一种蜜蜂工蜂血淋巴的提取方法及装置与流程

1.本发明属于昆虫生理生化领域，特别是涉及一种蜜蜂工蜂血淋巴的提取方法及装置。


背景技术：

2.昆虫血淋巴是血液和淋巴液的混合物，是代谢过程中各种物质储存和交换的场所，在调节温度和先天免疫等方面发挥重要作用。蜜蜂与其他昆虫一样，体腔内充满了流动的血液，在整个体腔内的循环是开放式的，是机体防御免疫功能的重要组成部分。蜜蜂的血液没有颜色，由白血细胞、变形细胞和带酸性的血浆组成，能够实时的反映机体的生理状态，已成为蜜蜂生物学研究中最为关键的材料之一。但是，一方面由于蜜蜂的个体较小，血淋巴含量少，离体后容易发生凝血和黑化反应，另一方面蜜蜂属于全变态昆虫，每个发育阶段的形态完全不相同，后续的实验研究往往需要采集各个发育期血淋巴的样本，同一种提取方法不能适用于所有发育期血淋巴的采集，基于以上原因给蜜蜂血淋巴的采集工作带来很大困难。
3.现有技术中的血淋巴的收集方法有很多种，但是这些方法各有利弊，有的操作步骤繁琐复杂、有的耗时长易污染、有的收集后血淋巴质量不纯含量少等等，为后续实验造成困难和不便。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种蜜蜂工蜂血淋巴的提取方法及装置，以解决上述问题，达到最大程度的保证提取的血淋巴量和纯度的目的。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：一种蜜蜂工蜂血淋巴的提取方法，包括以下步骤：
6.预处理，取蜜蜂工蜂进行预处理；
7.提取血淋巴，使用血淋巴提取装置对完成预处理的所述蜜蜂工蜂进行血淋巴提取；
8.提纯血淋巴，对提取的血淋巴进行提纯处理；
9.血淋巴保存，对提纯后的血淋巴进行低温保存，用于下一步实验。
10.优选的，所述蜜蜂工蜂包括5日龄蜜蜂工蜂幼虫、5日龄蜜蜂工蜂蛹、蜜蜂工蜂成年蜂；
11.所述5日龄蜜蜂工蜂幼虫、5日龄蜜蜂工蜂蛹的预处理方式为无菌处理，使用无菌生理盐水对所述5日龄蜜蜂工蜂幼虫、5日龄蜜蜂工蜂蛹进行清洗，清洗完成后使用消毒的滤纸吸干所述5日龄蜜蜂工蜂幼虫、5日龄蜜蜂工蜂蛹体表的水分；
12.所述蜜蜂工蜂成年蜂的预处理方式为冷冻麻醉处理，取羽化出房后的成年工蜂，放置在冰箱冷冻层内冷冻麻醉3-5min，待所述成年工蜂停止运动后，剪去翅膀和足并固定。
13.优选的，提取所述5日龄蜜蜂工蜂幼虫的血淋巴：使所述5日龄蜜蜂工蜂幼虫腹面
朝上，并固定住头尾两端，绷紧表皮，将所述血淋巴提取装置刺入所述5日龄蜜蜂工蜂幼虫头部位置下方，吸取血淋巴；
14.提取所述5日龄蜜蜂工蜂蛹的血淋巴：使所述5日龄蜜蜂工蜂蛹背面朝上，并固定住头尾两端，将所述血淋巴提取装置刺入所述5日龄蜜蜂工蜂蛹3-4节腹节间膜，吸取血淋巴；
15.提取所述成年工蜂的血淋巴：将所述成年工蜂的一只触角从根部拽下，用手指按摩所述成年工蜂胸腹部促进血淋巴从触角根部涌出，使用所述血淋巴提取装置吸取血淋巴。
16.优选的，所述提纯血淋巴过程如下：将提取的血淋巴液转移至1.5ml超滤离心管内洗涤1次，2500r/min离心9-10min，离心处理完成后留取底层的淡黄色澄清液体。
17.优选的，所述血淋巴保存：将提取提纯后的血淋巴放入冰箱进行冷冻保存。
18.一种用于蜜蜂工蜂血淋巴提取用针头的制作方法，取一支玻璃毛细管，手捏所述玻璃毛细管一端，镊子夹住所述玻璃毛细管另一端，选取所述玻璃毛细管中间靠近镊子一端的部位置于酒精灯上加热，同时手捏一端向外拉扯，待所述玻璃毛细管融化并拉断后，保留手捏一端的所述玻璃毛细管，将所述玻璃毛细管的拉断处的尖端切割平整，使其有吸入口，得到所述针头。
19.一种蜜蜂工蜂血淋巴提取方法的提取装置，包括抽气筒，所述抽气筒的进气口连通有抽气软管一端，所述抽气软管另一端连通有低温收集部，所述低温收集部还连通有集液软管一端，所述集液软管另一端连通有集液针头尾端，所述集液针头为所述针头。
20.优选的，所述集液针头包括与所述集液软管连通的收集段，所述收集段另一端连通有过渡段一端，所述过渡段另一端连通有集液尖端。
21.优选的，所述低温收集部包括集液管，所述集液管的外侧套设有冰浴管，所述集液管、所述冰浴管的顶端为开口结构，所述冰浴管侧壁为中空结构，所述集液管、所述冰浴管的顶端设有密封连接部。
22.优选的，所述密封连接部包括密封盖，底部与所述集液管、所述冰浴管的顶端螺纹连接，所述密封盖上开设有第一通孔和第二通孔，所述第一通孔与所述抽气软管连通，所述第二通孔与所述集液软管连通，所述密封盖顶端一侧铰接有密封胶条，所述密封胶条上设置有两个密封胶头，两个所述密封胶头分别与所述第一通孔和所述第二通孔相对应。
23.本发明具有如下技术效果：
24.1、本发明提供了一套涉及蜜蜂工蜂各个发育时期血淋巴的提取方法：蜜蜂属于全变态昆虫，每个发育阶段的形态完全不相同，后续的实验研究往往需要采集各个发育期血淋巴的样本。因此，本发明提供了一种蜜蜂幼虫期、蛹期和成蜂期血淋巴采集的可靠方法，为满足后续实验研究提供保障和便利。
25.2、本发明能最大程度的保证提取的血量和纯度：蜜蜂属于小型昆虫，体内血量较少，而且血液循环系统属于开放式，取血极其困难，极易损伤内部器官结构，造成收集的血淋巴不纯或被污染。本发明提供的提取方法可以快速获得大量纯净无污染未黑化的蜜蜂工蜂血淋巴液。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
27.图1为本发明提取装置的剖视图；
28.图2为图1中a的局部放大图；
29.图3为图1中b的局部放大图。
30.其中，1、抽气筒；2、抽气软管；3、集液软管；4、集液针头；5、冰浴管；6、集液管；7、密封盖；8、密封胶条；9、密封胶头；10、第一螺纹槽；11、第一螺纹；12、第二螺纹槽；13、第二螺纹；41、收集段；42、过渡段；43、集液尖端。
具体实施方式
31.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
33.参照附图1-3，本发明提供一种蜜蜂工蜂血淋巴的提取方法，包括以下步骤：
34.预处理，取蜜蜂工蜂进行预处理，预处理包括对5日龄蜜蜂工蜂幼虫和5日龄蜜蜂工蜂蛹的无菌处理、对蜜蜂工蜂成年蜂的冷冻麻醉处理，无菌处理可以去除5日龄蜜蜂工蜂幼虫和5日龄蜜蜂工蜂蛹体表的细菌，防止收集的血淋巴被细菌污染而造成实验结果出现误差，冷冻麻醉处理可以防止成年蜂蜇伤实验操作人员；
35.提取血淋巴，使用血淋巴提取装置对完成预处理的蜜蜂工蜂进行血淋巴提取，使用特定的血淋巴提取装置对蜜蜂工蜂血淋巴进行提取，可以保证血淋巴提取过程不与空气直接接触，极大地降低了血淋巴样品被氧化污染的风险和几率；
36.提纯血淋巴，对5日龄蜜蜂工蜂幼虫和5日龄蜜蜂工蜂蛹提取的血淋巴进行提纯处理，提纯处理可以去除提取的血淋巴中的组织蛋白和消化液等杂质，保证血淋巴的纯度；
37.血淋巴保存，对提纯后的血淋巴进行低温保存，用于下一步实验，低温保存可以避免血淋巴因为长时间放置而发生成分变化并最终影响研究结果。
38.进一步优化方案，蜜蜂工蜂包括5日龄蜜蜂工蜂幼虫、5日龄蜜蜂工蜂蛹、蜜蜂工蜂成年蜂；
39.5日龄蜜蜂工蜂幼虫、5日龄蜜蜂工蜂蛹的预处理方式为无菌处理，使用无菌生理盐水对5日龄蜜蜂工蜂幼虫、5日龄蜜蜂工蜂蛹进行清洗，清洗完成后使用消毒的滤纸吸干5日龄蜜蜂工蜂幼虫、5日龄蜜蜂工蜂蛹体表的水分；
40.蜜蜂工蜂成年蜂的预处理方式为冷冻麻醉处理，取羽化出房后的成年工蜂，放置在冰箱冷冻层内冷冻麻醉3-5min，待成年工蜂停止运动后，剪去翅膀和足并固定。
41.对成年工蜂进行-20℃的冷冻麻醉处理3-5min，可以使成年工蜂处于麻醉状态，不
会蜇伤实验人员，使用蜡盘将剪去翅膀和足的蜜蜂工蜂固定，能够防止蜜蜂随意扭动，成年工蜂处于麻醉状态中时其体内的血液任然处于流动状态，不影响血淋巴的提取。
42.进一步优化方案，提取5日龄蜜蜂工蜂幼虫的血淋巴：使5日龄蜜蜂工蜂幼虫腹面朝上，并固定住头尾两端，绷紧表皮，将血淋巴提取装置刺入5日龄蜜蜂工蜂幼虫头部位置下方，吸取血淋巴；
43.提取5日龄蜜蜂工蜂蛹的血淋巴：使5日龄蜜蜂工蜂蛹背面朝上，并固定住头尾两端，将血淋巴提取装置刺入5日龄蜜蜂工蜂蛹3-4节腹节间膜，吸取血淋巴；
44.提取成年工蜂的血淋巴：将成年工蜂的一只触角从根部拽下，用手指按摩成年工蜂胸腹部促进血淋巴从触角根部涌出，使用血淋巴提取装置吸取血淋巴。
45.蜜蜂为全变态昆虫，各个发育阶段的形态完全不同，而后续的实验研究需要采集各个发育期的血淋巴的样本，因此将蜜蜂工蜂分为5日龄蜜蜂工蜂幼虫、5日龄蜜蜂工蜂蛹、蜜蜂工蜂成年蜂三个不同的阶段进行血淋巴的提取，可以满足后续实验研究对不同发育期的血淋巴样本的要求。
46.进一步优化方案，提纯血淋巴过程如下：将提取的血淋巴液转移至1.5ml超滤离心管内洗涤1次，2500r/min离心9-10min，离心处理完成后留取底层的淡黄色澄清液体。
47.由于蜜蜂体内的血液循环是开放式的，因此，提取的蜜蜂血淋巴中会含有消化液、蛋白等其他杂质，含有的其他杂质会对后续的实验研究的结果产生不利影响，使用超滤离心管可以对含有杂质的血淋巴进行提纯处理，去除消化液、蛋白等杂质，为后续的实验研究提供纯度较高的血淋巴。
48.进一步优化方案，血淋巴保存：将提取提纯后的血淋巴放入冰箱进行冷冻保存。
49.冰箱选择实验室常用的超低温冰箱，冷冻保存温度设置为-80℃，超低温冷冻保存可以极大地延长血淋巴的保存时间，同时可以防止保存过程中血淋巴成分发生变化而影响后续实验研究结果。
50.一种用于蜜蜂工蜂血淋巴提取用针头的制作方法，取一支玻璃毛细管，手捏玻璃毛细管一端，镊子夹住玻璃毛细管另一端，选取玻璃毛细管中间靠近镊子一端的部位置于酒精灯上加热，同时手捏一端向外拉扯，待玻璃毛细管融化并拉断后，保留手捏一端的玻璃毛细管，将玻璃毛细管的拉断处的尖端切割平整，使其有吸入口，得到针头。
51.一种蜜蜂工蜂血淋巴的提取方法的提取装置，包括抽气筒1，抽气筒1的进气口连通有抽气软管2一端，抽气软管2另一端连通有低温收集部，低温收集部还连通有集液软管3一端，集液软管3另一端连通有集液针头4尾端，集液针头4为蜜蜂工蜂血淋巴提取用针头的制作方法所制得的针头。
52.将集液针头4的尖端插入蜜蜂工蜂体内，然后利用抽气筒1对整个提取装置进行抽气，使整个装置内部形成负压环境，在负压的作用下，蜜蜂工蜂体内的血淋巴通过集液针头4进入到集液软管3内，再进入到低温收集部内，低温收集部可以收集提取的蜜蜂工蜂血淋巴，并为血淋巴提供临时的低温环境。
53.进一步优化方案，集液针头4包括与集液软管3连通的收集段41，收集段41另一端连通有过渡段42一端，过渡段42另一端连通有集液尖端43。
54.将集液尖端43插入蜜蜂工蜂体内吸取血淋巴，吸取的血淋巴通过集液尖端43到达过渡段42和收集段41内，然后会通过集液软管3最终到达低温收集部内，蜜蜂工蜂个体较
小，普通的针头相对于蜜蜂工蜂来说仍然比较大，因此，需要制作更小的针头以适应蜜蜂工蜂的较小体型，制作针头时，取1支外径1.8-2mm，长度100mm的玻璃毛细管，手捏玻璃毛细管一端，另一端用镊子夹住，选取玻璃毛细管中间靠近镊子一端的部位置于酒精灯上加热，同时手捏一端向外拉扯，待玻璃毛细管融化并拉断后，保留手捏一端的玻璃毛细管，在玻璃毛细管的拉断处选择适当位置切割平整，使其有吸入口。
55.进一步优化方案，低温收集部包括集液管6，集液管6的外侧套设有冰浴管5，集液管6、冰浴管5的顶端为开口结构，冰浴管5侧壁为中空结构，集液管6、冰浴管5的顶端设有密封连接部。
56.进一步优化方案，密封连接部包括密封盖7，底部与集液管6、冰浴管5的顶端螺纹连接，密封盖7上开设有第一通孔和第二通孔，第一通孔与抽气软管2连通，第二通孔与集液软管3连通，密封盖7顶端一侧铰接有密封胶条8，密封胶条8上设置有两个密封胶头9，两个密封胶头9分别与第一通孔和第二通孔相对应。
57.集液管6用于收集提取的淋巴液，冰浴管5位于集液管6的外侧，并且冰浴管5的内壁与集液管6的外壁相贴合，冰浴管5的外侧上端开设有冰块投入口(图中未画出)，外侧底部开设有液体排出口(图中未画出)，使用集液管6收集蜜蜂血淋巴时首先向冰浴管5内投放一定量的碎冰，待集液管6内部的温度降低后开始进行蜜蜂血淋巴收集工作，收集到足量的蜜蜂血淋巴后将抽气软管2和集液软管3从密封盖7上拔下，然后利用密封胶条8上的两个密封胶头9将密封盖7的第一通孔和第二通孔堵住，将冰浴管5从密封盖7上拆下来，剩余的密封盖7和集液管6放入-80℃超低温冰箱中进行低温保存，以便下一步实验使用，冰浴管5内的碎冰全部融化不能再提供低温环境时，将液体排出口打开使液态水排出冰浴管5，然后关闭液体排出口后再重新向冰浴管5内添加碎冰。
58.进一步的，集液管6和冰浴管5通过螺纹连接的方式连接到密封盖7上，密封盖7的底端开设有两个环形凹槽，内侧的环形凹槽用于容纳集液管6，外侧的环形凹槽用于容纳冰浴管5，集液管6的内侧顶部设置有第二螺纹13，内侧的环形凹槽内壁上设置有与第二螺纹13相配合的第二螺纹槽12，冰浴管5的外侧顶部设置有第一螺纹11，外侧的环形凹槽内壁上设置有与第一螺纹11相配合的第一螺纹槽10，血淋巴收集完成后，通过螺旋方式将冰浴管5从密封盖7上拆卸下来，并将抽气软管2和集液软管3从密封盖7上拔出，使用密封胶条8上的两个密封胶头9将密封盖7堵住，然后放入-80℃超低温冰箱中进行低温保存，以便下一步实验使用。
59.本实施例的工作过程如下：
60.首先取1支外径1.8-2mm，长度100mm的玻璃毛细管，通过酒精灯加热的方式将其制作成集液针头4，然后组装成血淋巴提取装置，提取装置组装完成后对蜜蜂工蜂进行血淋巴提取，当蜜蜂工蜂为5日龄蜜蜂工蜂幼虫时，使用无菌生理盐水对幼虫进行清洗，并用消毒的滤纸吸干幼虫体表的水分，将幼虫头尾两端固定并使其腹面朝上，绷紧表皮，使用提取装置刺入幼虫头部下方，提取血淋巴；当蜜蜂工蜂为5日龄蜜蜂工蜂蛹时，使用无菌生理盐水对蛹进行清洗，并用消毒的滤纸吸干蛹体表的水分，将蛹背面朝上并固定住头尾两端，使用提取装置刺入蛹3-4节腹节间膜，提取血淋巴；当蜜蜂工蜂为成年蜂时，将蜜蜂放置在冰箱冷冻层内冷冻麻醉3-5min，蜜蜂停止运动后剪去翅膀和足并固定，从根部将蜜蜂的一只触角拽下，用手指按摩蜜蜂胸腹部促进血淋巴从触角根部涌出，使用血淋巴提取装置吸取血
淋巴，血淋巴提取完成后转移到超滤离心管内进行提纯处理，得到纯度较高的血淋巴后将其放入超低温冰箱中进行保存，等待下一步实验使用。
61.在本发明的描述中，需要理解的是，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
62.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。