五环三萜类天然产物用于逆转肿瘤铂类耐药药物的用途

1.本发明涉及一种五环三萜类化合物的新用途，具体涉及一种五环三萜类化合物作为特异性去sumo化蛋白酶1抑制剂在制备逆转肿瘤铂类耐药药物中的用途。


背景技术：

2.下面关于与本发明相关的背景介绍用于帮助对本发明的理解，但不应被认为是本发明的已有技术。所有引用的出版物都被全文参考。
3.卵巢癌是最常见的妇科癌症之一，在全球女性死亡率中排名第二(lheureux等人，2019)。铂类药物是临床上卵巢癌化疗的主要药物(kuroki和guntupalli，2020)。然而20％至30％的卵巢癌患者表现出铂类耐药，对替代单药化疗的反应较差(＜15％)，其中位生存期＜9个月(pujade-lauraine等人，2019；naumann等人，2011)。尽管在过去的几十年中已经提出了多种耐药机制，但耐铂卵巢癌仍然是一个复杂的、受多种因素影响的难治性肿瘤，临床治疗中迫切需要耐药逆转药物(naumann等人，2011)。
4.最近，新的senp1/jak2轴被认为是卵巢癌铂耐药的关键机制。特异性去sumo化蛋白酶1(senp1)直接催化jak2的去sumo化修饰(sedek and stous，2013)，去sumo化的jak2在细胞质积聚和激活，介导随后的铂耐药(li等人，2021)。因此从理论上讲，抑制senp1活性可以下调jak2的去sumo水平，逆转卵巢癌的铂耐药。天然的五环三萜类senp1抑制剂momordin ic(wu等，2016年)已被证明能显著地克服铂耐药的卵巢癌，并与顺铂显示出明显的协同作用，抑制肿瘤细胞的增殖(li等，2021年)。
5.已经报道了一些天然的senp1抑制剂，例如streptonigrin(ambaye等人，2018)、vialinin a/thelephantin g(yoshioda等人，2016)、tripolde(huang等人，2012)和momordin ic(wu等人，2016)。鉴于momordin ic中β-d-木糖和β-d-葡萄糖醛酸的结构通常被认为不是生物活性所必需的(lin等人，2016)。
6.我们发现其五环三萜苷元是senp1抑制活性的关键结构骨架。虽然五环三萜类化合物是最常见的天然产物类型之一，但到目前为止关于五环三萜类天然产物对senp1的抑制活性尚未见报道，其对senp1抑制活性较强的化合物能够在理论上克服肿瘤铂类耐药现象，为肿瘤治疗提供新的用药选择。


技术实现要素：

7.本发明旨在针对肿瘤细胞容易产生对铂类药物的耐药性，提供一种新的五环三萜类天然产物作为senp1抑制剂逆转该耐药性的应用，以解决现有技术中肿瘤铂类耐药难以克服的技术问题，所述五环三萜类天然产物具有如下结构通式：
[0008][0009]
其中：
[0010]
a)r1独立地选自：-h、-oh或＝o；
[0011]
b)r2独立地选自：-h、-oh或＝o；
[0012]
c)r3独立地选自：-h、-oh或＝o；
[0013]
d)r4独立地选自：-ch3、-ch2oh、-cho或-cooh；
[0014]
e)r5独立地选自：-h、-ch3或-ch2oh；
[0015]
f)r5独立地选自：-h或-oh；
[0016]
g)r6独立地选自：-h或-ch3；
[0017]
h)r7独立地选自：-h或-ch3；
[0018]
i)r8独立地选自：-h、-oh或＝o；
[0019]
j)r9独立地选自：-h或-ch3；
[0020]
k)r
10
独立地选自：-h或-ch3；
[0021]
1)r
11
独立地选自：-h、-oh或＝o；
[0022]
m)r
12
独立地选自：-h或-ch3；
[0023]
n)r
13
独立地选自：-ch3或-cooh；
[0024]
o)r
14
独立地选自：-h；
[0025]
p)r
1s
独立地选自：-h或-oh；
[0026]
q)r
16
独立地选自：-ch3、-ch2oh、-cho或-cooh；
[0027]
r)r
17
独立地选自：-h或-oh；
[0028]
s)r
18
独立地选自：-ch3、-cooh或cooch3；
[0029]
t)r
19
独立地选自：-h或-oh；
[0030]
u)r
20
独立地选自：-h或-oh；
[0031]
v)环a独立地选自：
[0032]
w)环b独立地选自：w)环b独立地选自：
[0033]
x)环c独立地选自：
[0034]
y)环e独立地选自：
[0035][0036]
作为优选，所述的化合物或其在药学上可用的盐，选自：
[0037]
a)乌苏烷型(ursane-type)
[0038][0039]
b)齐墩果烷型(oleanane-type)
[0040][0041]
c)羽扇豆烷型(lupeolic-type)
[0042][0043]
d)木栓烷型(friedelane-type)
[0044][0045]
本发明所述的五环三萜类化合物或其在药学上可用的盐可用于制备抑制特异性去sumo化蛋白酶1的活性药物方面的应用。
[0046]
进一步地，所述化合物或其在药学上可用的盐在抗肿瘤治疗方面的应用。
附图说明
[0047]
图1：代表性天然产物抑制senp1活性的梯度浓度实验结果图；
[0048]
图2：代表性天然产物抑制jak2蛋白去sumo化修饰的免疫沉淀实验结果图；
[0049]
图3：代表性天然产物单独使用抑制铂类耐药卵巢癌细胞活力的实验结果图；
[0050]
图4：代表性天然产物联合顺铂使用抑制铂类耐药卵巢癌细胞活力的实验结果图。
具体实施方式
[0051]
本发明中的化合物及制备可以通过下面的实例更好地说明。这些实例不应被解读为本发明的局限，现在已知的或将来开发的这些化合物的变化体也应被认为属于本发明的范畴并申请保护。
[0052]
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在一下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
[0053]
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(
±
10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的是可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
[0054]
除有定义外，以下实施例中所使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
[0055]
实施例1天然产物senp1抑制活性筛选实验
[0056]
1.反应液缓冲液
[0057]
配制20mm tris-hcl ph8.0，20nm nacl，2mm cacl2和2mm dtt
[0058]
2.rangap-sumo1制备
[0059]
参考试剂盒sumoylation kit(enzo，bml-uw8955)步骤(需冰上操作)：
[0060]
①
按产品手册中所示顺序将分析成分加入0.6ml试管中；
[0061]
②
轻轻地混合试管内容物；
[0062]
③
在37℃下孵育1小时。
[0063]
3.体外senp1c活性筛选实验
[0064]
①
0.6ml ep管中加入反应缓冲液稀释的重组人senp1蛋白催化域(senp1c，abcam，ab188689)，使最终反应浓度为20nm；
[0065]
②
再分别加入dmso或5μm的待测化合物，用移液枪混匀，37℃预孵育10min，孵育产物放冰上；
[0066]
③
上述孵育产物中加入底物δrangap1-sumo1(终浓度为25nm)，使总体积达到40μl，37℃反应30min，取出反应产物置冰上；
[0067]
④
加入10μl 5x非还原十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶加载缓冲液，然后加热至95℃，5分钟后进行淬火分析；
[0068]
⑤
进行western blot分析，将蛋白条带扫描成电子版，用scion corporation软件分析目的蛋白条带灰度值，以未加入senp1蛋白的δrangap1-sumo1计为抑制率100％，计算各组天然产物的senp1抑制率(表1、2、3)。
[0069]
表1乌苏烷型五环三萜化合物对senp1抑制活性测试结果
[0070]
[0071]
[0072]
[0073][0074]
[0075]
表2齐墩果烷型五环三萜化合物对senp1抑制活性测试结果
[0076]
[0077]
[0078]
[0079]
[0080][0081]
表3羽扇豆烷型和木栓烷型五环三萜化合物对senp1抑制活性测试结果
[0082]
[0083]
[0084][0085]
选取其中的代表性化合物坡模酸(pomolic acid)和委陵菜酸(tormentic acid)，对其进行抑制senp1活性的梯度浓度实验。结果如图1所示，其抑制senp1活性的ic
50
值分别为5.13μm(坡模酸)和4.34μm(委陵菜酸)。
[0086]
实施例2免疫沉淀法测定代表性天然产物抑制sumo化jak2水平实验
[0087]
取对数生长期的铂类耐药的人卵巢癌skov3细胞接种于25cm2细胞培养瓶中，过夜培养；待细胞完全贴壁恢复形态后，分别更换为含终浓度为5μm的坡模酸、委陵菜酸、科罗索酸和刺囊酸的培养基，继续培养24h；去除培养基，用pbs清清洗涤两次，用0.25％胰酶消化，1500rpm离心5min收集细胞；每个样品加入200μlripa裂解液(已加入蛋白酶抑制剂pmsf、抑肽酶)，冰上裂解1h，每15min振荡混悬一次；4℃低温离心，14000
×
g离心15min，小心吸取上层清液(避免吸到沉淀)。对回收的上层清液进行蛋白定量。
[0088]
采用bca法进行蛋白定量。配制蛋白标准液，稀释至终浓度为0.5mg/ml；将稀释后的标准液按0、1、2、4、8、12、16和20μ1分别加到96孔板的孔中，加pbs补足到20μl，相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mg/ml。取4μl样品，pbs补足到80μl，
混匀后取20μl加到96孔板样品孔中，做3个复孔。根据标准品和样品的数量配制bca工作液，bca试剂a与bca试剂b按50∶1的比例配制适量bca工作液，充分混匀，现用现配。各孔加入200μl bca工作液，37℃孵育30min；用酶标仪测定562nm波长的吸光度；根据标准曲线和样品体积计算出样品的蛋白浓度。
[0089]
取500μg裂解液(加入1μg igg和20μl proteina/g-beads，4℃缓慢摇晃孵育30min，在4℃以3000rpm速度离心5min，收集上清)，将2μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4℃缓慢摇晃孵育过夜。取20μl protein a/g-beads，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3000rpm离心5min。将预处理过的20μl protein a/g-beads加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中，在4℃下缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein a/g-beads偶连。免疫沉淀反应后，在4℃以3000rpm速度离心5min，将protein a/g-beads离心至管底，将上清小心吸去。protein a/g-beads用1ml裂解缓冲液洗5次，最后加入20μl的2
×
sds加样缓冲液，金属浴98℃5min。进行sds-page分析。
[0090]
蛋白电泳及转印：根据检测指标的分子量大小选取分离胶浓度，浓缩胶均为5％，配制方法详见表1，进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds polyacrylamide gel electrophoresis，sds-page)。蛋白上样量控制在40μg。蛋白电泳，70v电泳25min，待样品跑到浓缩胶与分离胶的分界线，提高电压到110v，继续电泳80min，至上样缓冲液的蓝色条带跑到末尾，电泳停止。蛋白转印采用湿转法，在恒流100ma下转印120min(转印时间根据蛋白分子量定，蛋白分子量越小，转膜时间相应减少)，将蛋白转至pvdf膜上。
[0091]
表4分离胶和浓缩胶的配制方法和组成
[0092][0093][0094]
抗体孵育及显色：将pvdf膜放入tbst溶液配制的5％脱脂奶粉溶液中封闭1h以上；按照检测蛋白指标的分子量大小切取条带，加入相应的一抗，放于4℃冰箱中孵育过夜。之后用tbst溶液洗涤条带3次，每次10min；将膜与相应的辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，hrp)标记的二抗室温孵育2h，用tbst溶液洗涤条带2次，每次5min，随后改为pbs溶液洗涤条带1次，洗涤5min。采用ecl法于暗室中利用x射线胶片曝光获得蛋白表达图
像。将蛋白条带扫描成电子版，用scion corporation软件分析目的蛋白条带灰度值，以senp1蛋白为内参，计算各目的蛋白相对表达量(目的蛋白灰度值/β-actin灰度值)。
[0095]
代表性天然产物抑制sumo化jak2水平的结果见图2，结果表明，与科罗索酸(corosolic acid)和刺囊酸(echinocystic acid)相比，坡模酸(pomolic acid)和委陵菜酸(tormentic acid)能够有效降低铂类耐药的人卵巢癌skov3细胞中sumo化jak2水平。
[0096]
实施例3代表性天然产物联合顺铂使用抑制铂类耐药卵巢癌细胞活力的实验
[0097]
将处于对数生长期的顺铂耐药skov3细胞按照3000细胞/孔的密度接种于96孔板中，过夜培养。显微镜观察细胞贴壁且形态恢复后，吸除原培养基，用d-hanks缓冲液冲洗，加入无胎牛血清的培养基配制的代表性天然产物(坡模酸、委陵菜酸、科罗索酸和刺囊酸)溶液，终浓度依次为1.56、6.25、25、100、500μm(仅坡模酸和委陵菜酸)、，每组设置三个复孔，并设置相应空白组，对照组内加入0.1％dmso，每组设3个复孔，并设对应的空白组；在37℃、5％co2条件下继续培养48h，用硫代罗丹明b(srb)法检测细胞存活率，计算其抑制细胞活力的ic
50
值，并绘制抑制率曲线(图3)。
[0098]
采用srb法测定天然产物联合顺铂对卵巢癌细胞活力的抑制活性。设置顺铂空白对照组，顺铂的给药浓度依次为0.63、1.25、2.5、5、10、20μm，每组天然产物的给药浓度为5μm。细胞的培养和给药孵育条件相同，计算其抑制细胞活力的ic
50
值和联合指数(ci)，并绘制抑制率曲线(图4)。使用以下公式计算组合指数(ci)：
[0099]
ci＝(d)1/(dχ)1+(d)2/(dχ)2。
[0100]
(dχ)1和(dχ)2分别为顺铂和苷元单独作用对细胞活力的抑制ic
50
值，(d)1为联合用药组顺铂的ic50值，(d)2为苷元(5μm)给药剂量。
[0101]
结果表明坡模酸和委陵菜酸与顺铂联用抑制铂耐药skov3细胞活力的ci值分别为0.23和0.30，能够有效提高顺铂耐药skov3细胞对顺铂的敏感性，在肿瘤治疗方面具有应用前景。