一种用于胰岛移植的双细胞共封装微凝胶及其制备方法

1.本发明涉及生物医用材料、组织工程和再生医学的技术领域，尤其是指一种用于胰岛移植的双细胞共封装微凝胶及其制备方法。


背景技术：

2.糖尿病是一种以高血糖为主要特征的慢性病。人体内持续偏高的血糖会引发许多并发症，如糖尿病足、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变等，导致多器官损伤，是严重危害人类健康的重大公共性疾病。目前。临床上最常用的治疗1型糖尿病和晚期2型糖尿病的方法是注射外源性胰岛素。然而，反复的胰岛素注射给患者带来痛苦和不便，注射不当还有可能引发低血糖。因此，寻找一种能模拟天然胰腺中β细胞的实时胰岛素分泌模式的替代策略引起了研究者们的广泛兴趣。胰岛移植是其中一种相当有前景的细胞治疗策略。不幸地是，外源性胰岛的植入会引发体内免疫系统的排斥，导致胰岛活性迅速下降。为克服机体排斥反应，移植胰岛后的患者均需长期服用免疫抑制剂，极易诱发机体免疫系统的紊乱和其他并发症。
3.研究表明，间充质干细胞与胰岛联合移植具有良好的效果。间充质干细胞具低免疫原性和免疫抑制作用。骨髓间充质干细胞与胰岛联合移植有可能防止排斥反应，延长移植物存活时间。间充质干细胞可通过其衍生的胞外囊泡，其包含有生物活性旁分泌分子，可发挥免疫调节作用。因此，间充质干细胞在胰岛移植中具有延长移植物存活的特性。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提出了一种用于胰岛移植的双细胞共封装微凝胶及其制备方法，该微凝胶具有良好的生物相容性，可用于胰岛细胞的包载，共封装的间充质干细胞可释放免疫调节因子，能抑制免疫细胞的作用，为细胞移植提供一个良好的免疫耐受环境。
5.为实现上述目的，本发明所提供的技术方案为：一种用于胰岛移植的双细胞共封装微凝胶的制备方法，包括以下步骤：
6.1)将材料a溶解于pbs溶液中，加入光引发剂，并将胰岛细胞和间充质干细胞分散到材料a的溶液中，得到分散相；用氟化油将表面活性剂进行稀释，得到连续相；其中，所选材料a为碳碳双键改性的聚合物材料；
7.2)将分散相和连续相通过聚四氟乙烯管连接到微流控芯片中，剪切得到微凝胶，将制备得到的微凝胶使用蓝光照射使其内部交联；
8.3)将内部交联后的微凝胶转移到新的氟化油中，待其挥发后，用pbs洗涤，离心得到双细胞共封装微凝胶。
9.优选的，在步骤1)中，所述聚合物材料为明胶、胶原、透明质酸、壳聚糖、羟甲基纤维素、海藻酸钠中的一种。
10.优选的，在步骤1)中，所用干细胞与胰岛细胞的比例为2000:1-500:1。
11.优选的，在步骤1)中，所述聚合物材料在分散相中的浓度分别为1-10％。
12.优选的，在步骤1)中，所述聚合物材料的制备包括如下过程：
13.将浓度为5-15％的聚合物的磷酸盐缓冲溶液ph＝7.2在60℃水浴锅中搅拌1小时，稍冷却至50℃，逐滴加入体积比为5％-20％的甲基丙烯酸酐，反应3小时，加入磷酸盐缓冲溶液稀释至原反应物体积的五倍以终止反应，将反应液进行透析7天后冻干得到碳碳双键改性的聚合物材料。
14.优选的，在步骤1)中，所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基磷酸锂。
15.优选的，在步骤1)中，所述光引发剂在分散相中的浓度为0.5-5mg/ml。
16.优选的，在步骤1)中，所述表面活性剂为2wt％fluo-surf的氟化油hfe7500溶液；所述氟化油将表面活性剂稀释至浓度为0.05wt％-0.4wt％。
17.优选的，在步骤2)中，所述微流控芯片使用t型或十字型通道；所述分散相与连续相的流动速率分别为0.1-0.25ml/h和1-2.5ml/h，所述蓝光照射的时长为0.5-2分钟。
18.本发明也提供了一种由上述方法制备得到的用于胰岛移植的双细胞共封装微凝胶。
19.本发明与现有技术相比，具有如下优点与有益效果：
20.1、本发明所用材料均为天然高分子材料，具有良好的细胞相容性。
21.2、本发明选用的改性方式可实现蓝光照射交联，反应条件温和。
22.3、本发明使用的微凝胶的封装形式可以为封装在其中的细胞提供良好的物质传输效率以及一定的免疫屏障的作用。
23.4、本发明使用的间充质干细胞可为植入后的微凝胶提供免疫调节的功能，可延长胰岛细胞的存活以及功能维持。
附图说明
24.图1为实施例的功能机理图。
25.图2为交联后的微凝胶的明场展示图。
26.图3为包载双细胞的活性展示图。
具体实施方式
27.以下结合具体实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细的描述，但本发明的保护范围及实施方式不限于此。
28.以下所用碳碳双键改性的明胶的制备包括以下过程：
29.称取5g明胶溶解到50mlpbs缓冲液中。在60℃恒温搅拌溶解1小时后，降温至50℃水浴并用注射泵以0.5ml/分钟的速率逐滴加入10ml的甲基丙烯酸酐，反应3小时。待其稍冷却至40℃时，用相同温度的250ml温pbs稀释反应物以终止反应。冷却至室温后，装入截留分子量为12000～14000da的透析袋中，封口后放在40℃的恒温去离子水中透析7天。将透析后的溶液在10000-12000转速度下离心10分钟，重复2～3次，取上清液冷冻干燥，得到碳碳双键改性的明胶。
30.以下所用碳碳双键改性的透明质酸的制备包括以下过程：
31.称取4g透明质酸溶于300ml去离子水中，室温下搅拌直至溶解，用注射泵以0.5ml/
分钟的速率逐滴加入10ml的甲基丙烯酸酐，混合均匀后用1mol/l的氢氧化钠溶液调节溶液ph至8.0～9.0之间，0℃下反应12小时后，加入冷乙醇使其结晶沉淀，离心后将沉淀重新溶解在少数去离子水中，用12000～14000da的透析袋透析7天，得到海绵絮状的白色固体即为碳碳双键改性的透明质酸。
32.实施例1
33.1)将10mg碳碳双键改性的明胶提前放在生物安全柜内紫外灭菌过夜，然后加入到1mlpbs溶液中，升温到40℃搅拌溶解，再加入0.5mg光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(lap)，得到水相分散相。
34.2)将2％的fluo-surf的7500溶液用氟化油7500稀释五倍至浓度为0.05wt％，作为油相连续相。
35.3)将两相分别引入到t字型微流控芯片中。调节控制分散相的流速为0.1ml/h和1ml/h，通过剪切得到油包水的微乳液滴，将制备得到的液滴以及含表面活性剂的7500收集到15ml离心管中，用紫外光照射0.5分钟，得到交联后的包载细胞的微凝胶。使用移液枪将微凝胶以及少部分氟化油7500转移到表面皿中，加入更容易挥发的氟化油hfe7300破乳，等氟化油自然挥发后，用pbs洗涤，2000r/min离心3分钟，去除上层pbs得到交联后的微凝胶。如图2中a所示，制备后的微凝胶具有饱满的球状，且尺寸均匀，都大约为200微米的直径。
36.实施例2
37.1)将100mg碳碳双键改性的明胶提前放在生物安全柜内紫外灭菌过夜，然后加入到1mlpbs溶液中，升温到40℃搅拌溶解，再加入5mg光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(lap)，得到水相分散相。
38.2)将2％的fluo-surf的7500溶液用氟化油7500稀释五倍至浓度为0.4wt％，作为油相连续相。
39.3)将两相分别引入到t字型微流控芯片中。调节控制分散相的流速为0.6ml/h和6ml/h，通过剪切得到油包水的微乳液滴，将制备得到的液滴以及含表面活性剂的7500收集到15ml离心管中，用紫外光照射3分钟，得到交联后的包载细胞的微凝胶。使用移液枪将微凝胶以及少部分氟化油7500转移到表面皿中，加入更容易挥发的氟化油hfe7300破乳，等氟化油自然挥发后，用pbs洗涤，2000r/min离心3分钟，去除上层pbs得到交联后的微凝胶。如图2中b所示，交联后的微凝胶同样具有直径约200微米的饱满的球状。
40.实施例3
41.1)将30mg碳碳双键改性的透明质酸提前放在生物安全柜内紫外灭菌过夜，然后加入到1mlpbs溶液中，升温到40℃搅拌溶解，再加入5mg光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(lap)，搅拌均匀后取其中200微升溶液，将200当量的胰岛细胞与1
×
105个间充质干细胞(比例1:500)加入到溶液中并轻轻重悬，得到包含胰岛和间充质干细胞的水相分散相。
42.2)将2％的fluo-surf的7500溶液用氟化油7500稀释四十倍至浓度为0.05wt％，作为油相连续相。
43.3)将两相分别引入到t型微流控芯片中。调节控制分散相的流速为0.4ml/h和4ml/h，通过剪切得到油包水的微乳液滴，将制备得到的液滴以及含表面活性剂的7500收集到15ml离心管中，用蓝光照射2分钟，得到交联后的包载细胞的微凝胶。使用移液枪将微凝胶
以及少部分氟化油7500转移到表面皿中，加入更容易挥发的氟化油hfe7300破乳，等氟化油自然挥发后，用pbs洗涤，2000r/min离心3分钟，去除上层pbs，将微凝胶转移到新的细胞培养皿，并加入1640培养基进行培养。
44.本实施例制备的微凝胶的形态以及细胞活性如图3中a所示，微凝胶包载胰岛细胞和间充质干细胞后共培养24小时依然具有比较良好的活性，说明微凝胶的封装过程以及间充质干细胞的共培养并没有对胰岛活性产生较大影响。
45.实施例4
46.1)将100mg碳碳双键改性的透明质酸提前放在生物安全柜内紫外灭菌过夜，然后加入到1mlpbs溶液中，升温到40℃搅拌溶解，再加入5mg光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(lap)，搅拌均匀后取其中200微升溶液，将150当量的胰岛细胞与3
×
105个间充质干细胞(比例1:2000)加入到溶液中并轻轻重悬，得到包含胰岛和间充质干细胞的水相分散相。
47.2)将2％的fluo-surf的7500溶液用氟化油7500稀释十倍至浓度为0.2wt％，作为油相连续相。
48.3)将两相分别引入到t型微流控芯片中。调节控制分散相的流速为0.25ml/h和2.5ml/h，通过剪切得到油包水的微乳液滴，将制备得到的液滴以及含表面活性剂的7500收集到15ml离心管中，用蓝光照射2分钟，得到交联后的包载细胞的微凝胶。使用移液枪将微凝胶以及少部分氟化油7500转移到表面皿中，加入更容易挥发的氟化油hfe7300破乳，等氟化油自然挥发后，用pbs洗涤，2000r/min离心3分钟，去除上层pbs，将微凝胶转移到新的细胞培养皿，并加入1640培养基进行培养。
49.本实施例制备的微凝胶的形态以及细胞活性如图3中b所示，微凝胶包载胰岛细胞和间充质干细胞后共培养24小时依然具有比较良好的活性，说明微凝胶的封装过程以及间充质干细胞的共培养并没有对胰岛活性产生较大影响。
50.以上实施例的功能机理请见图1所示。
51.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。