一种单核细胞负载LMP1蛋白的疫苗组合物及其制备方法与应用与流程

一种单核细胞负载lmp1蛋白的疫苗组合物及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明涉及免疫治疗技术领域，具体来说，涉及一种单核细胞负载lmp1蛋白的疫苗组合物及其制备方法与应用。


背景技术：

2.鼻咽癌是指鼻咽粘膜上皮发生的癌种，据统计全世界约有80％的鼻咽癌发生在我国，鼻咽癌发病隐秘，发现时大多为中晚期，预后较差5年生存率不到50％。1970年首次在鼻咽癌患者标本中发现eb病毒的dna，2005年将eb病毒(ebv)感染鉴定为鼻咽癌的主要致病因素。eb病毒进入鼻咽上皮细胞后可表达多种病毒蛋白。研究证实lmp1蛋白是eb病毒所表达的众多蛋白中唯一一个可以将正常上皮细胞转化成肿瘤细胞的蛋白。lmp1可以通过激活核因子-kb细胞炎症信号引起组织慢性炎症进而癌变，也可以上调egfr促进细胞增殖，还可以协助肿瘤细胞抵抗肿瘤的免疫监视以及促进新生血管生成等方式促进鼻咽癌的发生发展。根据研究发现鼻咽癌患者的癌细胞表面存在lmp1蛋白抗原表位。因而通过免疫手段诱导机体针对eb病毒致癌蛋白lmp1的特异性免疫反应，理论上可有效清除eb阳性的鼻咽癌细胞进而抑制肿瘤的发生发展。因此，开发一种lmp1蛋白的抗原疫苗组合物显得尤为必要，但现有技术中的抗原疫苗制备过程繁琐。


技术实现要素：

3.针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种单核细胞负载lmp1蛋白的疫苗组合物及其制备方法与应用，能够克服现有技术的上述不足。
4.近年来研究发现单核细胞可以摄取抗原并直接加工成抗原肽形式在体内激活树突状细胞诱导特异性免疫反应，因而利用单核细胞负载lmp1抗原是值得开发的肿瘤治疗性疫苗形式。
5.为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
6.一种单核细胞负载lmp1蛋白的疫苗组合物，所述疫苗组合物由一定浓度的lmp1蛋白溶液及单核细胞组成，通过下述方法制备：
7.s1制备一定浓度的lmp1蛋白溶液；
8.s2由外周血或骨髓分离获得单核细胞；
9.s3将s1获得的一定浓度的lmp1蛋白溶液与s2获得的一定数量的单核细胞混合，制成单核细胞负载lmp1蛋白的疫苗组合物。
10.优选地，所述lmp1蛋白溶液的浓度为1mg/ml。
11.优选地，所述单核细胞采用淋巴分离液ficoll密度梯度离心法制备。
12.根据本发明的另一方面，提供了一种单核细胞负载lmp1蛋白的疫苗组合物的制备方法，该方法包括以下步骤：
13.s1制备一定浓度的lmp1蛋白溶液；
14.s2由外周血或骨髓分离获得单核细胞；
15.s3将s1获得的一定浓度的lmp1蛋白溶液与s2获得的一定数量的单核细胞混合，制成单核细胞负载lmp1蛋白的疫苗组合物。
16.进一步地，s1中制备一定浓度的lmp1蛋白溶液为采用pbs将lmp1蛋白配制成一定浓度的lmp1蛋白溶液。
17.进一步地，s2中由骨髓分离获得单核细胞包括如下步骤：
18.s21取小鼠股骨，剪去股骨两头，用pbs反复冲洗股骨骨腔，得到骨髓冲出液，用40μm筛网过滤后，收集至离心管中；
19.s22将s21中的离心管离心获得骨髓细胞沉淀；加入pbs重悬骨髓细胞；将骨髓细胞悬液加入含ficoll淋巴分离液的离心管中；
20.s23将s2中的离心管离心，用吸管吸取第二层环状乳白色单核细胞层到另一离心管中，补加pbs，离心；
21.s24弃上清，加pbs重悬，再离心，弃上清，得到单核细胞团块，用适量含10％灭活fbs的rpmi 1640培养基重悬，并计数。
22.进一步地，s3中将lmp1蛋白溶液与单核细胞混合包括以下步骤：
23.s31将lmp1蛋白溶液溶解于含10％灭活fbs的rpmi 1640培养基中，使其浓度为1mg/ml；
24.s32将单核细胞加入到所述lmp1蛋白溶液中，保证单核细胞密度一致，均为2
×
107个细胞/ml；
25.s33将步骤s32的细胞悬液放入恒温培养箱中，37℃，5％co2孵育2h，每半小时振荡1次；
26.s34孵育结束后，将细胞悬液离心，弃上清，再加入适量pbs重悬，再离心，弃上清，得到负载lmp1蛋白溶液抗原的单核细胞团块；
27.s35负载lmp1蛋白溶液抗原的单核细胞用rpmi 1640培养基重悬，使细胞终浓度为5
×
107个细胞/ml，得到疫苗组合物。
28.本发明还提供了所述的单核细胞负载lmp1蛋白的疫苗组合物在制备用于治疗lmp1阳性肿瘤制品中的应用。
29.进一步地，所述疫苗组合物采用静脉注射的方式。
30.本发明的有益效果：本发明提供了一种新的lmp1蛋白溶液抗原疫苗组合物及其制备方法，通过简化的单核细胞分离操作减少了常规单核细胞分离及分化产生dc的操作步骤，极大程度地降低了疫苗制备成本；直接利用分离的单核细胞负载lmp1蛋白溶液抗原，能达到显著的抗击肿瘤效果，为更广泛的临床试验提供了前期技术基础。
附图说明
31.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
32.图1是根据本发明实施例所述的小鼠骨髓来源的单核细胞吞噬ova-fitc的效率检
测结果，包括流式代表性图和统计数据条形图；
33.图2是根据本发明实施例所述的单核细胞lmp1蛋白溶液肿瘤疫苗免疫a2受体鼠后第14天外周血抗体的检测结果；
34.图3是根据本发明实施例所述的单核细胞lmp1蛋白溶液肿瘤疫苗免疫a2受体鼠后第14天外周血特异性t细胞的检测结果，包括流式代表性图和统计数据图；
35.图4是根据本发明实施例所述的lmp1蛋白溶液单核细胞疫苗对lmp1阳性tc-1细胞系荷瘤小鼠肿瘤生长曲线(预防性模型)，在第-21、-14、-7天注射疫苗，第0天接种肿瘤细胞；
36.图5是根据本发明实施例所述的lmp1蛋白溶液单核细胞疫苗对lmp1阳性tc-1细胞系荷瘤小鼠肿瘤生长曲线(治疗性模型)，在第0天接种肿瘤细胞，第7、14天注射疫苗。
具体实施方式
37.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
38.具体地，本发明的实施例中涉及的原料生产厂家如表1所示：
39.表1：原料表
[0040][0041]
实施例1
[0042]
单核细胞的分离，包括以下步骤：
[0043]
(1)颈脱臼法处死小鼠，取其2只股骨，剪去股骨两头，用注射器吸入适量pbs反复冲洗股骨骨腔，得到骨髓冲出液，用40μm筛网过滤，然后收集至pe离心管中。
[0044]
(2)300-500g离心5min，获得骨髓细胞沉淀；加入4ml pbs重悬骨髓细胞；同时在另一pe离心管中加入3ml ficoll淋巴分离液。将骨髓细胞悬液轻轻加入含ficoll淋巴分离液的pe离心管中，注意不要破坏细胞悬液与淋巴分离液的接触界面。
[0045]
(3)将pe离心管400g离心30min，因密度不同离心管中由上到下分为四层：第一层为血浆层，第二层为环状乳白色单核细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。用吸管小心吸取第二层环状乳白色单核细胞层到另一50ml离心管中，补加pbs，400g离心5～10min。
[0046]
(4)弃上清，加pbs重悬，400g离心5～10min，弃上清，得到单核细胞团块，适量含10％灭活fbs的rpmi 1640培养基重悬，并计数。
[0047]
实施例2
[0048]
将实施例1获得的单核细胞负载lmp1蛋白溶液或ova-fitc抗原，包括如下步骤：
[0049]
(1)将lmp1蛋白溶液或ova-fitc溶解于含10％灭活fbs的rpmi1640培养基中，使其浓度1mg/ml。
[0050]
(2)将单核细胞加入到上述lmp1蛋白溶液中，保证单核细胞密度一致，均为2
×
107个细胞/ml。
[0051]
(3)将步骤(2)的细胞悬液放入恒温培养箱中，于37℃，5％co2孵育2h，每半小时振荡1次。
[0052]
(4)孵育结束后，将细胞悬液以400g离心5～10min，弃上清，再加入适量pbs重悬，再按400g离心5～10min，弃上清，得到负载lmp1蛋白溶液抗原的单核细胞团块。
[0053]
(5)步骤(4)得到的负载lmp1蛋白溶液抗原的单核细胞用rpmi 1640培养基重悬，使细胞终浓度为5
×
107个细胞/ml，该混合液即负载lmp1蛋白的疫苗组合物。用流式细胞仪检测单核细胞负载ova-fitc情况，检测结果如图1所示。
[0054]
实施例3
[0055]
将实施例2获得的疫苗组合物免疫小鼠模型，包括如下步骤：
[0056]
(1)将负载lmp1蛋白溶液的单核细胞悬液按200μl的体积由尾静脉注射入为a2小鼠体内，每只小鼠接种细胞量为1
×
107，对照组小鼠注射等体积pbs。连续接种3次，每隔7天接种1次。
[0057]
(2)肿瘤接种后第7天开始，连续追踪测量小鼠肿瘤生长状况，并于第一次接种疫苗第14天分析血清中抗体产生情况，检测结果如图2所示，图3是单核细胞lmp1蛋白溶液肿瘤疫苗免疫a2受体鼠后第14天外周血特异性t细胞的检测结果。
[0058]
(3)预防性模型：距第一次接种疫苗第14天，对每只小鼠接种肿瘤细胞。每只小鼠肿瘤细胞接种量为1
×
106，接种方式为皮下注射，小鼠肿瘤生长曲线如图4所示。
[0059]
(4)治疗性模型：每只小鼠肿瘤细胞接种量为1
×
106，接种方式为皮下注射。分别在肿瘤接种后第7、14天接种lmp1蛋白溶液单核细胞疫苗，小鼠肿瘤生长曲线如图5所示。
[0060]
该疫苗组合物具有特异性强的高效的抵抗作用，可应用于制备用于治疗实体肿瘤制品。
[0061]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。