灵芝孢子粉多糖肽在制备治疗癌因性疲乏的药物中的应用的制作方法

1.本发明属于医药提取以及应用技术，特别是涉及一种灵芝孢子粉多糖肽在制备治疗癌因性疲乏的药物中的应用。


背景技术：

2.癌因性疲乏(cancer
‑
related fatigue，crf)也叫癌症相关性疲乏，是临床恶性肿瘤常见的症状之一，nccn指南将crf描述为“一种由肿瘤或抗肿瘤治疗引起的令人不安的、持续的身体、情感和/或认知方面的主观的疲劳感觉及精力衰竭感，并干扰日常生活及功能”；国际疾病分类标准第10版(icd 10)描述crf的症状为非特异性的无力、虚弱、全身衰退、嗜睡、疲劳。其具有持续性以及非普遍性的特点，如虚弱、活动无耐力、注意力不集中、动力或兴趣减少等；广泛意义上，crf是患者个体在生理、心理、功能性和社会性方面的一种多维度主观体验。
3.总之，crf是由于癌症及相关治疗导致患者长期紧张和痛苦而产生的一系列主观感受，是一种对疲乏的主观感觉，通常是以体力、精力降低为主要特征；与一般的疲乏不同，crf具有程度重、与活动或能量输出不成比例、不能通过睡眠及休息来缓解、持续时间长等特征；在临床上可出现无精力、虚弱、懒散、冷漠、思想不集中、记忆力减退、沮丧等多种表现形式；故crf可严重影响患者的身体、心理状况和家庭、社会功能，以及生活质量。
4.灵芝(学名：ganodermalucidum karst)：又称为瑞草、神芝、仙草、瑶草、还阳草、林中灵、菌灵芝、万年蕈、灵草、赤芝、丹芝、琼珍等，是一种多孔菌科真菌灵芝的子实体；其外形呈伞状，菌盖肾形、半圆形或近圆形；在明代大医学家李时珍编著的《本草纲目》中有灵芝的记载；灵芝孢子是灵芝在生长成熟期，从灵芝菌褶中弹射出来的极其微小的卵形生殖细胞即灵芝的种子；每个灵芝孢子只有4～6个微米，是活体生物体；灵芝孢子粉具有灵芝的全部遗传物质和保健作用；其药用价值日益受到重视，研究发现灵芝孢子具有增强机体免疫力，抑制肿瘤，保护肝损伤，辐射防护等作用。
5.灵芝孢子粉多糖是灵芝中的主要活性成分，现已证实其具有多种生物活性，在医药领域中有广阔的应用前景；目前，灵芝孢子多糖提取多数采用的都是超声波提取和水提取，再浓缩干燥的方法，多糖含量为4
‑
8％，无法对灵芝孢子中的多糖进行富集；本技术进一步改进了灵芝孢子粉多糖肽提取的工艺，并研究发现灵芝孢子粉多糖肽在制备治疗癌因性疲乏方面也有显著效果。


技术实现要素：

6.发明目的：针对上述现有技术，本发明提供了灵芝孢子粉多糖肽在制备治疗癌因性疲乏的药物中的应用。
7.技术方案：本发明公开了灵芝孢子粉多糖肽在制备治疗癌因性疲乏的药物中的应用。
8.其中，所述灵芝孢子粉多糖肽中多糖含量为40％以上，多肽含量为20％以上。
9.进一步的，所述灵芝孢子粉多糖肽的制备方法，包括以下步骤：
10.(1)筛选饱满的灵芝孢子进行破壁处理；
11.(2)取破壁灵芝孢子粉加水制成条状颗粒，低温干燥至水分在6％以内，co2超临界萃取脂溶性成分；
12.(3)脱脂后的破壁灵芝孢子颗粒再加水，90
‑
100℃保温1～3小时，过滤，滤渣重复处理1
‑
3次，合并滤液，浓缩，加95％食用乙醇，搅拌后静置过夜，取沉淀物，加无水乙醇清洗后，低温烘干，即得。
13.步骤(1)中，优选灵芝孢子粉原料，使得所述破壁灵芝孢子粉多糖不低于1.0％，蛋白质不低于1.0％。
14.步骤(2)中，所述的水量为破壁灵芝孢子粉重量的1/5
‑
1/4。
15.优选的，上述步骤(2)中，co2超临界萃取条件为萃取压力25～28mpa，萃取温度25～30℃，萃取时间1～2小时；最优选条件为：萃取压力25mpa，萃取温度30℃，萃取时间2小时。
16.步骤(3)中，脱脂后的破壁灵芝孢子颗粒再加入8～10倍重量的水，90
‑
100℃加热，保温1～3小时后，过滤，滤渣再加入6～8倍重量水，90
‑
100℃加热，保温1～3小时，过滤，合并滤液。
17.步骤(3)中，合并滤液，浓缩至比重1.15～1.23之间，加入2～3倍体积量95％食用乙醇，搅拌后静置过夜，取沉淀物。
18.步骤(3)中，所述的烘干温度为30～40℃。
19.有益效果：本发明所述灵芝孢子粉多糖肽为灵芝孢子提取富集的有效部位群，为一混合物，其中含量最高的有效成分为多糖和多肽；本发明通过试验验证，所述灵芝孢子粉多糖肽对癌因性疲乏有明显的缓解作用，具有药物开发前景。
具体实施方式
20.以下通过具体实施例对本发明进行进一步的解释说明。
21.实施例1
22.取灵芝孢子100kg经筛选，进行物理破壁处理，加入重1/5的水，少量多次加入，通过螺旋造粒机制成条状颗粒，常温自然干燥，放入co2超临界萃取设备，通过co2超临界工艺，萃取压力25mpa，萃取温度30℃，萃取时间2小时，萃取其中的脂溶性成分。
23.脱脂后的破壁灵芝孢子颗粒再加入10倍重量的水，100℃加热，保温2小时后，过滤，滤渣再加入8倍重量水，100℃加热，保温2小时，过滤，合并滤液，浓缩至比重1.15～1.23之间，加入3倍体积量95％食用乙醇，搅拌后静置过夜，取沉淀物，加少量水清洗后，低温烘干，即得提取物5kg；该沉淀物多糖含量为44.5％，多肽含量为25.4％，远高于普通灵芝孢子提取物。
24.实施例2
25.取灵芝孢子100kg经筛选，进行物理破壁处理，加入重1/5的水，少量多次加入，通过螺旋造粒机制成条状颗粒，常温自然干燥，放入co2超临界萃取设备，通过co2超临界工艺，萃取压力25mpa，萃取温度30℃，萃取时间2小时，萃取其中的脂溶性成分。
26.脱脂后的破壁灵芝孢子颗粒再加入8倍重量的水，100℃加热，保温2小时后，过滤，
滤渣再加入6倍重量水，100℃加热，保温2小时，过滤，合并滤液，浓缩至比重1.15～1.23之间，加入2倍体积量95％食用乙醇，搅拌后静置过夜，取沉淀物，加少量水清洗后，低温烘干，即得提取物5kg；该沉淀物多糖含量为40.5％，多肽含量为21.2％，高于普通灵芝孢子提取物。
27.试验例
28.以下实验例所采用的灵芝孢子粉多糖肽按实施例1方法制备得到。
29.1、受试药物：实施例1制备所得灵芝孢子粉多糖肽
30.配制方法：灵芝孢子粉多糖肽剂量为0.85g/kg
*
日，精密称取442mg实施例1制备多的灵芝孢子粉多糖肽，并加入5.2ml cmc
‑
na，充分涡旋溶解，每日灌胃给药，给药体积0.2ml。
31.2、实验细胞
32.小鼠lewis肺癌细胞来源于atcc；细胞培养于含10％胎牛血清的dmem培养基；培养于37℃含5％co2的恒温培养箱。
33.3、实验动物
34.品系及级别：spf级c57bl/6小鼠生产厂家：常州卡文斯实；周龄：5
‑
6周性别：雌。
35.4、实验分组
[0036][0037][0038]
5、实验方法
[0039]
收集小鼠lewis肺癌细胞，并调整密度为4
×
106/ml，按0.2ml/只将细胞悬液注射于小鼠腋窝皮下进行接种，接种后第5天，将小鼠随机分为12组并开始。
[0040]
按上述组别进行给药，连续干预15天。实验周期共20天；在实验期间对小鼠进行观测，在出现活动减少，皮色变暗，体重减轻时开始旷场实验、悬尾实验及强迫游泳实验等行为学实验，并记录相关指标；实验结束日处死动物，取瘤，称重并拍照；取肝，液氮瞬冻并于
‑
80℃保存，此后运用试剂盒测量肝糖原含量。
[0041]
6、实验结果
[0042]
6.1瘤重和抑瘤率
[0043]
实验结束时，动物称重，剥除肿瘤，称取瘤重，计算抑瘤率；如表1所示，各给药组与lewis肺癌组相比瘤重均出现了极显著下降(
***
p<0.001)；抑瘤率结果显示各药物均能在体内有效抑制lewis肺癌细胞增殖。
[0044]
表1、各给药组抑瘤率(n＝10，data＝mean
±
sd)
[0045][0046]
注：与lewis肺癌组相比，
***
p<0.001。
[0047]
6.2脑力疲乏实验结果
[0048]
小鼠旷场实验可作为脑力疲乏的评定标准之一；观察小鼠在开阔箱正中格内的活动情况，包括在正中格停留次数、方格间穿行次数即三爪以上跨入临格的次数、竖起时间即两前肢离地1cm以上的时间；中心停留次数越多，脑力越疲乏；表3结果显示，lewis肺癌组小鼠旷场中心停留次数显著高于空白对照组(
*
p<0.05)；给予药物干预后，各组小鼠旷场中心停留次数均显著低于lewis肺癌组(
###
p<0.001)，脑力疲乏得到显著缓解。
[0049]
表2、各组小鼠旷场中心停留次数(n＝10，data＝mean
±
sd)
[0050]
组别旷场中心停留次数空白对照组30.20
±
4.96lewis肺癌组45.50
±
21.96
*
灵芝孢子粉多糖肽组+lewis肺癌22.50
±
8.86
###
灵芝孢子粉多糖肽+环磷酰胺组+lewis肺癌18.63
±
9.61
###
环磷酰胺组+lewis肺癌19.50
±
11.23
###
[0051]
注：与空白对照组相比，
*
p<0.05；与lewis肺癌组相比，
###
p<0.001。
[0052]
6.3体力疲乏实验结果
[0053]
小鼠尾悬挂实验可作为其体力疲乏的评定标准之一；将小鼠尾端2cm的部位固定，使其呈倒挂状态，其头部离地面5～6cm，用木板隔开相邻动物的视线，适应1min后，记录每只小鼠5min内的累计不动时间；小鼠挣扎时间占比越短，小鼠体力越疲乏；表3结果显示，lewis肺癌小鼠挣扎时间占比显著低于空白对照组(
**
p<0.01)；给予药物干预后，各组小鼠挣扎时间占比均显著高于lewis肺癌组(
#
p<0.05)，体力疲乏得到一定程度缓解。
[0054]
此外，力竭游泳实验也可作为体力疲乏的另一评定标准；准备重量相当于7％小鼠体重的配重物，用医用胶布粘于小鼠尾部，将小鼠放入水温25℃
±
1℃的游泳箱中进行游泳测试直至其力量耗竭，下沉不起，记录所经历的时间；小鼠在水中活动越短，小鼠体力越疲
乏；结果如表4所示，lewis肺癌小鼠挣扎时间占比显著低于空白对照组(
***
p<0.001)；给予药物干预后，除环磷酰胺组外(
*
p>0.05)，各组小鼠挣扎时间占比均显著高于lewis肺癌组(
#
p<0.05)，体力疲乏得到显著缓解；由于环磷酰胺具有多系统毒性，推测环磷酰胺组实验小鼠体力疲乏是由于环磷酰胺累积毒性引起的；而其他联用组均能够有效改善小鼠体力疲乏。
[0055]
表3、各组小鼠悬尾挣扎时间占比(n＝10，data＝mean
±
sd)
[0056]
组别悬尾挣扎时间占比(％)空白对照组91.44
±
8.01lewis肺癌组75.72
±
12.14
**
灵芝孢子粉多糖肽组+lewis肺癌91.85
±
8.16
#
灵芝孢子粉多糖肽(高)+环磷酰胺组+lewis肺癌95.41
±
4.14
#
环磷酰胺组+lewis肺癌89.68
±
7.74
#
[0057]
注：与空白对照组相比，
**
p<0.01；与lewis肺癌组相比，
#
p<0.05。
[0058]
表4、各组小鼠力竭游泳停止挣扎时间(n＝10，data＝mean
±
sd)
[0059]
组别小鼠力竭游泳停止挣扎时间(s)空白对照组238.00
±
45.12lewis肺癌组113.30
±
16.40
***
灵芝孢子粉多糖肽组+lewis肺癌211.50
±
43.33
#
灵芝孢子粉多糖肽(高)+环磷酰胺组+lewis肺癌188.30
±
70.22
#
环磷酰胺组+lewis肺癌99.30
±
17.52
[0060]
注：与空白组相比，
***
p<0.001；与lewis肺癌组相比，
#
p<0.05。
[0061]
6.4肝糖原含量
[0062]
疲乏和困倦是胰岛素抵抗的重要表现；肝胰岛素抵抗的本质是胰岛素抑制内源性葡萄糖生成的能力减弱和肝糖原合成减少；因此通过测定肝糖原含量能有效反映药物对疲乏和困倦的缓解程度；肝糖原含量测定实验结果表5显示，lewis肺癌组小鼠肝糖原含量极显著低于空白对照组(
***
p<0.001)；给予药物干预后，多组小鼠肝糖原含量得到显著回升(
##
p<0.01)，环磷酰胺组单用也有一定回升作用。
[0063]
表5、各组小鼠肝糖原含量(n＝10，data＝mean
±
sd)
[0064][0065]
[0066]
注：与空白组相比，
***
p<0.001；与lewis肺癌组相比，
##
p<0.01，
###
p<0.001。
[0067]
各给药组均能显著抑制lewis肺癌皮下移植瘤增殖；各给药组合均能显著缓解癌因性疲乏小鼠脑力疲乏，对癌因性疲乏小鼠体力疲乏也有一定缓解作用；灵芝孢子糖肽对癌因性疲乏荷瘤小鼠均有改善作用。
[0068]
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。