一种治疗脱发的产品及银杏内酯A在治疗应激诱发脱发的新用途的制作方法

一种治疗脱发的产品及银杏内酯a在治疗应激诱发脱发的新用途
技术领域
1.本发明涉及医药领域，特别是一种治疗脱发的产品及银杏内酯a在治疗应激诱发脱发的新用途。


背景技术：

2.中国有超过2.5亿人受到脱发的困扰，脱发严重影响患者的心理健康和生活质量。心理应激是诱发和加重脱发的重要因素之一，斑秃、休止期脱发、毛发扁平苔藓等均与应激事件有关。既往研究表明，神经-免疫-内分泌途径在心理应激影响毛发生长中起到重要作用，但其具体机制尚待进一步探究，其治疗也缺乏安全有效的手段。
3.γ-氨基丁酸(gaba)是一种非蛋白质型氨基酸，广泛存在于微生物，植物和脊椎动物中，也是中枢神经系统的主要抑制性神经递质。gaba相关信号失调与某些神经和精神疾病有关。gaba受体分为3个亚型，gaba(a)受体，gaba(b)受体，gaba(c)受体。其中 gaba(a)受体是配体门控的氯离子通道，在极化细胞膜和降低神经元的兴奋性中起重要作用。gaba(a)受体由5个不同的亚基组合而成，其中包括α(1-6)，β(1-3)，γ(1-3)，δ，ε，θ，π,ρ。gaba通过a受体影响细胞发育的每个阶段，例如增殖，迁移和分化，还可以调控干细胞的增殖(15)。国外研究表明，使用加巴喷丁(促进gaba合成)、抗癫痫药物(gaba再摄取抑制剂)等的副作用之一是脱发。另外，调查显示口服gaba患者有1％可引起脱发。因此，我们通过进一步探究发现，gaba水平在心理应激抑制小鼠毛发生长模型中发生显著变化。但目前对于gaba是如何在应激影响毛发生长的机制中发挥作用尚不明确，需要开展更深入的研究来阐明其与应激影响毛发生长的关系，为临床治疗提供潜在的靶点。
4.银杏内酯是从银杏叶中分离出的一类萜内酯类化合物，分为银杏内酯a、银杏内酯b、银杏内酯c、银杏内酯m、银杏内酯j等。银杏内酯a、b、c、j均有拮抗血小板活化因子受体的作用，同时参与抗炎、神经保护等。已有研究发现，银杏内酯是gaba的选择性受体拮抗剂,其对应激性溃疡有显著的预防作用,对胆碱能损伤记忆功能具有恢复作用，能防止 chat活力降低,缓解和改善心肌缺血，有抗焦虑作用。但是关于将其应用于缓解心理应激诱发脱发的治疗药物或食品中尚未有文献报道，本发明发现了银杏内酯的新用途。


技术实现要素：

5.为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种治疗脱发的产品及银杏内酯a在治疗应激诱发脱发的新用途，本发明发现银杏内酯a抑制gaba(a)的受体，调控毛乳头细胞细胞周期，起到缓解应激引起的毛发生长抑制的作用。
6.为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
7.一种治疗脱发的产品，包括：银杏内酯a。
8.前述的一种治疗脱发的产品，包括：浓度为25-100mmol/l的银杏内酯a。
9.前述的一种治疗脱发的产品，包括：25mmmol/l银杏内酯a，10％dmso，5％吐温，生
富集分析gaba处理24小时与0小时相比差异基因的表达；b.kegg通路富集分析gaba 处理24小时与0小时相比差异基因的表达；c.go富集分析gaba处理48小时与0小时相比差异基因的表达；d.kegg通路富集分析gaba处理48小时与0小时相比差异基因的表达)；
24.图6为gaba显著下调hdpc细胞周期的表达实验结果图(a.火山图显示gaba处理 24小时和0小时相比细胞周期相关基因的表达；b.火山图显示gaba处理48小时和0小时相比细胞周期相关基因的表达；c.fpkm值显示gaba处理0小时，24小时，48小时基因表达量差异；d.venn图显示gaba处理24小时与0小时和48小时与0小时基因表达数目差异)；
25.图7为gaba显著抑制hdpc细胞的细胞周期实验结果图(a.流式细胞分析显示不同浓度梯度gaba处理hdpc细胞周期表达变化。b.柱状图分析显示不同浓度梯度gaba处理hdpc细胞周期表达变化。c.流式细胞分析显示溶剂对照组，银杏内酯a，gaba，gaba+ 银杏内酯a处理hdpc细胞周期表达变化)；
26.图8为gaba显著下调hdpc细胞dna复制表达(a.火山图显示gaba处理24小时和0小时相比dna复制相关基因的表达；b.火山图显示gaba处理48小时和0小时相比 dna复制相关基因的表达；c.venn图显示gaba处理24小时与0小时和48小时与0小时基因表达数目差异；d.fpkm值显示gaba处理0小时，24小时，48小时基因表达量差异)；
27.图9为gaba显著下调hdpc细胞嘧啶代谢相关基因表达(a.火山图显示gaba处理24小时和0小时相比dna复制相关基因的表达；b.火山图显示gaba处理48小时和0小时相比嘧啶代谢相关基因的表达；c.venn图显示gaba处理24小时与0小时和48小时与0 小时基因表达数目差异；d.fpkm值显示gaba处理0小时，24小时，48小时基因表达量差异)；
28.图10为gaba显著下调hdpc细胞嘌呤代谢相关基因表达(a.火山图显示gaba处理24小时和0小时相比嘌呤代谢相关基因的表达；b.火山图显示gaba处理48小时和0小时相比嘌呤代谢相关基因的表达；c.venn图显示gaba处理24小时与0小时和48小时与 0小时基因表达数目差异；d.fpkm值显示gaba处理0小时，24小时，48小时基因表达量差异)。
具体实施方式
29.以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
30.一种治疗脱发的产品，包括：银杏内酯a；银杏内酯a的浓度在10-100mmol/l，作为一种优选，一种治疗脱发的产品，包括：25mmmol/l银杏内酯a，10％dmso，5％吐温，生理盐水。需要说明的是：产品可以是药品，药物包括：微乳剂、乳剂、乳膏剂、喷雾剂、凝胶、酊剂、搽剂中外用剂型中的任一种。也可以是食品保健品，或是洗化用品，或是用于制造治疗心理应激诱发脱发的医疗器械，品类不受限制。
31.本发明发现了银杏内酯a在治疗应激诱发脱发的新用途，银杏内酯a能够缓解心理应激诱发脱发的作用，银杏内酯a抑制gaba(a)的受体，调控毛乳头细胞细胞周期，缓解应激引起的毛发生长抑制的作用，银杏内酯a为gaba的拮抗剂。
32.以下通过实验验证技术效果：
33.实验一：
34.本发明的研究，关于gaba在心理应激诱导毛发生长抑制中作用的实验，其具体的步骤如下：
35.s1:构建慢性束缚应激小鼠模型：使用spf级6-8周大的健康雄性c57bl/6小鼠(购
自上海斯莱克实验动物有限公司)，所有小鼠在以下条件适应环境一周：室温22
±
1℃，湿度 50
±
5％，12小时的光照-黑暗周期(上午6:00点亮，下午18:00熄灭)。在此期间，随意提供食物和水。
36.适应一周后，将小鼠随机分为非应激组(ctrl)和应激组(crs组)，每组5只，每天将小鼠置于50ml锥形管中6h(上午10:00至下午16:00)在施加应激的过程中，非应激组小鼠保持在笼中不受干扰，并且未向所有小鼠提供食物和水。在实验期间，第8天将脱毛膏施用于小鼠的背部皮肤(从脖子到尾巴)以诱导生长期(脱毛可以引发高度同步的毛发生长，背部呈均匀红色即证明所有的小鼠毛囊都处于休止期)。在实验第21天(day21)收集皮肤组织和血标本。进行3次独立重复实验。如图1，总共建模时间21天(如图1a)。图1b显示，实验第21天观察到crs显著抑制了小鼠背部的毛发生长。
37.s2:小鼠毛发周期的评估：c57bl/6小鼠的黑色素细胞仅位于毛球部，其背部皮肤在休止期呈粉色，而到生长期逐渐变为黑色；因此，从第8天开始，每3天拍照一次，根据小鼠皮肤颜色的变化来判断毛发周期的变化，从而对毛发的生长进行评估.根据色素沉着水平和毛干密度，评估小鼠皮肤黑色素水平，分值从0到100,0表示没有毛发生长(没有黑色素)，较高的数字对应较多的黑色素和更大的毛发生长区域。图1c表明，应激组小鼠皮肤黑色素水平明显低于非应激组，同样证实了crs对小鼠毛发生长的抑制作用。
38.s3:应激组和非应激组小鼠分别选取3只，取皮肤组织进行rna-seq分析，在杭州联生物技术股份有限公司完成。每个样品取1μg总rna用来构建rna文库。去除核糖体rna (rrna)，纯化了的信使rna经过逆转录、末端修复、配体连接以及pcr扩增等步骤，所得的cdna使用illumina hiseq 2500测序平台进行测序。测序结果通过kegg信号通路富集分析发现，活化型神经配体受体结合(neuroactive ligand-receptor interaction)信号通路相关基因发生显著变化(图2a)。而在neuroactive ligand-receptor interaction信号通路中，有15个表达显著下调的基因以及23个表达显著上调的基因，其中gaba受体相关基因最为明显(图2b)。因此，我们推测gaba及其受体可能在心理应激抑制毛发生长的过程中具有重要的作用。
39.s4:he染色：取小鼠背部皮肤标本，大小约2
×
4cm，全层皮肤组织在10％福尔马林溶液 (sigma)中固定过夜，脱水后放入石蜡包埋。5mm石蜡切片进行苏木精伊红染色。图1d显示在he染色下非应激组小鼠新生毛囊数量多于应激组，毛球部较大，发干较长，且真皮厚度大于应激组小鼠。
40.s5:免疫组化实验(免疫组化所用的抗体购自abcam公司)：石蜡切片置于37℃烘箱内烘烤12h。二甲苯脱蜡，梯度酒精水化。3％过氧化氢封闭内源性过氧化物酶10min。0.01m (ph＝7.4)的pbs漂洗3次，每次3min。0.1％胰酶/0.1％cacl2溶液(ph＝7.8)37℃水浴 30min。0.01m(ph＝7.4)的pbs漂洗3次，每次3min。10％bsa室温封闭10min。滴加相应的抗体，25℃2小时。0.01m(ph＝7.4)的pbs漂洗3次，每次5min。滴加hrp二抗，室温孵育30min。0.01m(ph＝7.4)的pbs漂洗3次，每次5min。dab显微镜下显色。苏木素复染，脱水、透明，中性树胶封片。显微镜观察，摄片。图1e显示非应激组小鼠毛囊隆突部位和毛球部ki67表达显著高于应激组。
41.s6：elisa测定小鼠血清中gaba含量(试剂盒购自武汉云克隆科技股份有限公司)：应激组和非应激组小鼠分别5只，收集外周血，将收集于血清分离管中的全血标本在室温放
置2 小时，然后1,000
×
g离心20分钟，取上清。加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔5孔，依次加入50μl不同浓度的标准品。空白孔加50μl标准品稀释液，余孔加待测样品50μl，然后立即每孔加检测溶液a工作液50μl，轻轻振动，混匀，注意不要有气泡，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。弃去孔内液体，每孔用350μl的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，在吸水纸上轻拍酶标板来移除孔内所有液体。重复洗板3次。最后一次洗涤后，吸取或倒出剩余的洗涤缓冲液，将酶标板倒扣在吸水纸上，将残留在孔内的液体全部吸干。此过程也可采用喷射瓶，多道移液器或自动洗板机来完成。每孔加检测溶液b工作液(临用前配制)100μl，加上覆膜，37℃温育30分钟。弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜，37℃避光显色(反应时间控制在10-20分钟，不要超过30分钟)。当标准孔的后面3孔有明显的梯度蓝色，前3孔梯度不明显时，即可终止)。每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(od值)。本试剂盒应用竞争抑制酶联免疫分析法，所以样本中γaba的含量与其显色呈负相关，gaba的含量越高，显色越浅，含量越低，显色越深。绘制标准曲线，根据样品o.d.值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数。图2c显示，应激组小鼠中gaba在血清中的含量明显高于非应激组。
42.实验二：
43.本发明的研究，关于银杏内酯a在缓解心理应激诱导毛发生长抑制作用中的实验，其具体的步骤如下：
44.s1:将小鼠分为6组：如上文所述构建慢性束缚应激抑制小鼠毛发生长模型，从脱毛后第一天(day9)开始对小鼠背部皮肤局部涂抹药物处理，每日涂抹2次，每次每只小鼠涂药 100ul,持续12天.
45.溶剂对照组的成分包括:10％dmso,5％吐温，生理盐水
46.银杏内酯a 25mmol/l组的成分包括：25mmmol/l银杏内酯a，10％dmso，5％吐温，生理盐水
47.银杏内酯a 100mmol/l组的成分包括：100mmmol/l银杏内酯a，10％dmso，5％吐温，生理盐水
48.gaba组的成分包括：100mmol/l gaba，生理盐水
49.picrotoxin组的成分包括：10mmol/l picrotoxin,10％dmso，5％吐温，生理盐水
50.(银杏内酯a，gaba,picrotoxin购自mce公司，5％米诺地尔购自浙江万晟药业有限公司)，持续12天。在实验第21天(day21)收集样品。进行3次独立重复实验。如上文所述进行小鼠毛发周期的评估以及免疫组化实验。
51.实验结果如图2、3所示，图2d显示，在慢性束缚应激小鼠模型中，外用gaba组小鼠的背部黑色素水平明显低于溶剂对照组，提示gaba可以显著抑制小鼠背部皮肤毛发生长。图3 显示银杏内酯a及其他gaba拮抗剂(picrotoxin)对慢性束缚应激抑制小鼠毛发生长具有显著的缓解作用。图3a显示，小鼠背部皮肤外用25mmol/l银杏内酯a或picrotoxin后皮肤黑色素水平明显高于溶剂对照组，也明显高于米诺地尔组，表明gaba拮抗剂银杏内酯a、 picrotoxin对小鼠毛发生长的促进作用，且效果强于米诺地尔。he染色表明，在慢性束缚应激模型中，外用25mmol/l银杏内酯a，picrotoxin和米诺地尔组小鼠新生毛囊数量显著多于溶剂对照组，毛球部较大，发干较长，且真皮厚度大于溶剂对照组小鼠(图3b)。如图3c,d 显
示外用银杏内酯a、picrotoxin小鼠毛囊隆突部位和毛球部ki67表达显著高于溶剂对照组。图4a显示，小鼠背部皮肤外用100mmol/l银杏内酯a皮肤黑色素水平明显高于crs+h2o组，表明100mmol/l银杏内酯a对小鼠毛发生长的促进作用。he染色表明，在慢性束缚应激模型中，外用100mmol/l银杏内酯a和米诺地尔组小鼠新生毛囊数量显著多于crs+h20组，毛球部较大，发干较长，且真皮厚度大于crs+h20组小鼠(图4b)。
52.实验三：
53.本发明的研究，关于gaba在心理应激诱导毛发生长抑制的作用机制研究的实验，其具体的步骤如下：
54.s1:培养人毛乳头细胞(购自promocell公司)gaba(100umol/l)处理0h、24、48h后，收集细胞，加1ml trizol裂解，贮存在-80℃。进行rna-seq分析，如上所述在杭州联生物技术股份有限公司完成。
55.如图5为rna-seq分析显示gaba显著改变hdpc(人毛乳头细胞)的基因表达谱，a.go 富集分析gaba处理24小时与0小时相比差异基因的表达显示,gaba处理24h显著影响细胞分裂，dna复制，细胞周期，染色体等相关通路的基因的表达b.kegg通路富集分析gaba处理24小时与0小时相比差异基因的表达显示，gaba处理24h显著影响细胞周期，嘌呤代谢，嘧啶代谢，细胞衰老等相关通路的基因的表达c.go富集分析gaba处理48小时与0小时相比差异基因的表达显示，gaba处理48h显著影响细胞分裂，dna复制，细胞周期相关通路基因的表达d.kegg通路富集分析gaba处理48小时与0小时相比差异基因的表达显示,gaba处理 48h显著影响细胞周期，嘌呤代谢，嘧啶代谢，细胞衰老等相关通路的基因的表达。
56.如图6显示，gaba显著抑制细胞周期相关基因的表达。如图6a,在细胞周期(cell cycle) 信号通路中，gaba处理24小时后，有40个表达显著下调的基因以及3个表达显著上调的基因.如图6b,gaba处理48小时后，有42个表达显著下调的基因以及2个表达显著上调的基因。如图6c所示为具有显著性差异的表达量最多的基因，其均在gaba处理后下调。如图6d所示为gaba处理24小时和48小时后，有共同的差异表达基因41个，提示gaba处理 24小时和48小时毛乳头细胞周期相关通路差异基因变化较为稳定。因此，我们推测gaba可以显著抑制细胞周期相关基因的表达。
57.如图8显示，gaba显著抑制dna复制相关基因的表达。如图8a,在dna复制(dnareplication)信号通路中，gaba处理24小时后，有27个显著表达差异的基因且均为下调。如图8b,gaba处理48小时后，有26个显著表达差异的基因且均为下调。因此，我们推测 gaba可以显著抑制dna复制相关基因的表达。如图8c所示为gaba处理24小时和48小时后，有共同的差异表达基因26个，gaba处理24小时后差异变化基因较gaba处理48小时多一个，提示gaba处理24小时和48小时毛乳头细胞dna复制相关通路差异基因变化较为稳定。如图8d所示为具有显著性差异的表达量最多的基因，其均在gaba处理后下调。因此，我们推测gaba可以显著抑制dna复制相关基因的表达。
58.如图9显示，gaba显著抑制嘧啶代谢相关基因的表达。如图9a,在嘧啶代谢(pyrimidinemetabolism)信号通路中，gaba处理24小时后，有14个表达显著下调的基因以及1个表达显著上调的基因.如图9b,gaba处理48小时后，有14个表达显著下调的基因以及1个表达显著上调的基因。如图9c所示为gaba处理24小时和48小时后，有共同的差异表达基因 13个，提示gaba处理24小时和48小时毛乳头细胞嘧啶代谢相关通路差异基因变化较为
稳定。如图9d所示为具有显著性差异的表达量最多的基因，其均在gaba处理后下调。因此，我们推测gaba可以显著抑制嘧啶代谢相关基因的表达。
59.如图10显示，gaba显著抑制嘌呤代谢相关基因的表达。如图10a,在嘌呤代谢(purinemetabolism)信号通路中，gaba处理24小时后，有17个表达显著下调的基因以及9个表达显著上调的基因.如图10b,gaba处理48小时后，有14个表达显著下调的基因以及9个表达显著上调的基因。如图10c所示为gaba处理24小时和48小时后，有共同的差异表达基因 21个，提示gaba处理24小时和48小时毛乳头细胞嘌呤代谢相关通路差异基因变化较为稳定。如图10d所示为具有显著性差异的表达量最多的基因，其均在gaba处理后下调。因此，我们推测gaba可以显著抑制嘌呤代谢相关基因的表达。
60.s2:流式细胞技术分析细胞周期。
61.毛乳头细胞处理48h，pbs洗2次，收集管底细胞沉淀。然后将细胞沉淀物加入1ml预冷的70％乙醇，转移到1.5ml eppendorf(ep)管中并在4℃下固定过夜，然后在20 ℃下以1,750
×
g离心5分钟。收集上清液。每组重复3次，细胞沉淀用500μl结合缓冲液悬浮，加入5μl碘化丙啶(pi)染料，室温避光30分钟。最后，根据程序化操作使用流式细胞仪检测细胞周期。流式细胞仪(facs calibur；bd biosciences)用于分析。使用 cellquest专业软件(3.3版；bd biosciences)获取和分析数据。
62.图7结果显示gaba处理24小时及48小时均显著抑制了hdpc细胞周期。
63.图7a显示浓度为10umol/l,100umol/l,1000umol/l gaba处理48小时后g1期细胞显著增多，s期细胞显著减少，g2期细胞显著减少，提示浓度为10umol/l,100umol/l, 1000umol/l的gaba处理可以抑制毛乳头细胞的增殖，并使细胞周期停滞在g1期。
64.图7b显示浓度为10umol/l,100umol/l,1000umol/l gaba处理48小时后g1期细胞显著增多，s期细胞显著减少，g2期细胞显著减少(***表示p＜0.001)
65.图7c显示，10umol/l银杏内酯a处理毛乳头细胞后，g1期，s期，g2期比例无明显变化。10umol/l gaba处理毛乳头细胞，g1期细胞显著增多，s期细胞显著减少，g2期细胞显著减少。与但用gaba处理毛乳头细胞相比，使用10umol/l银杏内酯a和10umol/l gaba同时处理毛乳头细胞，g1期细胞数目减少，s期细胞数目增多，g2期细胞增多，提示银杏内酯 a能够阻断gaba对hdpc细胞周期的抑制作用。
66.综上所述：本发明发现银杏内酯a能够通过抑制gaba(a)受体，显著促进毛囊生长，增加毛囊隆突部位ki67的表达，调控毛乳头细胞细胞周期相关通路及代谢通路，缓解应激引起毛发生长抑制的作用。
67.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。