益气祛白方标准汤剂、制备工艺、用途及指纹图谱的建立的制作方法

1.本发明涉及中药领域，具体地说，涉及益气祛白方标准汤剂、制备工艺、用途及指纹图谱的建立。


背景技术：

2.益气祛白方为上海市第一人民医院院内制剂，是在我国著名皮肤病学专家朱光斗教授的经验方基础上，根据辨证施治原理并结合临床实践改良而来，具有理气、活血和祛风等功效，临床上用于治疗白癜风。药物组成为黄芪、金雀根、茺蔚子、预知子。方剂中黄芪为君药，其所含黄芪甲苷为主要活性成分，具有补益肺脾之气的作用；金雀根有助黄芪益气之功，同时具有活血之效，为臣药；茺蔚子、预知子疏肝理气，活血祛风，共为佐药。
3.本技术人于2012年申请了专利cn103372052b，保护益气祛白方颗粒冲剂，并公开了其由下述质量百分比的中药材和辅料制成：黄芪10～30％，金雀根20～40％，预知子10～25％，茺蔚子8～20％，余为辅料，所述的辅料为糖粉与糊精，糖粉与糊精的比例为3:1，制备方法包括步骤：按组分配比称量黄芪、金雀根、预知子、茺蔚子药材，加水浸泡0.5h，用10倍量的水，煎煮2次，每次1小时，合并提取液，滤过，浓缩至1:1，加95％乙醇调至溶液中乙醇浓度为40％，4℃下冷浸24h，离心，取上请液，回收乙醇，浓缩至10:1的稠浸膏，加入4倍于稠浸膏的辅料，其中糖粉:糊精为3:1，混合均匀，制备成软材，投入至颗粒机，制粒，干燥，整粒，即得。
4.现团队对益气祛白方提取工艺进一步研究，以规范制备工艺、提高其疗效，和确保临床用药的准确性和疗效的一致性，促进益气祛白方的现代工业化生产和临床应用。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种益气祛白方标准汤剂、制备工艺、用途及指纹图谱的建立方法。
6.第一方面，本发明提供了一种治疗白癜风的中药汤剂，所述中药汤剂由以下重量份配比的原料药制成：黄芪22.7份、金雀根33.4份、茺蔚子17.02份、预知子22.7份；所述中药汤剂的制备工艺为：称取以上各原料药，置陶瓷壶中，第1次煎煮加8
‑
10倍量水，浸泡20
‑
40min后500w武火煮沸，250w文火保持微沸煎煮50
‑
70min，煎液趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；第2次煎煮加7
‑
9倍量水，500w武火煮沸，250w文火保持微沸煎煮30
‑
50min，趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；合并2次滤液，即得。
7.优选地，所述中药汤剂的制备工艺为：称取以上各原料药，置陶瓷壶中，第1次煎煮加9倍量水，浸泡30min后500w武火煮沸，250w文火保持微沸煎煮60min，煎液趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；第2次煎煮加8倍量水，500w武火煮沸，250w文火保持微沸煎煮40min，趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；合并2次滤液，即得。
8.第二方面，本发明提供了所述的中药汤剂的制备工艺，所述中药汤剂的制备工艺为：称取以上各原料药，置陶瓷壶中，第1次煎煮加8
‑
10倍量水，浸泡20
‑
40min后500w武火煮
沸，250w文火保持微沸煎煮50
‑
70min，煎液趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；第2次煎煮加7
‑
9倍量水，500w武火煮沸，250w文火保持微沸煎煮30
‑
50min，趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；合并2次滤液，即得。
9.优选地，所述中药汤剂的制备工艺为：称取以上各原料药，置陶瓷壶中，第1次煎煮加9倍量水，浸泡30min后500w武火煮沸，250w文火保持微沸煎煮60min，煎液趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；第2次煎煮加8倍量水，500w武火煮沸，250w文火保持微沸煎煮40min，趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；合并2次滤液，即得。
10.第三方面，本发明提供了如上所述的中药汤剂在制备治疗白癜风的药物中的应用。
11.第四方面，本发明提供了一种益气祛白汤物质基准，所述益气祛白汤物质基准由以下重量份配比的原料药制成：黄芪22.7份、金雀根33.4份、茺蔚子17.02份、预知子22.7份；所述益气祛白汤物质基准的制备方法包括以下步骤：称取以上各原料药，置陶瓷壶中，第1次煎煮加8
‑
10倍量水，浸泡20
‑
40min后500w武火煮沸，250w文火保持微沸煎煮50
‑
70min，煎液趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；第2次煎煮加7
‑
9倍量水，500w武火煮沸，250w文火保持微沸煎煮30
‑
50min，趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；合并2次滤液。
12.优选地，所述益气祛白汤物质基准的制备方法包括以下步骤：称取以上各原料药，置陶瓷壶中，第1次煎煮加8
‑
10倍量水，浸泡20
‑
40min后500w武火煮沸，250w文火保持微沸煎煮50
‑
70min，煎液趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；第2次煎煮加7
‑
9倍量水，500w武火煮沸，250w文火保持微沸煎煮30
‑
50min，趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；合并2次滤液。
13.第五方面，本发明提供了所述的益气祛白汤物质基准的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：称取以上各原料药，置陶瓷壶中，第1次煎煮加8
‑
10倍量水，浸泡20
‑
40min后500w武火煮沸，250w文火保持微沸煎煮50
‑
70min，煎液趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；第2次煎煮加7
‑
9倍量水，500w武火煮沸，250w文火保持微沸煎煮30
‑
50min，趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；合并2次滤液。
14.优选地，所述制备方法还包括以下步骤：经合并后的滤液转移至旋转蒸发仪中，减压浓缩，条件为：温度60℃，转速80～90r/min，真空度
‑
0.08～
‑
0.1mpa，至体积与原料药重量的比值为5.1
‑
5.2ml/g，即得所述益气祛白汤物质基准。
15.第六方面，本发明提供了所述的益气祛白汤物质基准的检测方法，所述检测方法其色谱条件为：c
18
色谱柱(250mm
×
4.6mm)，检测波长为260nm，进样量为10μl，流速为1.0ml/min，柱温为25℃，梯度洗脱程序为：
16.时间(min)a相％(水
‑
0.1％甲酸)b相％(乙腈)09551585152080204065354595560955
17.本发明优点在于：
18.1、本发明对益气祛白方汤剂的制备方法进行了优化，考察了最佳制备工艺制得的
汤剂、其他制备条件制得的汤剂以及益气祛白方颗粒冲剂的疗效，意外地发现本发明优化后的制备工艺制得的汤剂对白癜风的疗效显著高于益气祛白方颗粒冲剂和其他制备条件制得的汤剂，在临床上具有更好的应用前景。
19.2、本发明的益气祛白方标准汤剂的制备工艺，能获得疗效更高的提取物，经考察发现对活性成分毛蕊异黄酮苷的提取率高，工艺稳定可控，适于工业化生产。
20.3、本发明进一步提供了益气祛白方标准汤剂的指纹图谱，且指纹图谱的测定方法线性关系良好，精密度高，重复性好，具有良好的稳定性，毛蕊异黄酮苷的回收率高，含量测定的准确性好，为益气祛白方汤剂的质量标准建立、质量鉴定等提供了详实可靠的研究基础。
附图说明
21.附图1
‑
5：5个批次的益气祛白方标准汤剂的图谱。峰a是毛蕊异黄酮苷。
具体实施方式
22.下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
23.实施例1益气祛白汤物质基准的制备工艺研究
24.1处方组成的确定
25.本发明为院内制剂，是在我国著名皮肤病学专家的经验方基础上，根据辨证施治原理并结合临床实践改良而来。处方组成为黄芪22.7g、金雀根33.4g、茺蔚子17.02g、预知子22.7g。
26.2提取工艺的指标选择
27.在《中国药典》(2020版)的预知子项下定量指标为α
‑
常春藤皂苷，茺蔚子项下定量指标为盐酸水苏碱，黄芪项下定量指标为黄芪甲苷和毛蕊异黄酮苷，而金雀根药典未收载。由于皂苷类成分水溶性差，而本方用水作为媒介进行提取，提取率较低。同时盐酸水苏碱、黄芪甲苷、α
‑
常春藤皂苷的紫外吸收峰均处于末端，信号不稳定，不利于复方汤剂中其他成分的分析。故在本发明中仅选用毛蕊异黄酮苷作为指标成分。
28.本发明模拟古法制备益气祛白汤，根据实验的可操作性和方便性，最终选择复方水煎液中水溶性较好的毛蕊异黄酮苷作为定量指标，hplc法定量分析。
29.3提取方法的考察
30.3.1古代方剂煎煮法
31.以南朝著名医药学家陶弘景提出的汤剂煎煮时间方案为参考，即：凡煮汤，欲微火，令小沸。其水数依方多少，大略二十两药用水一斗，煮取四升，以此为准。一两按13.8g计，1l按200ml计，换算至现代计量为用药276g左右，加水2000ml(加水量和药材量的比值为7.2)，煎煮至加水量的2/5。故本实验称取处方量比例药材，置煎药壶中，加7倍量水，武火煮沸，保持微沸30min以上，药液至原体积的2/5，停止加热。趁热过滤，滤液备用。精密移取该汤剂1.0ml，置塑料离心管中，13000r/min，离心10min，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，测定毛蕊异黄酮苷含量。精密移取标准汤剂10ml，至已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105℃干燥3h，至干燥器中冷却30min，迅速精密称定重量，测定出膏率。结果见表1。
32.表1.古代煎煮法毛蕊异黄酮苷含量及出膏率(n＝4)
[0033][0034]
古方煎煮法中，加水量与现代标准汤剂相当，但提取率较低，可能是因为只煎煮一次，提取液中毛蕊异黄酮苷溶出量已接近饱和。该结果与前期单因素考察结果接近，单因素考察时采用的是8倍水，浸泡30min，煎煮50min，煎煮一次，毛蕊异黄酮苷含量为0.273mg/g。
[0035]
3.2日本标准汤剂煎煮法
[0036]
在日本，称取相当于日剂量中药制剂的标准药材，粉碎，加20倍量的水，煎煮30min以上，浓缩至原体积的一半，趁热过滤，即可制得标准汤剂。本实验参照日本标准汤剂的制备工艺的操作方法，按日剂量处方比例称取药材，粉碎成最粗粉，置煎药壶中，加20倍量水，武火煮沸，保持微沸30min以上，药液至原体积的一半，停止加热。趁热过滤，滤液备用。精密移取该汤剂1.0ml，置塑料离心管中，13000r/min，离心10min，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，测定毛蕊异黄酮苷含量。精密移取标准汤剂10ml，至已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105℃干燥3h，至干燥器中冷却30min，迅速精密称定重量，测定出膏率。结果见表2。
[0037]
表2.日本标准汤剂毛蕊异黄酮苷含量及出膏率(n＝4)
[0038][0039]
参照日本标准汤剂的制备工艺的操作方法，是称取相当于一袋益气祛白颗粒的各药材处方量(共42.5g)，加20倍水，煎至原体积的一半。此法煎煮时间为150min左右，加水量、微沸时间、毛蕊异黄酮苷的含量等均与厂家原工艺相当，其原因可能是加水量足够多，成分溶出没有达到饱和，而煎煮时间足够长，故提取效率与煎煮两次的工艺相当。
[0040]
3.3现代标准汤剂煎煮法
[0041]
(1)固液比的考察
[0042]
1)头煎固液比
[0043]
称取黄芪22.70g、金雀根34.05g、茺蔚子17.02g、预知子22.70g，共4份，置陶瓷保健壶中。第1次煎煮分别加10、9、8、7倍量水(药材质量：水体积＝10、9、8、7g/ml)，浸泡30min后武火(500w)煮沸，文火(250w)保持微沸煎煮60min，煎液用200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；第2次煎煮加7倍量水，武火(500w)煮沸，文火(250w)保持微沸煎煮50min，煎液用200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却。合并2次滤液，转移至旋转蒸发仪中，减压浓缩(温度60℃，转速80～90r/min，真空度
‑
0.08～
‑
0.1mpa)至500ml，即得益气祛白方标准汤剂。精密移取该标准汤剂1.0ml，置塑料离心管中，13000r/min，离心10min，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，测定毛蕊异黄酮苷含量。精密移取标准汤剂10ml，至已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105℃干燥3h，至干燥器中冷却30min，迅速精密称定重量，测定出膏率。
[0044]
表3.不同头煎固液比毛蕊异黄酮苷含量及出膏率(n＝4)
[0045][0046]
2)二煎固液比
[0047]
称取黄芪22.70g、金雀根34.05g、茺蔚子17.02g、预知子22.70g，共4份，置陶瓷保健壶中，第1次煎煮加9倍量水，浸泡30min后武火(500w)煮沸，文火(250w)保持微沸煎煮60min，煎液用200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；第2次煎煮分别加9、8、7、6倍量水，武火(500w)煮沸，文火(250w)保持微沸煎煮50min，煎液用200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却。合并2次滤液，转移至旋转蒸发仪中，减压浓缩(温度60℃，转速80～90r/min，真空度
‑
0.08～
‑
0.1mpa)至500ml，即得益气祛白方标准汤剂。精密移取该标准汤剂1.0ml置塑料离心管中，13000r/min，离心10min，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，测定毛蕊异黄酮苷含量。精密移取标准汤剂10ml，至已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105℃干燥3h，至干燥器中冷却30min，迅速精密称定重量，测定出膏率。
[0048]
表4.不同二煎固液比毛蕊异黄酮苷含量及出膏率(n＝4)
[0049][0050]
(2)煎煮时间考察
[0051]
1)头煎时间
[0052]
称取黄芪22.70g、金雀根34.05g、茺蔚子17.02g、预知子22.70g，共4份，置陶瓷保健壶中，第1次煎煮加8倍量水，浸泡30min后武火(500w)煮沸，文火(250w)保持微沸分别煎煮60、50、40、30min，煎液用200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；第2次煎煮加8倍量水，武火(500w)煮沸，文火(250w)保持微沸煎煮30min，煎液用200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却。合并2次滤液，转移至旋转蒸发仪中，减压浓缩(温度60℃，转速80～90r/min，真空度
‑
0.08～
‑
0.1mpa)至500ml，即得益气祛白方标准汤剂。精密移取该标准汤剂1.0ml置塑料离心管中，13000r/min，离心10min，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，测定毛蕊异黄酮苷含量。精密移取标准汤剂10ml，至已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105℃干燥3h，至干燥器中冷却30min，迅速精密称定重量，测定出膏率。
[0053]
表5.不同头煎时间毛蕊异黄酮苷含量及出膏率(n＝4)
[0054][0055]
2)二煎时间
[0056]
称取黄芪22.70g、金雀根34.05g、茺蔚子17.02g、预知子22.70g，共4份，置陶瓷保健壶中，第1次煎煮加8倍量水，浸泡30min后武火(500w)煮沸，文火(250w)保持微沸煎煮60min，煎液用200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；第2次煎煮加8倍量水，武火(500w)煮沸，文火(250w)保持微沸分别煎煮50、40、30、20min，煎液用200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却。合并2次滤液，转移至旋转蒸发仪中，减压浓缩(温度60℃，转速80～90r/min，真空度
‑
0.08～
‑
0.1mpa)至500ml，即得益气祛白方标准汤剂。精密移取该标准汤剂1.0ml置塑料离心管中，13000r/min，离心10min，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，测定毛蕊异黄酮苷含量。精密移取标准汤剂10ml，至已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105℃干燥3h，至干燥器中冷却30min，迅速精密称定重量，测定出膏率。
[0057]
表6.不同二煎时间毛蕊异黄酮苷含量及出膏率(n＝4)
[0058][0059]
(3)浸泡时间的考察
[0060]
由于现代工艺提取前一般需要浸泡，故考察浸泡30、60和90min对于毛蕊异黄酮苷含量及出膏率的影响，结果见表7。
[0061]
表7.不同浸泡时间毛蕊异黄酮苷含量及出膏率(n＝4)
[0062]
[0063][0064]
(4)煎煮次数考察
[0065]
称取黄芪22.70g、金雀根34.05g、茺蔚子17.02g、预知子22.70g，共3份，置陶瓷保健壶中，加8倍量水，浸泡30min后武火(500w)煮沸，文火(250w)保持微沸煎煮50min，分别煎煮1、2、3次，煎液用200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却。转移至旋转蒸发仪中，减压浓缩(温度60℃，转速80～90r/min，真空度
‑
0.08～
‑
0.1mpa)至500ml，即得益气祛白方标准汤剂。精密移取该标准汤剂1.0ml置塑料离心管中，13000r/min，离心10min，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，测定毛蕊异黄酮苷含量。精密移取标准汤剂10ml，至已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105℃干燥3h，至干燥器中冷却30min，迅速精密称定重量，测定出膏率。结果见表8。
[0066]
表8.不同浸泡时间毛蕊异黄酮苷含量及出膏率(n＝4)
[0067][0068]
(5)提取验证试验
[0069]
根据单因素实验结果，最佳工艺为：称取黄芪22.70g、金雀根34.05g、茺蔚子17.02g、预知子22.70g，置陶瓷保健壶中。第1次煎煮加9倍量水，浸泡30min后武火(500w)煮沸，文火(250w)保持微沸，文火煎煮60min，煎液用200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；第2次煎煮加8倍量水，武火(500w)煮沸，文火(250w)保持微沸，文火煎煮40min，煎液用200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却。合并2次滤液，转移至旋转蒸发仪中，减压浓缩(温度60℃，转速80～90r/min，真空度
‑
0.08～
‑
0.1mpa)至500ml，即得益气祛白方标准汤剂。验证实验结果见表9。经验证，该优选的提取工艺提取率高，工艺稳定。
[0070]
表9.最佳工艺验证结果
[0071]
[0072][0073]
实施例2益气祛白方标准汤剂治疗白癜风的药效学研究
[0074]
1实验方法
[0075]
将80只豚鼠(普通级，雄性，体重200g～250g，黑色或有较多黑色花斑)随机分为正常对照组、模型组、阳性药物组(白癜风胶囊)、颗粒冲剂组(按照本技术人的专利cn103372052b公开的实施例2的方法制备)、标准汤剂组(按照本技术实施例1最佳工艺制备的汤剂)、对照一汤剂组(按照本技术实施例1最佳工艺，不同在于第一次煎煮时间为75min，制备的汤剂)、对照二汤剂组(按照本技术实施例1最佳工艺，不同在于第一次煎煮时间为45min，制备的汤剂)、对照三汤剂组(按照本技术实施例1最佳工艺，不同在于浸泡时间为90min)，每组10只。剪去豚鼠颈背部毛发，再剃光脱毛约3cm
×
3cm的面积。除正常对照组外，其余各组豚鼠均用5％过氧化氢外涂脱毛区，每次0.5ml，每天2次，连续40d，正常对照组外涂等量的生理盐水。40天后，除正常对照组和模型组外，各给药组开始灌胃给药，颗粒冲剂组和各汤剂组的给药剂量均相当于为5.0g生药/(kg
·
d)，阳性药物组给予白癜风胶囊928mg/(kg
·
d)。正常对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃。每天一次，连续30天。实验期间，各组豚鼠的颈背部涂抹氧化氢的部位每周剪毛、剃光一次。治疗结束后，将豚鼠用20％乌拉坦麻醉，腹主动脉抽血，测血浆单胺氧化酶(mao)、血浆胆碱酯酶(che)及血浆酪氨酸酶活性(tyr)；在脱毛区的中心取1cm
×
1cm皮肤，用中性甲醛固定，石蜡包埋，切片，用硫酸亚铁lillie法进行黑色素染色，用计算机进行图像分析，每组每个染色切片随机选取相同视野，分析该视野中黑色素面积与该视野面积的比值(即为黑色素的面密度(sd))。实验数据采用spss 20.0统计软件处理，数据以均数
±
标准差表示，多组间均数比较采用单因素方差分析(one
‑
way anova)，两两比较采用lsd法。p＜0.05认为差异有统计学意义。
[0076]
2实验结果
[0077]
2.1各组豚鼠生化指标检测结果
[0078]
检测各组豚鼠血浆mao、che和tyr，结果表明，模型组与正常组比较，血浆mao和che活性均显著升高，差异具有统计学意义(p＜0.01)，而血浆tyr含量显著下降，差异具有统计学意义(p＜0.05)。与模型组比较，各给药组豚鼠血浆mao和che活性均显著降低，差异具有统计学意义(p＜0.01)，血浆tyr含量均显著升高，差异具有统计学意义(p＜0.01)。与本发明标准汤剂组比较，发现标准汤剂组豚鼠三个生化指标相比于其他给药组均有更显著的改善，差异均具有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)。
[0079]
表10.各组豚鼠血浆mao、che和tyr比较
[0080][0081]
注：模型组vs.正常对照组，*p＜0.05，**p＜0.01；给药组vs.模型组，#p＜0.05，##p＜0.01；给药组vs.标准汤剂组，
△
p＜0.05，
△△
p＜0.01。
[0082]
2.2各组豚鼠病理部位皮肤黑色素面密度检测结果
[0083]
各组豚鼠过氧化氢涂抹部位黑色素的面密度统计结果表明，相比于正常对照组，模型组的病理部位皮肤黑色素面密度显著降低，差异具有统计学意义(p＜0.01)。与模型组比较，各给药组豚鼠病理部位皮肤黑色素面密度增加，差异也均具有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)。而标准汤剂组豚鼠病理部位皮肤黑色素面密度显著高于其余各给药组，差异具有显著性(p＜0.05或p＜0.01)。
[0084]
表11.各组豚鼠病理部位皮肤黑色素面密度比较
[0085][0086][0087]
注：模型组vs.正常对照组，**p＜0.01；给药组vs.模型组，#p＜0.05，##p＜0.01；给药组vs.标准汤剂组，
△
p＜0.05，
△△
p＜0.01。
[0088]
白癜风动物模型实验结果表明，本发明标准汤剂表现出更优异的疗效。
[0089]
实施例3益气祛白汤物质基准的指纹图谱研究
[0090]
1指标成分定量方法学考察
[0091]
(1)供试品的制备
[0092]
精密移取实施例1最佳工艺制备的标准汤剂1.0ml置塑料离心管中，13000r/min，离心10min，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，测定毛蕊异黄酮苷含量。
[0093]
(2)毛蕊异黄酮苷的含量测定
[0094]
①
色谱条件
[0095]
ymc c
18
色谱柱(250mm
×
4.6mm)，检测波长为260nm，进样量为10μl，梯度洗脱(条件见表12)，流速为1.0ml/min，柱温为25℃。
[0096]
表12.梯度洗脱条件
[0097]
时间(min)a相％(水
‑
0.1％甲酸)b相％(乙腈)09551585152080204065354595560955
[0098]
②
线性关系考察
[0099]
取毛蕊异黄酮苷对照品，加甲醇稀释，得到浓度为1.042mg/ml的毛蕊异黄酮苷溶液，以此为母液，用甲醇分别制备浓度为5.21，10.42，26.05，52.10，104.2，208.4μg/ml的标准品溶液。吸取上述六种浓度的对照品溶液10μl，注入hplc进样系统，以毛蕊异黄酮苷浓度
‑
峰面积为坐标轴，绘制标准曲线y＝0.292x
‑
0.3234，r＝0.9998，毛蕊异黄酮苷在5.21～208.4μg范围内线性良好。
[0100]
③
精密度实验
[0101]
精密吸取中浓度的对照品溶液10μl，按确立的hplc分析方法测定，重复进样6次。
[0102]
结果表明，仪器精密度良好。
[0103][0104]
④
重复性实验
[0105]
取同一份标准汤剂，按供试品处理方法制得供试品，平行6份，按确立的hplc分析方法测定。结果表明，该方法重复性良好。
[0106][0107]
⑤
稳定性实验
[0108]
按供试品处理方法制得供试品，取同一供试品溶液，分别于室温下放置0、2、4、6、8、12、24h，进行hplc分析测定，实验结果表明，该样品在24h内有良好的稳定性。
[0109][0110][0111]
⑥
加样回收率实验
[0112]
取已知含量的冻干品，共9份，分别加入相当于供试品中毛蕊异黄酮苷成分含量的50％、100％、150％的对照品，制得供试品，平行处理3份，进行hplc分析测定，实验结果表明，该方法测定毛蕊异黄酮苷的含量回收率高，准确性好。
[0113][0114]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。