泡叶藻萃取物用于提升皮肤弹性的用途的制作方法

泡叶藻萃取物用于提升皮肤弹性的用途
1.本技术为申请人根据母案申请(申请号：201810445513.1，发明名称：泡叶藻萃取物用于调节基因群组表现的用途)所提出的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及泡叶藻萃取物的用途，特别是关于一种泡叶藻萃取物用于提升皮肤弹性的用途。


背景技术：

3.皮肤是人体隔绝外界环境中的伤害，例如紫外线、病原体、摩擦力等，与防止水分流失的第一道防线。皮肤由外向内依序包含表皮层、主要由结缔组织构成的真皮层、及皮下组织。表皮层是皮肤的最外层并且不断更新。表皮层与真皮层间存在持续分裂的细胞(如纤维母细胞、角质细胞、黑色素细胞)，该些细胞的活动对紫外线非常敏感。真皮层含有胶原蛋白(collagen)、弹力蛋白(elastin)、及玻尿酸(hyaluronic acid)，其赋予肌肤弹性和支撑力量。随着年龄增长，皮肤会出现皱纹、细纹、松弛、凹陷、毛孔粗大等老化现象。这些皮肤老化现象的形成与诸多因素有关，例如暴露于高量的紫外线(主要是紫外线a)会使胶原蛋白或弹力蛋白受损，真皮层内的胶原蛋白、弹力蛋白、及玻尿酸等分子的含量随年龄增加而减少，这些因素皆会降低皮肤饱满度与弹性。
4.市面上用以改善前述皮肤老化现象的方法包含使用防晒品以减少紫外线所致皮肤老化，直接注射胶原蛋白或玻尿酸至真皮层，及以口服方式补充胶原蛋白或玻尿酸等。然而，防晒品含有的化学物质可能引发光敏性，以致该些化学物质与紫外线的结合对皮肤产生不良影响，例如皮疹或更严重的晒伤。此外，注射至皮肤的胶原蛋白或玻尿酸易随时间被体内酵素分解，导致必须定期施打该些物质，成本高昂。以口服方式补充胶原蛋白或玻尿酸会造成该些大分子在肠胃道中被消化为小分子的胺基酸或单醣，尽管身体能利用这些胺基酸或单醣合成蛋白质或多醣，但不必然形成胶原蛋白或玻尿酸，因此补充胶原蛋白或玻尿酸的实质效果有限。
5.有鉴于此，开发一种成分天然又能有效保护皮肤免于紫外线伤害及推迟皮肤老化的新颖组成物，实有其必要。


技术实现要素：

6.缘此，本发明的一目的在提供一种泡叶藻(ascophyllumnodosum)萃取物用于制备提升皮肤弹性的组合物的用途，其中该泡叶藻萃取物是以一溶剂萃取一泡叶藻而获得。
7.在本发明的一实施例中，该泡叶藻萃取物促进玻尿酸合成酶3(has3)、、赖胺酰氧化酶(lox)、或其组合的基因表现，而提升皮肤弹性。
8.在本发明的一实施例中，该泡叶藻萃取物抑制基质金属蛋白酶2(mmp2)的基因表现，而提升皮肤弹性。
9.在本发明的一实施例中，该溶剂为水、醇类、或醇水混合物，该溶剂与该泡叶藻的
chemical公司购买二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，简称dmso)。
23.细胞培养
24.以下实施例使用初代人类表皮角质细胞(human epidermal karatinocyte)hpek
‑
50(cellntec，瑞士)及人类皮肤纤维母细胞(human skin fibroblast)ccd
‑
966sk(bcrc 60153)进行实验。hpek
‑
50在37℃、5％二氧化碳的条件下培养于sfm培养基。ccd
‑
966sk细胞在37℃、5％二氧化碳的条件下培养于添加10％fbs、0.1mm非必需胺基酸、1.5g/l碳酸氢钠、1mm丙酮酸钠的mem培养基，以下称细胞培养基。
25.基因表现量分析
26.细胞中特定基因的表现量是利用定量聚合酶链锁反应(quantitative polymerase chain reaction，简称qpcr)技术测定，其步骤简述如下。依据厂商使用说明，以核糖核酸萃取套组(rna extraction kit；geneaid)自细胞分离出rna后，于37℃下以反转录酶iii reverse transcriptase(invitrogen)将rna反转录为互补脱氧核醣核酸(cdna)。其后，利用qpcr套组(kapa cybr fast qpcr kit(2x)；kapa biosystems)以及目标基因与作为内部对照的甘油醛3
‑
磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3
‑
phosphate dehydrogenase，gapdh)基因的引物对(表1)在pcr反应仪(applied biosystems steponeplus
tm real
‑
time pcr systems；thermo fisher scientific)对该cdna进行pcr，以取得各基因的解链曲线(melting curve)及循环阈值(ct)。
27.表1
28.[0029][0030]
最终，使用2
‑
δδct
方法测定目标基因的相对表现量。所谓相对表现量定义为实验组的一目标基因相对于控制组的同一基因的rna表现量倍数变化。该方法以gapdh基因的循环阈值作为内部对照的参考基因的循环阈值，按照以下公式计算倍数变化：
[0031]
δc
t
＝实验组或控制组的目标基因的c
t
‑
内部对照的c
t
[0032]
δδc
t
＝实验组的δc
t
‑
控制组的δc
t
[0033]
倍数变化＝2
‑
δδct平均值
[0034]
mtt分析
[0035]
细胞存活率或增生率是以mtt分析测定。简言之，将mtt溶液(4mg/ml mtt溶于pbs溶液)依15μl/孔添加至96孔盘中的细胞，于37℃反应4小时。移除反应液后，将dmso依50μl/孔添加至细胞并震荡反应10分钟以溶解所生成的甲臜(formazan)结晶。最终，使用elisa读盘机(enzyme
‑
linked immunosorbent assay reader；biotek)测量该细胞混合物在570nm的吸光值(o.d.570)。
[0036]
统计分析
[0037]
统计上显著差异是以excel软件的学生t检定判定。
[0038]
实施例1
[0039]
泡叶藻萃取物的制备
[0040]
首先，将泡叶藻洗净，并且以例如切割、研磨等方式将其处理为适当大小，再以水、醇类、或醇水混合物为溶剂对该经处理的泡叶藻进行萃取。该溶剂较佳为水，且该溶剂与泡叶藻的液固比5～20：1～5。萃取温度为介于50℃～100℃，较佳为80℃～95℃。本实施例中萃取时间为0.5～3小时。
[0041]
经上述萃取步骤所得泡叶藻萃取物冷却至室温后，可以400目(mesh)的滤网过滤，以移除残余固体物。该过滤后的泡叶藻萃取物可进一步在45℃～70℃进行减压浓缩而获得一浓缩产物。为获得固态的泡叶藻萃取物，可将前述经减压浓缩的泡叶藻萃取物以喷雾干燥方式去除溶剂，因此获得泡叶藻萃取物粉末。
[0042]
实施例2
[0043]
泡叶藻萃取物提升表皮角质细胞中特定基因群组的表现量
[0044]
为探讨泡叶藻萃取物对皮肤细胞中基因表现的调节作用，本实施例以qpcr技术测定初代人类表皮角质细胞hpek
‑
50经泡叶藻的水萃取物处理后的基因表现变化。首先，将1.5
×
105个hpek
‑
50细胞接种于含有2ml细胞培养基的6孔盘的各孔，置于37℃下培养。其次，该些细胞以2ml含1mg/ml泡叶藻水萃取物的sfm培养基处理(三重复试验)，此是作为实验组。同时，另设置一组以不含泡叶藻水萃取物的sfm培养基处理的hpek
‑
50细胞作为控制组。经过6或24小时后，收集该些细胞以进行qpcr。
[0045]
上述hpek
‑
50细胞中tgm1、krt14、flg、aqp3、gba、has3、has2、mmp2、及lox等基因的相对表现量如图1a及图1b所示。依据图1a，相对于控制组，施予浓度1mg/ml的泡叶藻萃取物6小时或24小时会明显提升hpek
‑
50细胞中tgm1、krt14、flg、aqp3、gba、及has3的基因表现。依据图1b，相对于控制组，施予浓度1mg/ml的泡叶藻萃取物24小时会显著提升lox及has3的基因表现及抑制mmp2的基因表现。由于tgm1、krt14、flg、aqp3、gba、及has3基因的表现上调与增加皮肤屏障及含水量相关，lox及has3基因的表现上调与mmp2基因的表现下调与提升皮肤弹性相关，前述实验结果说明泡叶藻萃取物有助于提高皮肤保湿度及弹性。
[0046]
实施例3
[0047]
泡叶藻萃取物提升皮肤纤维母细胞对紫外线照射的抵抗力
[0048]
为检验泡叶藻萃取物是否影响皮肤对紫外线照射的抵抗力，利用细胞存活分析(mtt分析)评估经过紫外线a照射的人类皮肤纤维母细胞ccd
‑
966sk在泡叶藻萃取物处理后的细胞存活率。简言之，将5
×
103个ccd
‑
966sk细胞接种于含有200μl细胞培养基的96孔盘的各孔，在37℃下培养24小时后，移除细胞培养基，并添加200μl含1mg/ml泡叶藻水萃取物的细胞培养基至细胞以作为实验组，其于37℃下再培养24小时。其后，使细胞在紫外线照射箱(vilber)中接受12j/cm2紫外线a(波长315
–
400nm)照射1小时，此辐射剂量会造成半数细胞死亡。同时，另设置一组经紫外线a照射但以不含泡叶藻水萃取物的细胞培养基处理的细胞以作为负控制组，及设置一组未予紫外线a照射且仅以不含泡叶藻水萃取物的细胞培养基处理的细胞以作为空白对照组。最终，进行mtt分析及依下列公式计算各组细胞的细胞增生率：
[0049]
细胞增生率＝各组的o.d.570/空白对照组的o.d.570
×
100％
[0050]
图2显示上述ccd
‑
966sk细胞在不同处理后的细胞存活率。依据图2，负控制组相比空白对照组有显著降低的细胞存活率，显示紫外线a照射会造成皮肤纤维母细胞大量死亡。然而，泡叶藻水萃取物的处理却使细胞存活率明显回升，说明泡叶藻萃取物能提升皮肤对紫外线的抵抗力。此结果与实施例2中所述泡叶藻萃取物会促进增加皮肤屏障的基因表现相符。
[0051]
综上所述，本发明以水、醇类、或醇水混合物为溶剂所萃取得的泡叶藻萃取物能调节tgm1、krt14、flg、aqp3、gba、has3、has2、mmp2、及lox等基因的表现，因而导致提升皮肤含水量与弹性及对紫外线的抵抗力。该泡叶藻萃取物可用于制备一具有护肤功效的医药品组合物，且该组合物可具有粉末、颗粒、溶液、胶体、或膏体的剂型，藉由口服、涂抹于皮肤等方式给予一个体。
[0052]
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形
都应属于本发明权利要求的保护范围。