一种天然佛手精油在抑制乙酰胆碱酯酶活性中的应用

1.本发明涉及一种天然佛手精油在抑制乙酰胆碱酯酶活性中的应用，属于为乙酰胆碱酯酶抑制剂技术领域。


背景技术：

2.乙酰胆碱酯酶，简称ache，是一种降解神经递质乙酰胆碱为胆碱和乙酸的酶。该酶主要存在于神经肌肉接点与胆碱能神经系统中，阻止神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内的正常传递。乙酰胆碱酯酶具有极高的水解活性，经过乙酰胆碱酯酶作用而产生的胆碱通过重摄取被转运进入神经末梢，并在那里被重新利用来合成新的乙酰胆碱分子。阿尔兹海默症患者与正常人相比乙酰胆碱转移酶的含量比正常人减少90％，乙酰胆碱酯酶(ache)被认为是一个筛选抗阿尔茨海默病药物的靶点，利用药物抑制过量的ache活性将有助于治疗阿尔茨海默病等神经退行性病变。乙酰胆碱酯酶抑制剂通过对乙酰胆碱酯酶的可逆性抑制，使乙酰胆碱(ach)于突触处积累，延长并且增加了乙酰胆碱的作用。
3.佛手(英文：citrus medica var.sarcodactylis)是香橼的变种之一。是不规则分枝的灌木或小乔木。其新生枝、芽及花蕾均呈暗紫红色，茎枝多刺，刺长达4厘米。叶柄短，叶片椭圆形或卵状椭圆形，果实呈手指状肉条形，最重可达2000克，果皮呈淡黄色，粗糙，果皮厚，内皮白色或略淡黄色，棉质，松软，瓢囊10
‑
15瓣，果肉无色，近于透明或淡乳黄色，爽脆，味酸或略甜，有香气。成熟的金佛手颜色金黄，并能时时溢出芳香，消除异味，净化室内空气，抑制细菌。其根、茎、叶、花、果均可入药，辛、苦、甘、温、无毒；入肝、脾、胃三经，有理气化痰、止呕消胀、舒肝健脾、和胃等多种药用功能。对老年人的气管炎、哮喘病有明显的缓解作用；对一般人的消化不良、胸腹胀闷，有更为显著的疗效。佛手可制成多种中药材，久服有保健益寿的作用。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是：提供佛手精油在抑制乙酰胆碱酯酶活性中的新用途。
5.为了解决上述问题，本发明提供了一种天然佛手精油在抑制乙酰胆碱酯酶活性中的应用，不包括用于疾病的诊断和治疗，该天然佛手精油是通过蒸馏法或压榨法制备而得，其主要成分包括d
‑
柠檬烯和γ
‑
松油烯。
6.优选地，所述的天然佛手精油的主要成分包括40～50wt％的d
‑
柠檬烯和20～30wt％的γ
‑
松油烯。
7.优选地，所述应用包括在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂中的应用。
8.优选地，所述的乙酰胆碱酯酶抑制剂包含有效量的天然佛手精油和医药上可接受的载体。
9.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
10.本发明提供了天然佛手精油在抗乙酰胆碱酯酶中的新用途，乙酰胆碱酯酶(ache)被认为是一个筛选抗阿尔茨海默病药物的靶点，利用药物抑制过量的ache活性将有助于治疗阿尔茨海默病等神经退行性病变，因此本发明的天然佛手精油有望成为治疗阿尔茨海默病等神经退行性病变的新药物；本发明还提供了天然佛手精油在抗氧化性能方面的功效。
附图说明
11.图1为佛手精油浓度与抗乙酰胆碱酯酶活性的关系曲线；
12.图2为实施例2的压榨佛手精油的dpph清除率；
13.图3为实施例1的蒸馏佛手精油的dpph清除率；
14.图4为实施例2的压榨佛手精油的abts自由基清除率；
15.图5为实施例1的蒸馏佛手精油的abts自由基清除率。
具体实施方式
16.为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
17.实施例1
18.蒸馏法制备佛手精油：
19.步骤1：削除新鲜的佛手果皮，将果皮切成薄片，破壁，称重。称量好重量的果皮倒入破壁机中加入少量水打碎。
20.步骤2：将步骤1所得的果皮碎片倒入圆底烧瓶，加入去离子水，料液比1:3，加入3％氯化钠后水蒸气蒸馏，收集精油；
21.步骤3：将步骤2所得精油加入适量无水硫酸钠，干燥12h后，将油收集称重，并进行gc
‑
ms分析，结果如表1所示。
22.gc
‑
ms分析条件:
23.色谱条件：采用安捷伦gc
‑
6890气相色谱仪和5973n
‑
ms质谱仪进行了气相色谱
‑
质谱分析。色谱柱为db
‑
5ms(苯基甲基硅氧烷，60m，0.25mm，0.25μm)毛细管柱，氮气为载气，流速为1.0ml/min，分流比为10:1。以10℃/min的速率将柱温从50℃升至100℃(保持5min)，再以3℃/min的速率将柱温升高至140℃(保持10min)，最后以2℃/min的速率升至230℃(保持10min)。
24.质谱条件：ms以70ev的电子碰撞电离(ei)。结果与wiley/nist数据库匹配，并将保留指数(ri)与文献对比，确定精油成分。
25.实施例2
26.压榨法制备佛手精油：
27.步骤1：削除新鲜的佛手果皮，将果皮切成薄片，破壁，称重。
28.步骤2：将步骤1所得的果皮碎片倒入烧杯，用3％的氢氧化钙溶液浸泡，时长约2～5h；
29.步骤3：将步骤2得到的果皮用蒸馏水冲洗干净，置于原汁机压榨，随后加入0.5％的氯化钠溶液搅拌溶解，静置分层10min。
30.步骤4：将步骤3得到的上层液离心15min，转速9000r/min，收集精油。
31.步骤5：将步骤4所得的精油用无水硫酸钠干燥12h，收集称重，放入冰箱冷藏待用。
32.采用实施例1的条件进行gc
‑
ms分析上述制备得到的佛手精油的主要成分，结果如表1所示。
33.表1实施例1和2制备的佛手精油的gc
‑
ms分析结果
34.35.[0036][0037]
[0038]
由表1可知，实施例1和2制备的佛手精油的主要成分为d
‑
柠檬烯(40～50wt％)和γ
‑
松油烯(20～30wt％)，
[0039]
实施例3
[0040]
佛手精油具有乙酰胆碱酯酶抑制作用：
[0041]
(一)实验材料和试剂：
[0042]
盐酸多奈哌齐、pbs片剂(索莱宝solarbio)、乙酰胆碱酯酶(ache来源于电鳗鱼，上海高信)、碘化乙酰硫代胆碱(acetylthiocholine iodide，achi，迈瑞尔)、5,5
‑
二硫代双(2
‑
硝基苯甲酸)(5,5
′‑
dithiobis(2
‑
nitrobenzoic acid),dtnb，迈瑞尔)、无水乙醇、去离子水。
[0043]
(二)实验仪器与设备：
[0044]
pl602
‑
l型电子天平(梅特勒
‑
托利多仪器(上海)有限公司)；紫外
‑
可见光全波长酶标仪(美国赛默飞世尔公司)；tecan
‑
m200pro型多功能酶标仪(奥地利帝肯有限公司)；微量移液枪(法国gilson)；96孔细胞培养板(上海泰坦科技股份有限公司)。
[0045]
(三)佛手精油的乙酰胆碱酯酶抑制活性
[0046]
取110μl制备好的pbs溶液(ph7.2)，依次加入20μl硫代乙酰硫代胆碱溶液(0.3mg/ml)、20μl 5,5
‑
二硫代双(2
‑
硝基苯甲酸)(0.59mg/ml)、40μl乙酰胆碱酯酶溶液(1.35u/ml)，取实施例1制备所得的佛手精油制备成10μl不同浓度的佛手样品(15wt％、25wt％、37.5wt％、50wt％、72wt％、100wt％)，溶剂为乙醇。振荡混匀，37℃孵育30min；再做阳性对照，即用0.3mg/ml的盐酸多奈哌齐代替样品溶液；阴性对照则采用乙醇代替样品溶液。在412nm下测量吸光值并根据下式计算抑制率。
[0047]
对乙酰胆碱酯酶的抑制率按以下公式计算：
[0048]
抑制率(％)＝(1
‑
a0/a1)
×
100％；
[0049]
式中，a0：用乙醇溶液代替样品溶液时的吸光值，a1：添加样品溶液时的吸光值；
[0050]
所有操作重复三次并计算平均值和标准偏差；
[0051]
其中，阳性对照0.3mg/ml的盐酸多奈哌齐对乙酰胆碱酯酶的抑制率为70.35％，佛手精油在不同浓度下对乙酰胆碱酯酶的抑制率如图1所示。由图1可知，15wt％的佛手精油对乙酰胆碱酯酶的抑制率在95％以上，佛手精油的浓度越高，对乙酰胆碱酯酶的抑制率越高。
[0052]
实施例4
[0053]
佛手精油具有抗氧化活性：
[0054]
1、佛手精油dpph自由基清除能力
[0055]
(一)实验材料和试剂
[0056]
不同浓度(5.00
–
35.00μl/ml)的佛手精油，0.004％的dpph溶液(溶于甲醇)，96孔细胞培养板，酶标仪。
[0057]
(二)仪器与设备
[0058]
tecan
‑
m200pro型多功能酶标仪(奥地利帝肯有限公司)；微量移液枪(法国gilson)；96孔细胞培养板(上海泰坦科技股份有限公司)。
[0059]
(三)实施例2的压榨佛手精油的dpph自由基清除能力
[0060]
配制不同浓度(5.00
‑
35.00μl/ml)的精油，0.004％的dpph溶液(溶于甲醇)现配现
用，在96孔酶标板中加入100μl的样品或空白，再加入200μl的dpph溶液，避光反应30min后在酶标仪检测。
[0061]
dpph清除率的计算采用如下公式：
[0062]
dpph清除率(％)＝(1
‑
a0/a
x
)
×
100％；
[0063]
式中，a0为空白吸光度；a
x
为样品吸光度；
[0064]
根据实验结果，绘制佛手精油的dpph清除曲线，如图2所示。
[0065]
(三)实施例1的蒸馏佛手精油的dpph自由基清除能力
[0066]
配制不同浓度(5.00
‑
35.00μl/ml)的精油，0.004％的dpph溶液(溶于甲醇)现配现用，在96孔酶标板中加入100μl的样品或空白，再加入200μl的dpph溶液，避光反应30min后在酶标仪检测。
[0067]
dpph清除率的计算采用如下公式：
[0068]
dpph清除率(％)＝(1
‑
a0/a
x
)
×
100％；
[0069]
式中，a0为空白吸光度；a
x
为样品吸光度；
[0070]
根据实验结果，绘制佛手精油的dpph清除曲线，如图3所示。
[0071]
2、佛手精油abts自由基清除能力
[0072]
(一)实验材料和试剂
[0073]
abts水溶液(7.0mmol/l)、过硫酸钾水溶液(4.90mmol/l)、90％乙醇溶液、1ml不同浓度的各样品(2.50
‑
15.00μl/ml)甲醇溶液。
[0074]
(二)实验仪器与设备
[0075]
紫外
‑
可见光全波长酶标仪skyhigh(美国赛默飞世尔公司)；可见光分光光度计722s(上海菁华科技仪器有限公司)；微量移液枪(法国gilson)；96孔细胞培养板(上海泰坦科技股份有限公司)。
[0076]
(三)实施例2的压榨佛手精油的abts自由基清除能力
[0077]
abts水溶液(7.0mmol/l)与适量的过硫酸钾水溶液(4.90mmol/l)按照1:1的比例充分混合，然后混合液在暗处室温条件下放置过夜反应，得到含有abts阳离子自由基的深绿色溶液。测试前用90％乙醇溶液将abts
·
+原液稀释调整其在波长734nm处的吸光度在0.700
±
0.02范围内。测试样品时，1ml不同浓度的各样品(2.50
‑
15.00μl/ml)甲醇溶液与2ml的abts
·
+稀释液混合，振荡均匀后室温条件下在暗处保持反应6min，然后用紫外分光光度法测定反应液在波长734nm处的吸光度，90％乙醇做参比溶液。
[0078]
abts自由基清除率按照以下公式进行计算：
[0079]
abts自由基清除率(％)＝(1
‑
as/ac)
×
100％
[0080]
式中，as为各样品溶液反应后在734nm波长处的吸光度；ac为空白溶液反应后在734nm波长处的吸光度。
[0081]
根据实验结果，绘制佛手精油的abts自由基清除曲线，如图4所示。
[0082]
(四)实施例1的蒸馏佛手精油的abts自由基清除能力
[0083]
abts水溶液(7.0mmol/l)与适量的过硫酸钾水溶液(4.90mmol/l)按照1:1的比例充分混合，然后混合液在暗处室温条件下放置过夜反应，得到含有abts阳离子自由基的深绿色溶液。测试前用90％乙醇溶液将abts
·
+原液稀释调整其在波长734nm处的吸光度在0.700
±
0.02范围内。测试样品时，1ml不同浓度的各样品(2.50
‑
15.00μl/ml)甲醇溶液与
2ml的abts
·
+稀释液混合，振荡均匀后室温条件下在暗处保持反应6min，然后用紫外分光光度法测定反应液在波长734nm处的吸光度，90％乙醇做参比溶液。
[0084]
abts自由基清除率按照以下公式进行计算：
[0085]
abts自由基清除率(％)＝(1
‑
as/ac)
×
100％
[0086]
式中，as为各样品溶液反应后在734nm波长处的吸光度；ac为空白溶液反应后在734nm波长处的吸光度。
[0087]
根据实验结果，绘制佛手精油的abts自由基清除曲线，如图5所示。
[0088]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。