一种转铁蛋白修饰的具有主动靶向功能的紫杉醇薏苡仁油纳米微乳的制备方法

1.本发明属于中药技术领域，具体涉及一种转铁蛋白修饰的具有主动靶向功能的紫杉醇薏苡仁油纳米微乳的制备方法。


背景技术：

2.紫杉醇为白色结晶体粉末，无臭，无味，难溶于水，易溶于甲醇、乙腈、氯仿、丙酮等有机溶剂。是目前已发现的最优秀的天然抗癌药物，在临床上已经广泛用于乳腺癌、卵巢癌和部分头颈癌和肺癌的治疗。
3.但是紫杉醇在水中的溶解度较低，溶解度在10.8μg/ml左右，口服难以被吸收，绝对生物利用度较低，约为2％，同时具有一定的毒性，限制了紫杉醇在临床中的应用。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明提供了一种转铁蛋白修饰的具有主动靶向功能的紫杉醇薏苡仁油纳米微乳的制备方法，此种方法可提高难溶性药物紫杉醇的溶解度，且所制得的载药微乳具有类球形结构、粒径分布较小，且该制备方法简单、操作简便、成本低廉、省时高效、易于规模化生产。
5.本发明采取的技术方案如下：
6.一种转铁蛋白修饰的具有主动靶向功能的紫杉醇薏苡仁油纳米微乳的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
7.(1)将薏苡仁油、助乳化剂、乳化剂和紫杉醇混合，40～45℃搅拌混合4～6h，得到初乳；
8.(2)在同样温度和搅拌条件下，使用去离子水对初乳进行滴定，缓慢滴加去离子水至凝胶区，凝胶区后可快速滴加去离子水至体系透明澄清，得到紫杉醇薏苡仁油纳米微乳；
9.(3)将紫杉醇薏苡仁油纳米微乳与edc、nhs、转铁蛋白、去离子水混合进行孵育，即可得到转铁蛋白修饰的具有主动靶向功能的紫杉醇薏苡仁油纳米微乳。
10.所述助乳化剂为peg 400，peg 400(聚乙二醇400)是一种安全、无毒、亲水、稳定的聚合物，是很好的溶剂和增溶剂，在体内能溶于组织液中，能在体内迅速代谢排出体外而不产生毒副作用。
11.所述乳化剂为hs 15，hs 15为非离子型增溶剂和乳化剂，由15mol环氧乙烷和1mol 12-羟基硬脂酸反应制得的15-羟基硬脂酸聚乙二醇酯，其对多种难溶性药物都具有强大的增溶能力。
12.所述紫杉醇与薏苡仁油的质量比为1：20～40。薏苡仁油具有抗肿瘤、镇痛消炎、抗病毒等作用，以其作为紫杉醇纳米微乳制备的油相，可与紫杉醇抗肿瘤活性成分达到协同作用。
13.所述薏苡仁油的质量与助乳化剂、乳化剂质量之和的比值为1：1.5～3.0。
14.所述助乳化剂、乳化剂的质量之比为1：3。
15.所述搅拌的速度为600rpm～800rpm。
16.步骤(3)中，所述紫杉醇薏苡仁油纳米微乳、edc、nhs、转铁蛋白、去离子水的用量比为1ml:0.5-1.0mg:0.2-0.6mg:0.3-0.8mg:3-5ml。
17.步骤(3)中，所述孵育的条件为35-38℃孵育7.5-8.5h。
18.本发明还提供了所述制备方法制备得到的转铁蛋白修饰的具有主动靶向功能的紫杉醇薏苡仁油纳米微乳，其微观形貌为类球形结构、粒径为30～35nm。
19.本发明提供的转铁蛋白修饰的具有主动靶向功能的紫杉醇薏苡仁油纳米微乳的制备方法中，采用hs 15与peg 400共同作为载体，通过控制各个原料的用量配比与去离子水滴定初乳的程度，采用机械搅拌的方法稳定的制备得到了基于hs 15的紫杉醇纳米微乳，再将其经转铁蛋白修饰可达到主动靶向肿瘤部位的作用。此种方法可提高难溶性药物紫杉醇的溶解度，多种肿瘤细胞包括宫颈癌细胞表面都具有转铁蛋白受体过表达现象，本发明采用经典化学缩合法，在偶联剂edc/nhs作用下，将转铁蛋白修饰在紫杉醇薏苡仁油微乳的表面，可提高紫杉醇薏苡仁油微乳的主动靶向能力，从而提高其抗肿瘤的疗效。
附图说明
20.图1为实施例1中制备的转铁蛋白修饰的紫杉醇薏苡仁油微乳的成品图；
21.图2为对比例1中制备的转铁蛋白修饰的紫杉醇薏苡仁油非成乳成品图；
22.图3为实施例1中制备的转铁蛋白修饰的紫杉醇薏苡仁油微乳的tem图；
23.图4为实施例1中制备的转铁蛋白修饰的紫杉醇薏苡仁油微乳的体外累积释放曲线；
24.图5为以薏苡仁油为油相，peg 400为助乳化剂，tween 80(a)、rh 40(b)hs 15(c)分别作为乳化剂得到的伪三元相图，其中m为微乳区、g为凝胶区；
25.图6为以薏苡仁油为油相、hs 15为乳化剂，以peg 400(a)、丙二醇(b)为助乳化剂得到的伪三元相图，其中m为微乳区、g为凝胶区；
26.图7为以薏苡仁油为油相、hs 15为乳化剂、peg 400为助乳化剂，乳化剂与助乳化剂的质量比分别为1:1(a)、2:1(b)、3:1(c)得到的伪三元相图，其中m为微乳区、g为凝胶区。
具体实施方式
27.下面结合实施例对本发明进行详细说明。
28.实施例1
29.一种具有抗肿瘤活性的紫杉醇纳米微乳的制备方法，包括以下步骤：
30.(1)称取400mg薏苡仁油、150mg peg 400、450mg hs 15、20mg紫杉醇，加入西林瓶中，恒温42℃进行磁力搅拌4h，涡轮混匀使药物充分溶解；
31.(2)在42℃恒温磁力搅拌下，使用去离子水进行滴定，边滴定边观察进凝胶区和出凝胶区状态，缓慢滴加去离子水至凝胶区，凝胶区后可快速滴加去离子水至10ml，此时得到透明澄清的紫杉醇薏苡仁油纳米微乳；
32.(3)取紫杉醇薏苡仁油微乳1ml，精密称取0.70mg edc、0.40mg nhs、0.50mg转铁蛋白，加去离子水定容至5ml，37℃孵育8h，即得转铁蛋白修饰的紫杉醇薏苡仁油微乳，测得其
平均粒径为30.39
±
1.28nm，包封率为76.29％。
33.实施例2
34.一种具有抗肿瘤活性的紫杉醇纳米微乳的制备方法，包括以下步骤：
35.(1)称取400mg薏苡仁油、150mg peg 400、450mg hs 15、15mg紫杉醇，加入西林瓶中，恒温42℃进行磁力搅拌4h，涡轮混匀使药物充分溶解；
36.(2)在42℃恒温磁力搅拌下，使用去离子水进行滴定，边滴定边观察进凝胶区和出凝胶区状态，缓慢滴加去离子水至凝胶区，凝胶区后可快速滴加去离子水至10ml，此时得到透明澄清的紫杉醇薏苡仁油纳米微乳；
37.(3)取紫杉醇薏苡仁油纳米微乳1ml，精密称取0.70mg edc、0.40mg nhs、0.50mg转铁蛋白，加去离子水定容至5ml，37℃孵育8h，即得转铁蛋白修饰的紫杉醇薏苡仁油微乳。测得其平均粒径为32.60
±
0.76nm，包封率为88.83％。
38.实施例3
39.一种具有抗肿瘤活性的紫杉醇纳米微乳的制备方法，包括以下步骤：
40.(1)称取400mg薏苡仁油、150mg peg 400、450mg hs 15、10mg紫杉醇，加入西林瓶中，恒温42℃进行磁力搅拌4h，涡轮混匀使药物充分溶解；
41.(2)在42℃恒温磁力搅拌下，使用去离子水进行滴定，边滴定边观察进凝胶区和出凝胶区状态，缓慢滴加去离子水至凝胶区，凝胶区后可快速滴加去离子水至10ml，此时得到透明澄清的紫杉醇薏苡仁油纳米微乳；
42.(4)取紫杉醇薏苡仁油纳米微乳1ml，精密称取0.70mg edc、0.40mg nhs、0.50mg转铁蛋白，加去离子水定容至5ml，37℃孵育8h，即得转铁蛋白修饰的紫杉醇薏苡仁油微乳。测得其平均粒径为30.28
±
0.36nm，包封率为98.80％。
43.对比例1
44.其他同实施例1，只是在步骤(2)中，直接向初乳中加入去离子水至10ml，然后搅拌30min。
45.此对比例在制备紫杉醇薏苡仁油纳米微乳的过程中没有经过相变点，结果制备得到的紫杉醇薏苡仁油纳米微乳呈乳白色，无法制备得到透明澄清的紫杉醇薏苡仁油纳米微乳，最终准备得到的转铁蛋白修饰的紫杉醇薏苡仁油微乳也是呈浑浊的乳白色，无法制备得到到透明澄清的微乳样品。
46.制备条件的筛选：
47.以薏苡仁油为油相，peg 400为助乳化剂，tween 80、rh 40及hs 15作为乳化剂，以1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2及9:1为质量比，即薏苡仁油与混合乳化剂的比例，磁力搅拌混合均匀后，加水制备得到微乳，观察微乳体系进出凝胶区及微乳区的水量，绘制出伪三元相图结果如图5所示，从图中可以看出，不同助乳化剂组微乳区的面积变化为hs 15﹥rh 40﹥tween80，因此本发明选定hs 15为该微乳处方的乳化剂。
48.以薏苡仁油为油相、hs 15为乳化剂，分别以peg 400以及丙二醇为助乳化剂，以1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2及9:1为质量比，即薏苡仁油与混合乳化剂的比例，磁力搅拌混合均匀后，加水滴定制备得到微乳，观察微乳体系进出凝胶区及微乳区的水量，绘制出伪三元相图，结果如图6所示。从图中可以看出，不同助乳化剂组微乳区的面积变化为：peg 400﹥丙二醇，因此本发明选定peg 400为该微乳处方的助乳化剂。
49.以薏苡仁油为油相、hs 15为乳化剂、peg 400为助乳化剂，乳化剂与助乳化剂质量比分别为1:1、2:1、3:1，加水滴定制备得到微乳，观察微乳体系进出凝胶区及微乳区的水量，绘制出伪三元相图，结果如图7所示。从图中可以看出，不同质量比的乳化剂与助乳化剂的微乳区的面积变化为：3:1﹥1:1﹥2:1，因此本发明选定hs 15与peg 400的质量比为3:1。
50.转铁蛋白修饰的具有主动靶向功能的紫杉醇薏苡仁油纳米微乳的缓释效果的验证：
51.称取实施例1制备的转铁蛋白修饰的具有主动靶向功能的紫杉醇薏苡仁油纳米微乳1ml装入透析袋(10k mwco)中，置于10ml pbs溶液中进行体外溶出度试验。用hplc测定溶出液中紫杉醇的浓度，根据一段时间内转铁蛋白修饰的具有主动靶向功能的紫杉醇薏苡仁油纳米微乳的释放量绘制溶出度曲线，结果如图3所示，从图中可以看出本发明制备的转铁蛋白修饰的具有主动靶向功能的紫杉醇薏苡仁油纳米微乳具有明显的缓释效果。
52.上述参照实施例对一种转铁蛋白修饰的具有主动靶向功能的紫杉醇薏苡仁油纳米微乳的制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。