1.本发明属于生物医药技术领域，尤其是涉及一种用于皮肤修复的干细胞外泌体制剂。
背景技术：
2.皮肤是对身体起保护作用的防御膜，是对于疾病的第一道防线，并且，表皮起到防止微生物侵入的屏障的作用。由此，在创伤、烧伤、擦伤、刮伤以及其他皮肤损伤的治疗过程中，首要目的是迅速缝合以预防感染，以及治疗创伤。
3.最轻度的创伤仅限于皮肤表皮层，稍重者有皮肤和皮下组织断裂，并出现伤口；严重的创伤可有肌肉、肌键、神经的断裂及骨折。轻度创伤可通过上皮再生愈合，后两者由于创伤严重，会引起正常皮肤组织的外观形态和组织病理学改变而形成瘢痕，瘢痕生长超过一定的限度，就会发生各种并发症，诸如外形的破坏及功能活动障碍等，给患者带来巨大的肉体痛苦和精神痛苦，尤其是烧伤、烫伤、严重外伤后遗留的瘢痕。
4.各种创伤均会造成不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损，必须通过细胞增生和细胞间基质的形成来进行组织修复。在此修复过程中，成纤维细胞起着十分重要的作用，在创伤修复的后期，成纤维细胞通过分泌胶原酶参与修复后组织的改建。
5.外泌体(exosome)是细胞向胞外分泌的囊泡类小体，直径为30～150纳米，具有典型的脂质双分子层膜结构。干细胞来源的外泌体不仅含有受体即蛋白质，还含有核成分，因此能够起到细胞间交流的作用。因此，如何利用干细胞外泌体提供一种能够更好的修复皮肤的制剂是目前需要解决的问题。
技术实现要素：
6.有鉴于此，本发明旨在提出一种用于皮肤修复的干细胞外泌体制剂，以解决上述问题。
7.为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
8.一种用于皮肤修复的干细胞外泌体制剂，包括基础添加剂和作为活性成分的干细胞外泌体，其中，干细胞外泌体由以下方法制备得到：
9.1)将人脐带血间充质干细胞在培养基中进行传代培养，选择3-5代间充质干细胞在dmem/f12培养基培养待细胞融合率达到90-95％，消化回收细胞；
10.2)将消化后的细胞接种于诱导培养基中进行诱导培养，诱导培养基中添加的诱导培养试剂为10-15ng/ml活性肽、1-5ng/ml植物硫肽激素-α、50-100ng/ml表皮生长因子、0.1-0.3μmol/ml的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，将接种了间充质干细胞的培养基与5％co2、37℃的条件下培养48-72h回收培养上清，过滤后通过超速离心法分离纯化得到干细胞外泌体。
11.进一步，干细胞外泌体以蛋白质质量计的质量百分比用量为0.007-0.012％。
12.进一步，干细胞外泌体以蛋白质质量计的质量百分比用量为0.0095％。
13.进一步，活性肽为谷胱甘肽。
14.进一步，按重量百分比计，基础添加剂包括0.5-0.8％海茴香提取物、0.1-0.3％神经酰胺、0.05-0.2％虾青素、1-3％枸杞多糖、0.5-1％维生素e、0.5-1％卡波姆。
15.进一步，分离纯化方法包括如下步骤：
16.1)将收集的培养上清液500-700g离心8-10min，保留上清液，弃沉淀，去除培养液中的细胞；
17.2)将得到的上清液1500-2000g离心15-20min，保留上清液，弃沉淀，去除细胞碎片；
18.3)将得到的上清液10000-20000g离心50-90min，保留上清液，弃沉淀，去除细胞碎片；
19.4)将得到的上清液120000-200000g离心80-130min，弃上清液，保留沉淀作为提取的干细胞外泌体。
20.本发明还提供了一种如上述任一项所述的用于皮肤修复的干细胞外泌体制剂在制备皮肤修复药物中的应用。
21.相对于现有技术，本发明所述的用于皮肤修复的干细胞外泌体制剂具有以下优势：
22.本发明采用特定成分作诱导试剂对干细胞进行培养，能够影响干细胞产生的外泌体的活性及外泌体纯度，且本发明制备的干细胞外泌体能够有效促进胶原的分泌，添加了该外泌体的制剂也更适用于进行皮肤修复，更有利于淡化瘢痕。
具体实施方式
23.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
24.下面将结合实施例来详细说明本发明。
25.实施例1
26.干细胞外泌体由以下方法制备得到：
27.1)将人脐带血间充质干细胞接种在dmem/f12培养基中进行传代培养，接种密度为4
×
104个细胞/ml，培养条件为5％co2、37℃；之后选择3-5代间充质干细胞重新在dmem/f12培养基培养，待细胞融合率达到90-95％，用0.25％胰酶消化1min左右消化细胞，加终止液吹打收集细胞；
28.2)选择生长状态良好的消化后的细胞并接种于诱导培养基中，诱导培养基为添加了11ng/ml谷胱甘肽、2.5ng/ml植物硫肽激素-α、100ng/ml表皮生长因子、0.15μmol/ml的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的dmem/f12培养基，置于5％co2、37℃的条件下培养72h，每24h更换一次培养基，培养结束回收培养上清；
29.3)过滤后通过超速离心法分离纯化得到干细胞外泌体；具体步骤为：将收集的培养上清液500g离心10min，保留上清液，弃沉淀，去除培养液中的细胞；将得到的上清液2000g离心20min，保留上清液，弃沉淀，去除细胞碎片；将得到的上清液20000g离心90min，保留上清液，弃沉淀，去除细胞碎片；将得到的上清液150000g离心120min，弃上清液，保留沉淀作为提取的干细胞外泌体，并于4℃以下保存备用。
30.人脐带血间充质干细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：cp-h165。
31.实施例2
32.在上述实施例1的基础上，诱导培养基中添加的诱导培养试剂为10ng/ml谷胱甘肽、4ng/ml植物硫肽激素-α、80ng/ml表皮生长因子、0.3μmol/ml的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。
33.实施例3
34.在上述实施例1的基础上，诱导培养基中添加的诱导培养试剂为15ng/ml谷胱甘肽、1ng/ml植物硫肽激素-α、90ng/ml表皮生长因子、0.2μmol/ml的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。
35.实施例4
36.在上述实施例1的基础上，诱导培养基中添加的诱导培养试剂为15ng/ml谷胱甘肽、3ng/ml植物硫肽激素-α、50ng/ml表皮生长因子、0.3μmol/ml的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。
37.对比例1
38.在上述实施例1的基础上，培养基仅采用基础dmem/f12培养基。
39.对比例2
40.在上述实施例1的基础上，诱导培养基中添加的诱导培养试剂为11ng/ml谷胱甘肽、100ng/ml表皮生长因子、0.15μmol/ml的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。
41.对比例3
42.在上述实施例1的基础上，诱导培养基中添加的诱导培养试剂为11ng/ml谷胱甘肽、2.5ng/ml植物硫肽激素-α、100ng/ml表皮生长因子。
43.对比例4
44.在上述实施例1的基础上，诱导培养基中添加的诱导培养试剂为2.5ng/ml植物硫肽激素-α、100ng/ml表皮生长因子、0.15μmol/ml的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。
45.对实施例1-4和对比例1-4得到的外泌体采用bca法对其进行蛋白质定量检测，后续以蛋白质定量值计算外泌体的用量。
46.表1实施例和对比例外泌体蛋白含量表
47.组别蛋白质浓度mg/ml实施例10.907638实施例20.852841实施例30.860354实施例40.836087对比例10.443842对比例20.713596对比例30.792863对比例40.807439
48.从表1可以看出，实施例和对比例都能够得到间充质干细胞外泌体，但实施例得到的干细胞外泌体的蛋白浓度高于对比例，说明本发明方法制备的干细胞外泌体纯度更高。而对比例2-4的诱导培养基缺少了某些成分后，干细胞外泌体纯度明显降低。
49.药理实验-人成纤维细胞i、iii型胶原蛋白分泌影响实验
50.细胞培养孔板，每孔加1000个人成纤维细胞，加入dmem/f12培养基，每48h换液一次，待细胞附着后，各组分别加入10μl供试液，供试液中蛋白含量为30μg/ml，并设置空白对照组，即采用等体积pbs缓冲液，培养10d，elasa法测定i、iii型胶原蛋白含量，并进行数据统计分析，结果如下表2。
51.表2 i、iii型胶原蛋白含量表
52.供试液i型胶原蛋白ng/mliii型胶原蛋白ng/ml实施例1458.96
±
48.7899.51
±
8.65实施例2426.15
±
40.2685.49
±
7.37实施例3419.53
±
42.6486.73
±
7.31实施例4431.04
±
39.5781.65
±
6.98对比例1298.34
±
34.1854.37
±
4.28对比例2224.26
±
31.8348.81
±
4.06对比例3247.13
±
33.4948.26
±
4.19对比例4265.67
±
30.9542.86
±
3.74pbs缓冲液156.39
±
20.6417.86
±
4.42
53.根据现有技术已知，皮肤中的胶原类型以i型胶原和iii型胶原为主，iii型胶原属于重建型胶原，在瘢痕修复过程中，较多iii型胶原的表达，可以促进瘢痕的修复。通过表2可以看出，实施例1-4所制备的干细胞外泌体能更好的促进胶原的分泌，更适用于进行皮肤修复。
54.实施例5
55.一种用于皮肤修复的干细胞外泌体制剂，包括基础添加剂和实施例1制备的作为活性成分的干细胞外泌体，干细胞外泌体以蛋白质质量计的质量百分比用量为0.0095％；按重量百分比计，基础添加剂包括0.6％海茴香提取物、0.15％神经酰胺、0.2％虾青素、2％枸杞多糖、0.6％维生素e、0.8％卡波姆和余量的水。
56.实施例6
57.在上述实施例5的基础上，干细胞外泌体为实施例2制备的外泌体。
58.实施例7
59.在上述实施例5的基础上，干细胞外泌体为实施例3制备的外泌体。
60.实施例8
61.在上述实施例5的基础上，干细胞外泌体为实施例4制备的外泌体。
62.对比例5
63.在上述实施例5的基础上，干细胞外泌体为对比例1制备的外泌体。
64.对比例6
65.在上述实施例5的基础上，干细胞外泌体为对比例1制备的外泌体。
66.对比例7
67.在上述实施例5的基础上，干细胞外泌体为对比例1制备的外泌体。
68.对比例8
69.在上述实施例5的基础上，干细胞外泌体为对比例1制备的外泌体。
70.创伤修复实验
71.取4月龄wistar雄性大鼠，购自医科大学实验动物中心。实验前1周实验室喂养，实验当天禁食，3％戊巴比妥钠30mg/kg腹腔内注射麻醉，大鼠背部剃毛，面积7cm
×
6cm，然后用特制致伤器打孔器在背中部脊柱两侧旁开1cm，共切割4个圆形溃疡，直径1.8cm，深至皮下，止血。待实验动物麻醉苏醒后，于原环境下继续饲养。动态观察每只动物的生活及伤口情况，待术后28天创面完全上皮化，形成增生性瘢痕为造模成功。
72.将45只精神状态良好的试验大鼠，随机分成9组，每组5只，分别为实验组1-4、对照组1-4和空白组。给药方法为：将实施例5-8及对比例5-8得到的制剂分别在相应组别实验动物创伤部位涂抹，每天3次，涂抹后轻柔至完全吸收。60天后观察皮肤的恢复状态。
73.结果显示使用实施例1-4制备的外泌体制成的制剂皮肤恢复效果是最好的，有淡淡的瘢痕印记，但瘢痕不明显，尤其是使用了实施例5的制剂，瘢痕最淡。而其他的对比例则瘢痕相对比较明显，尤其是对比例5制备的制剂效果最差，瘢痕格外明显。
74.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。