一种具有核壳结构的双水相多孔胰岛微胶囊的制备及应用

1.本发明属于生物材料领域，具体涉及一种基于微流控电喷的核壳结构的多孔胰岛微胶囊及其制备方法，该多孔胰岛微胶囊可应用于细胞移植保证细胞的活性以及隔离免疫排斥等技术领域中。


背景技术：

2.常用的细胞移植方式有肝门静脉，肾包膜，腹腔等，微胶囊是可移植到腹腔的细胞移植方法之一。该微胶囊为双水相核壳结构，壳层为多孔的水凝胶，可以允许小分子物质通过而阻止大分子物质如免疫细胞和免疫球蛋白等物质，有一定的免疫隔离作用；内相为液态的纤维素溶液提供一个3d液态环境提高细胞的存活率。此法可提高封装细胞的存活率、提高移植细胞的活性和移植效果。与其他封装细胞的技术相比具有独特的优点，是一种更好的细胞封装技术，改善细胞移植的效果。
3.传统的水凝胶封装技术，包括机械搅拌法，乳化溶剂挥发法或通过微流控系统有机油相切割形成水凝胶微球或微胶囊，多为水凝胶实心微球，其主结构的制备方法有的较为复杂，技术要求高，有的尺寸分布大，粒径不均一，单分散性差。另外，传统制备的微球及微胶囊由于实心的结构不利于细胞的物质交换，影响细胞生长，限制了它的应用。
4.peo作为一种制孔剂，和外相的海藻酸盐混合后，当海藻酸盐与收集液里的钙离子发生交联，形成水凝胶，而peo不成胶，分散在水凝胶里溶于水，形成水凝胶里的多孔结构，多孔结构在纳米数量级均匀地分散在水凝胶中。通过改变peo的浓度和比例可以调节水凝胶多孔的尺寸，灵活、方便。


技术实现要素：

5.为了解决传统水凝胶包裹细胞存在的细胞活性下降、移植存活率低、水凝胶微球制备较复杂的缺点，本发明提供了一种具有核壳结构的双水相的多孔胰岛微胶囊及其制备方法。在本发明中，我们以alg和peo混合液为外相，cmc为内相，设计发明了一种具有核壳结构的多孔胰岛微胶囊可包裹细胞，实现3d培养，并可移植治疗免疫相关疾病。
6.为解决上述的技术问题，本发明采用的技术方案是：
7.一种具有核壳结构的双水相多孔胰岛微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
8.(1)设计微流控电喷双乳液装置：
9.通过调整管径大小和对齐方式，制得微流控电喷芯片，以保证双相溶液能够顺利通过管道且具备合适的比例；
10.(2)配制内、外相溶液，制备微胶囊：
11.内、外相溶液需具备不同的粘度，并在外相溶液中加入不成胶的成分；在外部高压电场作用下，内、外相溶液形成互不相溶的核壳结构，核壳结构的外层通过离子交换或光固化成胶；重复以上步骤制备微胶囊，由于不成胶的物质充当制孔剂的作用，因此得到的微胶囊的壳层为多孔结构，最终制备得到具有核壳结构的双水相多孔胰岛微胶囊。
12.步骤(1)中，所述的微流控电喷芯片为同轴装置，能够通双乳液。
13.通过在外壳的海藻酸(alg)溶液里加入制孔剂聚氧化乙烯(peo)溶液，使外壳的水凝胶成为多孔的结构，内相为羧甲基纤维素或甲基纤维素等具有生物相容性且有一定粘度的溶液。
14.微胶囊的壳层为多孔水凝胶，多孔水凝胶的浓度范围在0.5％-10％w/v。
15.微胶囊的壳层为聚氧化乙烯(peo)、聚乙二醇(peg)、海藻酸盐(alg)、聚乙二醇双丙烯酸酯(pegda)、甲基丙烯酸酯明胶(gelma)、丝素蛋白、透明质酸、聚二甲基硅氧烷(pdms)、壳聚糖、明胶、乳糖、半乳糖、糊精、麦芽糖、聚乳酸(pla)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、聚乙烯醇(pva)中的一种材料或两种以上材料的复合。
16.通过调节电压电场、流速、收集距离，以及内外相溶液浓度获得不同大小、核壳比例的微胶囊；其中，电压增大会使微胶囊的直径相应减小，电压减小会使微胶囊直径相应增大。
17.本发明还保护上述方法制备获得的具有核壳结构的双水相多孔胰岛微胶囊，该微胶囊具有明显的核壳两部分，外相的壳层为多孔结构，内相的核心为液态。
18.进一步的，其含有液态的高分子溶液，其粘度不同于壳层，形成液态的核心，能够将目的细胞分散于内相。
19.进一步的，该具有核壳结构的双水相多孔胰岛微胶囊的直径为100-1200μm。
20.作为优选的方案，peo浓度范围0.5％-2％(w/v)。
21.作为优选的方案，壳层海藻酸钠的浓度为0.5％-4％(w/v)，内部为羧甲基纤维素钠，内部或载有细胞。
22.作为优选的方案，该具有核壳结构的双水相多孔胰岛微胶囊的直径在200-950μm。
23.本发明还保护所述的具有核壳结构的双水相多孔胰岛微胶囊在制备实现细胞治疗作用的可移植载细胞微胶囊的制备中的应用。
24.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
25.(1)本发明以微流控电喷技术，制备具有核壳结构的微胶囊，壳层为水凝胶，核层为液态，方法简单，操作方便，价格低廉，可重复性高，不需要很高的技术要求，且易对微胶囊的大小进行控制。
26.(2)本发明设计了一种具有核壳结构的多孔胰岛微胶囊，壳层加入了不成胶的成分，得到具有多孔结构的微胶囊外壳，允许小分子物质交换的同时隔离大分子物质如免疫细胞和免疫球蛋白等。
27.(3)本发明制备的具有核壳结构的双水相多孔胰岛微胶囊可用于细胞3d培养、细胞包裹移植和组织工程等。
附图说明
28.图1核壳结构的多孔胰岛微胶囊制备过程示意图；外相为海藻酸盐和peo的混合液，内相为羧甲基纤维素溶液，外部加高压电场，收集液为氯化钙溶液。
29.图2核壳结构的多孔胰岛微胶囊形成过程，可以清晰的看到两相溶液形成内外相，得到核壳结构的微胶囊。
30.图3一个实例中得到的核壳结构的多孔胰岛微胶囊光镜图和电镜图；其中，图a为
形成过程图，图b为光镜图，图c-d为电镜图。
31.图4几个关键因素对微胶囊直径的影响。
具体实施方式
32.以下通过实施例的形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
33.下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
34.实施例1
35.具有核壳结构的多孔胰岛微胶囊的制备
36.(1)微流控芯片的设计：
37.首先设计微流控电喷芯片，选择直径为800微米、300微米的毛细玻璃管，通过拉管调整外相毛细管出口处为500微米，采用同轴的方法使两种直径的毛细管嵌套成出口为同轴的毛细管道，在相应的地方用针头粘贴固定，留出两相溶液的入口。如图1所示。用超纯水反复洗涤，得到微流控芯片。
38.(2)核壳结构多孔胰岛微胶囊的制备：
39.为了使壳层水凝胶具有多孔结构，配制1％(w/v)海藻酸钠溶液里加入少量1％(w/v)peo溶液，搅拌过夜，使两种溶液充分混合均匀；配制1％(w/v)羧甲基纤维素钠溶液，搭建微流控电喷平台，包括高压直流电源，两个流量泵，最后设置调节流量和电压即可得到具有核壳结构的多孔胰岛微胶囊，如图2所示。
40.实施例2
41.具有核壳结构的多孔胰岛微胶囊的制备
42.(1)微流控芯片的设计：
43.首先设计微流控电喷芯片，选择直径为800微米、300微米的毛细玻璃管，通过拉管调整外相毛细管出口处为500微米，采用同轴的方法使两种直径的毛细管嵌套成出口为同轴的毛细管道，在相应的地方用针头粘贴固定，留出两相溶液的入口。如图1所示。用超纯水反复洗涤，得到微流控芯片。
44.(2)核壳结构多孔胰岛微胶囊的制备：
45.为了使壳层水凝胶具有多孔结构，配制不同浓度范围的聚乙二醇双丙烯酸酯(pegda)溶液加入少量1％(w/v)peo溶液，搅拌过夜，使两种溶液充分混合均匀；配制1％(w/v)羧甲基纤维素钠溶液，搭建微流控电喷平台，包括高压直流电源，两个流量泵，最后设置调节流量和电压即可得到具有核壳结构的多孔胰岛微胶囊，如图2所示。
46.实施例3
47.具有核壳结构的多孔胰岛微胶囊的制备
48.(1)微流控芯片的设计：
49.首先设计微流控电喷芯片，选择直径为800微米、300微米的毛细玻璃管，通过拉管调整外相毛细管出口处为500微米，采用同轴的方法使两种直径的毛细管嵌套成出口为同轴的毛细管道，在相应的地方用针头粘贴固定，留出两相溶液的入口。如图1所示。用超纯水
反复洗涤，得到微流控芯片。
50.(2)核壳结构多孔胰岛微胶囊的制备
51.为了使壳层水凝胶具有多孔结构，配制不同浓度的甲基丙烯酸酯明胶(gelma)溶液加入少量1％(w/v)peo溶液，搅拌过夜，使两种溶液充分混合均匀；配制1％(w/v)羧甲基纤维素钠溶液，搭建微流控电喷平台，包括高压直流电源，两个流量泵，最后设置调节流量和电压即可得到具有核壳结构的多孔胰岛微胶囊，如图2所示。
52.通过1％(w/v)海藻酸钠溶液加入少量1％(w/v)peo溶液，作为外相；1％(w/v)羧甲基纤维素钠溶液和胰岛细胞作为內相，搭建微流控电喷平台制备出了单分散性良好、具有核壳结构的多孔胰岛微胶囊，且我们的实验结果显示胰岛细胞在微胶囊中能够良好生长，存活率＞90％，移植到糖尿病小鼠体内有降低小鼠血糖的效果。
53.以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。