％。
[0127]
附图5是zn
‑
sr
‑
cap
‑
pvpi微球与两种骨科常见易感菌液共培养后的细菌涂板效果图片。对照组，没有加入微球，可见平皿上金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌菌落较多，分布均匀广泛。zn
‑
sr
‑
cap
‑
pvpi微球平皿表面的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌表面的菌落数很少，分布不均匀，表明大部分细菌已经死亡。
[0128]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，但本发明不以所示限定实施范围，凡是依照本发明的构想所作的改变，或修改为等同变化的等效实施例，仍未超出说明书所涵盖的精神时，均应在本发明的保护范围内。