泽泻根茎提取物在改善NAFLD及调节肠道菌群失调的应用

泽泻根茎提取物在改善nafld及调节肠道菌群失调的应用
技术领域
1.本发明涉及泽泻根茎提取物的应用，具体是指泽泻根茎提取物在改善nafld及调节肠道菌群失调的应用。


背景技术：

2.非酒精性脂肪肝(nafld)是人们最常见的肝脏疾病，与肥胖有关，是代谢综合征的肝脏表现，作为一种临床病理综合征，非酒精性脂肪肝包括一系列的肝脏疾病，从简单的肝脏脂质堆积(脂肪变)到合并炎症的脂肪性肝炎(nash)，可导致肝硬化、肝细胞癌和死亡，目前对非酒精性脂肪肝的治疗主要依靠饮食控制和运动，还没有开发出被批准的药物，因此，探索治疗非酒精性脂肪肝的有效药物非常重要，众多研究报道，非酒精性脂肪肝与肠道微生物群密切相关，目前的研究表明，肠道微生物群在非酒精性脂肪肝的发展中起着重要作用。非酒精性脂肪肝的肠道微生物群的特点是微生物的多样性下降，并且有较高的firmicutes/bacteroidaeota(f/b)比率，进一步的研究表明，肠道菌群失调直接或间接地调节促炎症细胞因子和脂肪氧化的水平，这可能对肝脏产生重要的下游影响，细菌代谢产物的变化可能在这一过程中发挥重要作用，如脂多糖(lps)和支链氨基酸(bcaa)的水平，因此，在精准医疗时代，确定微生物组的结构和机制变得越来越重要；
3.alisolb23
‑
acetate(ab23a)是一种从泽泻根茎提取物中提取、分离出来的天然三萜类化合物，所述泽泻是一种药用植物，长期以为被广泛用作传统中药，ab23a的生物学特性和多种药理活性已在体外和体内得到证实，包括抗肝炎、抗菌、抗高脂血症、抗肿瘤、保肝、抗炎和抗氧化作用，但是ab23a在改善nafld及调节nafld引起的肠道菌群失调方面的应用，值得进一步探索。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是克服上述技术的缺陷，提供泽泻根茎提取物在改善nafld及调节肠道菌群失调的应用。
5.为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为泽泻根茎提取物在改善nafld及调节肠道菌群失调的应用，所述泽泻根茎提取物是指从泽泻根茎中提取分离出的alisolb23
‑
acetate，所述alisolb 23
‑
acetate为一种三萜类化合物，所述泽泻根茎提取物可用于改善nafld病程及相关的肠道菌群失调。
6.作为改进，所述nafld主要包括因高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝，包括简单的肝脏脂质堆积到合并炎症的脂肪性肝炎。
7.作为改进，所述的肠道菌群失调是由nafld引起的肠道菌群失调。
8.本发明与现有技术相比的优点在于：本发明提供了ab23a的一种新应用，即应用于改善nafld及调节肠道菌群失调，所述nafld主要指因高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝，包括简单的肝脏脂质堆积到合并炎症的脂肪性肝，所述ab23a可抑制肠道菌群介导的bcaas(支链氨基酸)、lps(脂多糖)过量产生，降低体内lps和bcaa的浓度，改善了高脂饮食诱导的
nafld症状；所述ab23a对平衡肠道菌群有很好的调节及平衡作用，同时对高脂饮食诱导的nafld体重增加也有抑制作用。
附图说明
9.图1是本发明泽泻根茎提取物ab23a的结构式示意图。
10.图2是本发明泽泻根茎提取物ab23a的hplc鉴定图谱。
11.图3是本发明泽泻根茎提取物ab23a对高脂饮食导致的nafld小鼠模型体重的影响。
12.图4是本发明泽泻根茎提取物ab23a对高脂饮食导致的nafld小鼠模型组织病理学检测结果。
13.其中a为scd、hfd和hah组的苏木精和伊红染色的代表性肝脏切片(放大率
×
20，比例尺＝100μm)，b为scd、hfd和hah组的代表性肝脏切片的油红o染色(放大率
×
20，比例尺＝100μm)，c和d分别为scd、hfd和hah组的代表性肝脏切片及肝脏切片的油红o染色数据分析图。
14.图5是本发明泽泻根茎提取物ab23a对高脂饮食导致的nafld小鼠模型中微生物菌群丰度和多样性的影响，
15.其中a为sobs指数，b为shannon指数。
16.图6是本发明泽泻根茎提取物ab23a在改善nafld导致的肠道菌群失调的影响。
17.其中a为基于bray
‑
curtis的主坐标分析(pcoa)，分析三组中otu水平的微生物群组成，b和c分别为后壁菌门和变形菌门和拟杆菌门的比值在scd、hfd、hah三组中的比值，d为在本次测序总丰度排名前10的菌属在scd、hfd、hah各组中的丰度水平分布情况。
18.图7是肠道菌群基因功能在支链氨基酸以及脂多糖合成方面的丰度预测和验证结果。
19.其中a和b分别为肠道菌群基因功能在脂多糖(lps)以及支链氨基酸(bcaas)合成方面的丰度预测结果，c和d为scd、hfd和hah组中血浆bcaas和lps水平验证结果。
20.图8是菌属丰度与nafld代谢参数的斯皮尔曼(spearman)相关性分析热图。
具体实施方式
21.下面结合实施例对本发明泽泻根茎提取物在改善nafld及调节肠道菌群失调的应用做进一步的详细说明。
22.实施例1
23.1、实验准备
24.1)实验动物：由广州中医药大学医药动物实验中心提供的雄性c57bl/6j小鼠(8
‑
9周龄)；
25.2)实验饲料：由广州中医药大学医药动物实验中心提供的标准饲料(scd，10％的脂肪热量)和高密度饲料(60％的脂肪热量)。
26.2、实验过程
27.1)实验动物分组及过程
28.小鼠在22℃
±
1℃下饲养，12小时黑暗周期，食物和水供应充足，所有的动物维护
和治疗方案都遵循美国国立卫生研究院采用和颁布的《实验动物护理和使用指南》，并得到了广州中医药大学动物伦理委员会的批准，经过2周的适应性饲养，共24只小鼠被随机分为三组，分别为scd组(标准饲料，n＝8)，hfd组(高脂肪饮食，60％的热量来自脂肪，n＝8)、hfd+高剂量ab23a组(hah＝60mg/kg，每组n＝8)；
29.其中ab32a采用给小鼠灌胃的方式进行服用，每天一次；
30.治疗12周后，用装有冰块的eppendorf管的代谢笼收集粪便样品(从上午8:00到下午4:00)，并立即保存在
‑
80℃直到分析。在试验结束时，所有的动物处死，血清样品从眼眶神经丛中收集，采集粪便(scd、hfd和hah)、肝脏样本进行进一步分析。
31.3)实验分析与评估
32.①
小鼠体重及代谢参数的评估
33.对各组小鼠的体重和代谢参数进行测试及评估，其中代谢参数包括丙二醛(mda)、超氧化物歧化酶(sod)、丙氨酸转氨酶(alt)、天冬氨酸转氨酶(ast)、白细胞介素
‑
6(il
‑
6)、白细胞介素
‑
1β(il
‑
1β)、肿瘤坏死因子
‑
α(tnf
‑
α)、甘油三酯(serum tg)、总胆固醇(serumtc)、肝脏组织甘油三脂(hepatic tg)、肝脏组织总胆固醇(hepatic tc)。
34.②
组织病理学和临床生物化学评估
35.随机选择每组样本，用4％多聚甲醛溶液固定，进行肝脏和结肠组织学检查，然后将组织用石蜡包埋，用苏木精
‑
伊红(h&e)进行染色，制备冷冻肝脏切片(6毫米厚)，并用油红o
‑
hematoxylin染色，采用光镜对染色的切片进行拍照，苏木精
‑
伊红染色的形态和病理结果由病理科(中山大学附属第七医院)的组织病理学家根据nafld活性评分(nas)进行分析和评估。用olympus image
‑
pro plus 6.0软件对油红o染色进行量化，计算染色面积；
36.临床生化分析包括血清总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、丙氨酸氨基转移酶(alt)和天冬氨酸氨基转移酶(ast)，均用中山大学动物实验中心临床实验室的贝克曼cx5自动生化分析仪(beckman coulter,inc.,usa)检测，并按照标准常规程序进行；
37.血浆中白细胞介素(il)
‑
6/
‑
1β和肿瘤坏死因子
‑
α(tnf
‑
α)的水平由特定的elisa试剂盒进行测定；
38.肝脏丙二醛(mda)和超氧化物歧化酶(sod)的水平使用商业试剂盒按照使用说明进行监测。
39.③
血浆脂多糖(lps)和支链氨基酸(bcaas)水平的检测
40.血浆lps和bcaas的定量分别按照pierce chromogenic endotoxin quant kit(a39552，thermo scientific)和branched
‑
chainaminoacidassay kit(ab83374，abcam)的说明进行。
41.④
dna提取及聚合酶链反应扩增
42.使用qiaamp fastdna stool mini kit从粪便样本中提取三组(scd、hfd和hah)的细菌dna，通过琼脂糖凝胶电泳评估dna的完整性和质量(琼脂糖凝胶的浓度：1％；电压：5v/cm；电泳时间：20分钟)，aodrop 2000(thermo fisher scientific,wilmington,de,usa)被用来确定dna样品的浓度和纯度，使用引物338f(5'
‑
actcctacgggaggcagcag
‑
3')和806r(5'
‑
ggactachvgggtwtctaat
‑
3').pcr反应的程序如下：
43.在95℃下3分钟，在95℃下30个循环，在60℃下退火30秒，在72℃下延伸75秒，在72℃下延伸10分钟；
44.一式三份的pcr反应混合物(20μl)含有4μl的5
×
fastpfu缓冲液，2μl的2.5mm dntps，0.8μl的每个引物(5μm)，0.4μl的fastpfu聚合酶，和10ng的模板dna，根据需要使用适当体积的双蒸气h2o进行pcr反应，使用axyprep dna凝胶提取试剂盒(axygen,biosciences,usa)纯化pcr产物以去除非特异性产物，使用quantifluortm
‑
st(promega，美国)对dna浓度进行量化。
45.⑤
16s rrna基因扩增子测序及微生物组分析
46.纯化的扩增子以等摩尔浓度汇集，在illumina miseq平台(illumina,san diego,ca,usa)上进行配对端测序(2
×
300)。(上海)的标准协议；
47.使用trimmomatic对原始fastq文件进行解复用和质量过滤，通过flash软件v1.2.11进一步合并。然后将合格的fastq文件输入qiime v1.91，参照silva数据库(138版)，将测序数据聚类为操作分类单位(otu)；
48.使用mothur软件v1.30.2和qiime v1.91对达到97％核苷酸相似度的otu分别进行α
‑
多样性和β
‑
多样性分析，通过基于otu丰度和距离的主坐标分析(pcoa)验证了三组(scd、hfd和hah)肠道菌群组成丰度的差异性，用spearman等级相关系数，计算出生物相关性和统计学意义，以不同程度地代表三组(scd、hfd和hah)之间的分类水平，通过picrust2法对微生物功能进行预测，然后根据kegg正字法进行功能分类。
49.4、实验结果
50.1)统计分析
51.用graphpadprism软件(8.3.0版)进行单因素方差分析(anova)和tukey多重比较检验，分析各组之间的差异，数据以平均值
±
标准差(sd)表示，差异在p<0.05时被认为是有统计学意义的；
52.肠道细菌数据在majorbio云平台(www.majorbio.com)上进行分析，各组之间的差异通过单因素方差分析(anova)，然后用graphpadprism软件(8.3.0版)进行tukey的多重比较检验，数据以平均值
±
标准差(sd)表示，差异在p<0.05时被认为是有统计学意义的。
53.2)实验结论
54.①
ab23a对高脂饮食诱导的nafld小鼠体重增加有抑制作用(图3)，并调节代谢参数。对于不同组间小鼠代谢参数进行测试，并制表如下：
55.表1不同组间小鼠代谢参数的比较
[0056][0057]
注：**p<0.01与scd组相比；#p<0.05与hfd组相比；##p<0.01与hfd组相比。**p<0.01与scd组相比；#p<0.05与hfd组相比；##p<0.01与hfd组相比。mda：丙二醛；sod：超氧化
物歧化酶；alt：丙氨酸转氨酶；ast：天冬氨酸转氨酶；il
‑
6/
‑
1β：白细胞介素
‑
6/
‑
1β；tnf
‑
α：肿瘤坏死因子
‑
α；serumtg：血清甘油三酯；serumtc：血清总胆固醇；hepatic tg：肝脏组织甘油三脂；hepatic tc：肝脏组织总胆固醇。
[0058]
②
ab23a对高脂饮食诱导的nafld小鼠肝脏的保护作用
[0059]
用苏木精
‑
伊红(h&e)对肝脏切片进行了染色，在hfd诱导的小鼠肝脏中观察到明显的肝细胞气球样改变，并伴有严重的脂肪变性，ab23a显著降低了肝细胞脂肪变性的程度(图4
‑
a和4
‑
c)；
[0060]
进一步检查了ab23a治疗对血清和肝脏脂质的影响。与hfd组相比，ab23a治疗后，血清和肝脏中的甘油三酯(tg)和总胆固醇(tc)水平也有所下降(表1)；
[0061]
油红o染色切片的结果也表明，ab23a使红染区明显减少(图4
‑
b和4
‑
d)；
[0062]
综上ab23a不仅改善了肝脏脂肪变性，而且降低了促炎症细胞因子的产生，显示了ab23a对hfd诱导的nafld小鼠肝脏的保护作用。
[0063]
③
ab23a重新平衡了高脂饮食诱导的nafld小鼠肠道菌群的组成。
[0064]
分析了三组(scd、hfd和hah；n＝8)的微生物多样性特征，在去除不合格的读数后，共获得1250510条原始读数，每个样品平均有48396条序列，其中hfd和hah组的sobs和shannon指数明显低于scd组，表明hfd处理明显降低了菌群的丰度和多样性，ab23a可小部分恢复高脂饮食导致的菌群的丰度和多样性的降低(图5a和5b)；
[0065]
基于bray
‑
curtis的pcoa对otu水平的微生物群组成的分析结果显示各组有明显的聚类：pc1和pc2轴得分图分别为46.82％和12.13％，表明在有无ab23a或高脂饮食诱导前后，细菌群落分布特征有明显的差异性(图6a)，群落组成在门水平上的分析的结果显示了ab23a可显著逆转高脂饮食导致的厚壁菌门/拟杆菌门(f/b)比率(图6b)和放线菌门/拟杆菌门(a/b)比值的升高(图6c)；后续分析结果进一步显示，ab23a干预后可明显逆转高脂饮食诱导的本次测序总丰度排名前10的菌属丰度水平分布情况，表现为ab23a可逆转高脂饮食导致muribaculaceae(muri菌属)、lactobacillus(乳酸杆菌属)丰度明显减少，而turicibacter(都灵菌属)、faecalibaculum(粪棒状菌属)和ileibacterium(ilei菌属)丰度明显增加等，对于同属于毛螺菌科的三种菌属(lachnospiraceae_nk4a136_group、unclassified_f__lachnospiraceae和norank_f__lachnospiraceae)亦表现出类似的调节作用(图6d)。因此，ab23a可改善nafld相关的肠道菌群失调。
[0066]
④
ab23a降低肠道菌群介导的bcaas和lps的过多产生。
[0067]
运用基于16s rrna基因序列数据的picrust2分析，以预测这些肠道微生物组在nafld中的代谢变化。结果显示，微生物的代谢功能更多地参与了几个代谢途径。其中，lps的生物合成和属于bcaas的缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的合成在各组中表现出明显的差异，表明ab23a可能减少bcaas和lps的产生(图7a和7b)。为了验证ab23a对bcaa的产生和lps的生物合成的影响是由肠道菌群失调引起的，我们进一步测试了血清中bcaa和lps的水平。结果显示：hfd喂养的小鼠的bcaa产量比scd组多(图7c和7d)。ab23a治疗部分地逆转了hfd诱导的bcaas过度生产。此外，在hfd喂养的小鼠中检测到lps水平的也明显增加，这在ab23a治疗中得到了部分逆转(图7d)。这些结果表明，在hfd中，ab23a治疗可以改善由菌群失调引起的代谢紊乱。
[0068]
根据spearman相关性分析结果可知，turicibacter(都灵菌属)和ileibacterium
(ilei菌属)与bcaa和lps的水平呈显著正相关，我们推测turicibacter(都灵菌属)和ileibacterium(ilei菌属)可能在这个过程中分别对bcaa和lps的产生密切相关(图8)。
[0069]
综上所述，ab23a不仅对nafld有显著的改善作用，还对nafld中肠道菌群结构紊及其介导的支链氨基酸和脂多糖的过多产生有调节作用，因此ab23a发挥其治疗nafld的药效学作用与其潜在的益生元作用密切相关，这体现了ab23a可能具有一定的应用及商业开发价值。
[0070]
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。