一种抗真菌多肽漱口水及其制备方法

1.本发明涉及一种抗真菌多肽漱口水及其制备方法。


背景技术：

2.口腔黏膜疾病(omd)，也称为软组织口腔疾病，被描述为一系列影响口腔黏膜和软组织的疾病或病症。口腔黏膜疾病中最为常见且难以根治的是以口腔念珠菌病(oc)感染引起的复发性口腔溃疡。迄今为止，众多文献和研究已经证实白色念珠菌是口腔念珠菌病感染引起复发性口腔溃疡的主要病原体。
3.目前针对白色念珠菌感染的治疗主要围绕抗生素的使用展开，而由于近些年抗生素的滥用，许多抗生素在抑制白色念珠菌的过程中还破坏了原本定植在口腔中或呼吸道中的其他有益菌群的生存，这种微生物动态平衡的打破使得机会性真菌感染的发病率不断上升，使白色念珠菌感染的治疗面临严峻的挑战。虽然不断有新的抗真菌药物问世，为抗真菌治疗提供了新的契机，抗白色念珠菌药物具有毒副作用大、不良反应多等弊端，同时耐药报道也逐渐增加。因此需要发展新的抗白色念珠菌预防和治疗方法，扩大现有的抗真菌药物储备池。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是克服现有技术中的漱口水类产品多为具有镇痛或者消炎的作用，很少具有预防作用的抗白色念珠菌的作用，本发明主要通过抑制白色念珠菌的存活率和增殖来达到预防口腔溃疡的作用。
5.为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
6.一种抗真菌多肽漱口水，包含有多肽a和多肽b，其中多肽a的氨基酸序列为lys
‑
arg
‑
leu
‑
phe
‑
lys
‑
lys
‑
leu；多肽b的氨基酸序列为asp
‑
leu
‑
ile
‑
trp
‑
lys
‑
leu
‑
leu。
7.优先的，多肽a和多肽b的摩尔比为1:3
‑
1:6。
8.进一步的，还包含有l
‑
抗坏血酸和胆钙化固醇，l
‑
抗坏血酸和胆钙化固醇的摩尔比为1:2
‑
1:9。
9.本发明所达到的有益效果是：本发明的抗真菌多肽漱口水可以抑制白色念珠菌增殖同时具体一定的抑炎作用，而且无抗生素滥用的危险，不会破坏原本定植在口腔中或呼吸道中的其他有益菌群的生存，无毒副作用和不良反应，通过小分子多肽的方法预防和保护口腔，可以有效抑制口腔溃疡的发生。
附图说明
10.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
11.图1为白色念珠菌特异性噬菌体的鉴定结果；
12.图2为多肽a和多肽b噬菌体对不同浓度白色念珠菌结合结果；
13.图3为多肽组分抑菌效果检测；
14.图4多肽组分抑炎作用检测。
具体实施方式
15.以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
16.实施例
17.本发明主要试剂配方包括：
18.(1)lb培养基：每升含10g蛋白胨，5g酵母提取物，5g nacl，高压灭菌，室温贮存；
19.(2)lb/iptg/xgal平板：lb培养基+15g/l琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1ml iptg/xgal，混匀倒平板。平板4℃避光贮存；
20.(3)顶层琼脂：每升含10g蛋白胨，5g酵母提取物，5g nacl，7g琼脂粉。高压灭菌，分成50ml等份，固体培养基室温贮存，用时微波炉融化；
21.(4)四环素贮液：以20mg/ml的浓度溶于70％乙醇中，
‑
20℃避光贮存，用前摇匀；
22.(5)lb
‑
tet平板：lb培养基+15g/l琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1ml四环素贮液，混匀倒平板，平板4℃避光贮存；
23.(6)peg8000/nacl：20％(w/v)peg
‑
8000，2.5mol/l nacl，高压灭菌，室温贮存；
24.(7)iptg/xgal配方：将1.25g iptg(isopropylβ
‑
d
‑
thiogalactoside)和1g xgal溶于25ml二甲基甲酰胺中，
‑
20℃避光贮存；
25.(8)tbs：50mmol/l tris
‑
hcl(ph 7.5)，150mmol/l nacl。高压灭菌，室温贮存；
26.(9)pbst溶液：在pbs溶液中加入体积比为0.05％/0.02％的吐温20
27.(10)碘化物缓冲液：10mmol/l tris
‑
hcl(ph 8.0)，1mmol/l edta，4mol/lnai。室温避光贮存；
28.(11)0.2mol/l glycine
‑
hcl(ph 2.2)，1mol/l tris
‑
hcl(ph 9.1)，高压灭菌，室温贮存。
29.结合白色念珠菌的多肽的筛选
30.1、噬菌体文库的扩增及纯化
31.接种e.coli er2738单菌落于5
‑
10ml lb液体培养基中，37℃、200rpm摇床孵育至对数中期(od600≈0.5)；加入10μl噬菌体，37℃、200rpm摇床震荡4
‑
5h，10000g离心10min，取上清；再次10000g离心10min，取80％上清，加入1/6体积的peg8000/nacl，4℃静置过夜。次日取出，白色沉淀即为噬菌体。10000g离心15分钟，倒掉上清，瞬时离心后轻轻吸出残留溶液；加入1ml tbs溶液溶解白色沉淀。
32.2、噬菌体滴度测定
33.接种e.coli er2738单菌落于5
‑
10ml lb液体培养基中，37℃、250rpm摇床孵育至对数中期(od600≈0.5)；微波炉加热融化顶层琼脂糖培养基，分成3ml/份分装到灭菌试管中，每个噬菌体稀释度用一管，保存于45℃备用；37℃预温lb/iptg/xgal琼脂平板，每个噬菌体稀释梯度取一个平板备用；用lb培养液对噬菌体进行10倍比系列稀释(稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：108‑
10
11
；未扩增的淘选洗脱物：101‑
104)；每个稀释度换一新鲜吸头，使用带滤芯吸头以避免交叉污染；当大肠杆菌菌液达对数中期时，将菌液分成200μl等份于
微量离心管中，每个噬菌体稀释度用一管；每管大肠杆菌菌液中分别加入10μl不同稀释倍数的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1
‑
5min；将噬菌体感染的大肠杆菌菌液加入45℃预温的顶层琼脂糖培养基管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37℃预温的lb/iptg/xgal琼脂平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开；待平板冷却5min后，倒置于37℃孵箱，培养过夜；检查平板，计数有102个噬菌斑的平板上的斑数，然后，用此数目乘以稀释因子即得到每10μl噬菌体的空斑形成单位(pifu)滴度。
34.3、白色念珠菌特异性噬菌体的富集
35.以50μg/ml浓度的白色念珠菌包被免疫试管并于4℃封闭过夜，tbst洗涤6次后加入噬菌体肽库，37℃振荡孵育1h，tbst洗涤10次去除未结合的噬菌体，加0.2mol/l glycine
‑
hcl(ph 2.2)1ml振荡10min洗脱特异结合的噬菌体，加150μl 1mol/l tris
‑
hcl(ph 9.1)中和，取10μl洗脱产物计数噬菌体的滴度，其余洗脱产物感染大肠杆菌er2738扩增并纯化噬菌体，得到次级库，对次级库滴度进行测定后进入下一轮筛选程序。
36.4、特异性结合噬菌体的筛选
37.重复步骤3的方法再进行四轮淘选，每一轮的滴度如表1所示，第1轮洗涤条件是体积比0.1％的tween20，第2和第3轮tween
‑
20浓度变为0.3％(v/v)，第4轮tween
‑
20浓度为0.5％(v/v)。
38.表1特异性噬菌体富集第一轮至第四轮噬菌体投入产出表
[0039] 投入滴度(pfu/ml)产出滴度(pfu/ml)第一轮2
×
10
11
6.9
×
109第二轮2
×
10
11
4.7
×
10
10
第三轮1
×
10
11
5.6
×
10
11
第四轮1
×
10
11 [0040]
白色念珠菌特异性噬菌体的鉴定
[0041]
随机挑取实施例1中第三轮筛选后滴度测定平板上的分离良好的单菌落20个，经过分别培养纯化后，用噬菌体elisa检测各株噬菌体对白色念珠菌的结合活性。具体步骤如下为：
[0042]
分别以白色念珠菌和blocking包被酶标板，每组三个平行，并于4℃封闭过夜，tbst洗涤6次后加入纯化后的噬菌体100μl，37℃振荡孵育1h，tbst洗涤10次去除未结合的噬菌体，加入hrp标记的鼠抗m13单克隆抗体100μl，37℃振荡孵育1h，tbst洗涤10次，加tmb底物室温避光反应5～10min，2mol/l硫酸终止反应，于450nm波长测定od值，以p/n≥2.1为阳性。图1为白色念珠菌特异性噬菌体的鉴定结果。
[0043]
有15株噬菌体表现出对白色念珠菌的结合。其中两株(8和12)表现出较强的结合力。提取这2株噬菌体ssdna，阳性克隆的菌液dna测序由上海生工生物技术公司完成。经测序，涉及的核苷酸序列如下：krlfkkl(seq id no.1)与dliwkll(seq id no.2)。
[0044]
使用dnaman和swiss数据库序列进行分析，获得相应的氨基酸序列1命名为多肽a序列如下：lys
‑
arg
‑
leu
‑
phe
‑
lys
‑
lys
‑
leu(krlfkkl)(seq id no.1)；相应的氨基酸序列2命名为多肽b序列如下：asp
‑
leu
‑
ile
‑
trp
‑
lys
‑
leu
‑
leu(dliwkll)(seq id no.2)。
[0045]
分别以不同浓度白色念珠菌和blocking包被平板并于4℃封闭过夜，tbst洗涤6次，加入具多肽a和多肽b序列的噬菌体2
×
10
11
(以相同滴度的不含多肽序列的噬菌体为对
照)，tbst洗涤10次去除未结合的噬菌体，加入hrp标记的鼠抗m13单克隆抗体100μl，37℃振荡孵育1h，tbst洗涤10次；加tmb室温避光反应5～10min，2mol/l硫酸终止反应，于450nm波长测定od值。结果表明，具有上述氨基酸序列的噬菌体表现出对白色念珠菌的特异性结合；图2为多肽a和多肽b噬菌体对不同浓度白色念珠菌结合结果。
[0046]
活性组分制备
[0047]
将合成后的多肽a和多肽b制备成1μm的多肽溶液后，按摩尔比为1:3
‑
1:6的比例混混和制成多肽混合液，将l
‑
抗坏血酸与胆钙化固醇以摩尔比为1:4
‑
1:7混和制成消炎溶液，再将活性肽混合物与l
‑
抗坏血酸和胆钙化固醇混合物以摩尔比为1:2
‑
1:9的比例混和后制成活性组分。为了检测活性组分对白的念珠菌的抑菌作用，我们进行了抑菌实验检测，并且进行了细胞实验检测，结果如图1显示，活性成分单一组分对白色念珠菌抑菌效果不明显，但混和活性组分对白色念珠菌具有良好的抑菌效果。同时细胞实验数据elisa实验表明在培养基中加入混和活性成分后，使用白色念珠菌感染hok口腔上皮细胞，细胞炎性因子表达与对照组相比出现显著下降，说明活性成分可以抑制白色念珠菌增殖同时具体一定的抑炎作用。图3为多肽组分抑菌效果检测，图4多肽组分抑炎作用检测。
[0048]
本发明漱口水与市面常见漱口水对白色念珠菌抑制作用对比
[0049]
随机购买市面上销售量前四的漱口水：品牌1(水、山梨糖醇、甘油、丙二醇、木糖醇、山梨酸钾、香精、薄荷叶油、肉桂树皮提取物、柠檬酸钠等)品牌2(水、甘油、丙二醇、山梨糖醇、泊洛沙姆407、氟化钠0.02％氟、薄荷醇等)品牌3(水、山梨糖醇、丙二醇、泊洛沙姆407、甜菜碱、苯甲酸钠、薄荷醇等)品牌4(水、山梨糖醇、乙醇、peg
‑
40氢化蓖麻油、食用香精、氟化钠0.02％氟、薄荷醇)与本发明漱口水(漱口水由7％的活性成分、4％的乙醇溶液(乙醇溶液体积份数为45％)，余量为水组成。其中活性成分为：将合成后的多肽a和多肽b制备成1μm的多肽溶液后，按摩尔比为1:1的比例混和制成多肽混合液，将维生素c与维生素d以摩尔比为1:6混和溶液，再将多肽混合液与混和溶液以摩尔比为1:8的比例混和后制成活性组分。)进行白色念珠菌抑菌实验检测，在改良沙氏平板上预涂各品牌漱口水与本发明漱口水，10min后使用梯度稀释法将白色念珠菌以104接种于预涂不同漱口水的平板上，恒温培养箱培养24h后观察并统计不同漱口水平板上白色念珠菌的个数。实验结果表明品牌漱口水对白色念珠菌均无明显抑菌效果，本发明漱口水在白色念珠菌个数＜104个时具有良好的抑菌效果，说明本发明漱口水具有预防白色念珠菌感染的效果。
[0050]
表3本发明漱口水与市面常见漱口水对白色念珠菌抑制作用对比
[0051] 对照组处理组品牌125024
±
133622147
±
136品牌241352
±
172137193
±
217品牌334271
±
210323669
±
179品牌423424
±
153219569
±
104本产品25363
±
1378463
±
11
[0052]
本发明漱口水对复发性口腔溃疡预防效果检测
[0053]
选取复发性口腔溃疡患者40例，基于对照、双盲、随机的原则将本组患者分成两组，分别是观察组(20例)和对照组(20例)。两组患者的病情、年龄、性别等具有可比性，不存在着统计学意义。对照组患者给予维生素b2片，每日3次，每次2片。而观察组给予本发明提
供的漱口水预防，每日2
‑
3次，每次20ml左右，两组患者均持续治疗20天。
[0054]
预防效果评定：显效：随访2个月内口腔溃疡无复发或复发小于2次。有效：随访2个月内复发，但是复发间歇期延长、局部灼痛明显减轻、溃疡面有所缓解、复发次数减少。无效：临床症状没有得以缓解，甚至恶化。
[0055]
结果如表4所示：
[0056]
表4两组患者治疗后疗效比较
[0057] 例数显效有效无效总有效率对照组203(15％)6(30％)11(55％)9(45％)观察组1207(35％)8(40％)5(25％)15(75％)
[0058]
本发明的漱口水由7％的活性成分、4％的乙醇溶液(乙醇溶液体积份数为45％)，余量为水组成。其中活性成分为：将合成后的多肽a和多肽b制备成1μm的多肽溶液后，按摩尔比为1:1的比例混和制成多肽混合液，将维生素c与维生素d以摩尔比为1:6混和溶液，再将多肽混合液与混和溶液以摩尔比为1:8的比例混和后制成活性组分。
[0059]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。