一种活性高重金属含量低的灵芝超微粉及其制作方法与流程

(cn201410157714.3)，该专利没有明确具体的超微粉设备，灵芝超微粉碎时进料速度为0.006～0.07g/s，即每小时的进料速度为0.36～4.2g，这样的产能无法进行产业化。使用球磨机、振动磨或搅伴磨等均为一次性投料，长时间加工后，统一出料，没有办法进行连续生产，生产效率低，长时间的加工设备自身的碰撞均易造成灵芝超微粉中的铬、镍含量超标。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服常规灵芝超微粉的生产效率低，铬、镍等有害重金属含量超标等的缺陷，提供一种能提高效率、克服有害重金属污染和活性高重金属含量低的灵芝超微粉及其制作方法。
7.本发明采用的技术方案为一种活性高重金属含量低的灵芝超微粉，其特征是，它是以有机灵芝子实体为原料，用液氮将待粉碎的灵芝粗颗粒进行超低温冷冻，再用超低温冷冻设备进行粉碎制备而成，制备的灵芝超微粉的粒径分布d
90
≤25μm，超微粉中多糖含量≥2.5％，三萜含量≥1.2％，灵芝超微粉中的铬≤2mg/kg、镍≤1mg/kg，灵芝超微粉具有对kb，hela和4t1肿瘤细胞增殖的抑制能力，对这三种肿瘤细胞增殖的半抑制浓度ic
50
均小于0.3mg/ml。
8.本发明通过液氮将待粉碎的灵芝粗颗粒进行超低温冷冻，增加灵芝粗颗粒脆性，从而使粉碎变得容易，缩短粉碎时间，提高效率，减少因设备磨损，而导致产品受铬、镍等重金属的污染，有利于提高产品质量。
9.一种制作上述活性高重金属含量低灵芝超微粉的制备方法，其具体步骤如下：a)将灵芝子实体干燥，水分≤6％，然后用粗粉碎机粉碎成可通过10目筛的粗颗粒；b)将灵芝粗颗粒置于超低温冷冻粉碎设备的预冷冻室中，通入液氮，将温度降低至-100℃～-150℃；c)达到设定温度后，启动超低温冷冻粉碎机，使灵芝超微粉的粒径分布d
90
≤25μm。
10.本发明先用粗粉碎机粉碎将灵芝破碎成10目的粗颗粒，便于超低低温冷冻设备进料，同时能使后续的低温冷冻速度快、均匀。当将灵芝粗颗粒的温度降低至-100℃时，其脆性增加，使灵芝粗颗粒脆化，容易粉碎。可通过调节液氮冷冻温度、粉碎电机转速和进料速度等控制灵芝超微粉的粒径大小。
11.超低温冷冻粉碎设备与灵芝直接接触的部位均为符合食品安全标准的不锈钢材质，其中刀盘和粉碎刀片为高耐磨不锈钢。
12.所述的将灵芝子实体干燥，是指通过烘箱烘干或晒干。
13.在本发明中，所使用的灵芝为有机灵芝，使用的液氮应符合《国家食品安全标准食品添加剂液氮》(gb 29202-2012)的标准规定。
14.本发明制备的灵芝超微粉的使用方法：可以直接服用，用温水冲服，每天2～4g，也可以辅以辅料制备成硬胶囊、软胶囊、粉剂、片剂等产品。
15.本发明与传统技术相比，具有以下优点和有益效果：1.本发明采用液氮超低温冷冻技术，在-100℃下，灵芝颗粒脆化，易于粉碎，粉碎时间短，效率高，可以产业化连续进行生产。如采用bcf-450型超低温冷冻粉碎机，每小时的产能可达100～150kg，其产能是采用振动磨(wzj100b型)的20～30倍，这两种型号的设备价
格相近，均为30万左右。
16.2.由于灵芝物料与粉碎设备的接触时间短，设备磨损少，不会造成铬、镍重金属的含量超标，灵芝超微粉中铬(cr)≤2mg/kg、镍(ni)≤1mg/kg。
17.3.由于是在超低温的条件进行粉碎，而且粉碎时间短，灵芝多糖、灵芝三萜等有效活性成分不会有损失，所制备的灵芝超微粉中灵芝多糖、灵芝三萜的含量高，灵芝多糖≥2.5％、三萜含量≥1.2％；常规灵芝细粉多糖含量≥1.2％，三萜含量≥0.8％。
18.4.粉碎工艺流程简单，将灵芝粉碎成10目的粗颗粒，即可直接用超低温冷冻粉碎机进行粉碎。可通过调节液氮冷冻温度和进料速度控制灵芝超微粉的粒径大小，所制备灵芝超微粉的粒径可以达到d
90
≤25μm。
19.5.本发明通过药理实验证明灵芝超微粉具有对kb，hela和4t1肿瘤细胞增殖的抑制能力，对这三种肿瘤细胞增殖的半抑制浓度ic
50
均小于0.3mg/ml。并且抑制能力优于灵芝水提取物和灵芝醇提取物(提取物折算成生药量计)。
具体实施方式
20.以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明的精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备，均来自市售产品。本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域技术人员所知晓的常规方法。
21.灵芝超微粉对肿瘤细胞增殖的抑制作用的检测方法为mtt法，以半抑制浓度ic
50
为标准，ic
50
是指在用药后存活的细胞数量减少一半时所需的药物浓度。在mtt法中，就是以对照组吸光度od值减少一半所需的药物浓度为ic
50
。
22.实施例11、取有机灵芝子实体4.5kg，烘干至水分低于6％，用tdp-500型破碎机粉碎成10目的粗颗粒。
23.2、将粗颗粒置于wzj100b型振动式药物超微粉碎机中，粉碎45min，制得灵芝超微粉(样品ⅰ)。
24.实施例21、取有机灵芝子实体4.5kg，烘干或晒干至水分低于6％，用tdp-500型破碎机粉碎成10目的粗颗粒。
25.2、将灵芝粗颗粒置于bcf-450型超低温冷冻粉碎机的预冷冻室中，注入食品级的液氮，设定温度为-100℃。超低温冷冻粉碎设备与灵芝直接接触的部位均为符合食品安全标准的不锈钢材质，其中刀盘和粉碎刀片为高耐磨不锈钢。
26.3、达到设定温度后，启动粉碎机，通过螺旋加料器将灵芝推进入粉碎室中，通过叶轮高速旋转，物料与粉碎刀片、刀盘，物料与物料之间的反复冲击，碰撞，剪切，摩擦等综合作用下，达到粉碎效果。调节螺旋加料器速度(7.5hz)、调节粉碎机主机转速(50hz)，粉碎时间约为2min(仅为实施例1的1/22.5，时间大为缩短)。
27.4、灵芝被粉碎后，由粉碎机自身产生的气流和引风机抽风的作用，将粉碎后的超微粉带入旋风分离器内收集下来，通过螺旋出料器将灵芝超微粉排出，制得灵芝超微粉(样品ⅱ)。
28.实施例31、取有机灵芝子实体4.5kg，烘干至水分低于6％，用tdp-500型破碎机粉碎成10目的粗颗粒。
29.2、将灵芝粗颗粒置于bcf-450型超低温冷冻粉碎机的预冷冻室中，注入食品级的液氮，设定温度为-136℃。
30.3、达到设定温度后，启动粉碎机，通过螺旋加料器将灵芝推进入粉碎室中，通过叶轮高速旋转，物料与粉碎刀片、刀盘，物料与物料之间的反复冲击，碰撞，剪切，摩擦等综合作用下，达到粉碎效果。调节螺旋加料器速度(7.5hz)、调节粉碎机主机转速(50hz)，粉碎时间约为2min。
31.4、灵芝被粉碎后，由粉碎机自身产生的气流和引风机抽风的作用，将粉碎后的超微粉带入旋风分离器内收集下来，通过螺旋出料器将灵芝超微粉排出，制得灵芝超微粉(样品ⅲ)。
32.实施例41、取有机灵芝子实体4.5kg，烘干至水分低于6％，用tdp-500型破碎机粉碎成10目的粗颗粒。
33.2、将灵芝粗颗粒置于bcf-450型超低温冷冻粉碎机的预冷冻室中，注入食品级的液氮，设定温度为-145℃。
34.3、达到设定温度后，启动粉碎机，通过螺旋加料器将灵芝推进入粉碎室中，通过叶轮高速旋转，物料与粉碎刀片、刀盘，物料与物料之间的反复冲击，碰撞，剪切，摩擦等综合作用下，达到粉碎效果。调节螺旋加料器速度(7.5hz)、调节粉碎机主机转速(50hz)，粉碎时间约为2min。
35.4、灵芝被粉碎后，由粉碎机自身产生的气流和引风机抽风的作用，将粉碎后的超微粉带入旋风分离器内收集下来，通过螺旋出料器将灵芝超微粉排出，制得灵芝超微粉(样品ⅳ)。
36.实施例5将有机灵芝子实体粉碎成10目粗颗粒，加12倍水浸泡30min，加热保持微沸2h，100目筛网过滤，滤渣中再加入10倍水，加热保持微沸2h，100目筛网过滤，合并两次滤液，减压浓缩，喷雾干燥制得灵芝水提取物粉(样品
ⅴ
)。
37.实施例6将有机灵芝子实体粉碎成10目粗颗粒，加10倍70％乙醇浸泡30min，加热保持微沸2h，100目筛网过滤，滤渣中再加入8倍70％乙醇，加热保持微沸，加热保持微沸2h，100目筛网过滤，合并两次滤液，减压浓缩，微波干燥制得灵芝醇提取物粉(样品ⅵ)。
38.对上述的得物进行检测实施例1、2、3及4的灵芝超微粉和实施例5、6的灵芝水提取物和灵芝醇提取物，取样，用激光粒度分布仪测定粒度分布(细度)，按《中国药典》(2020年一部)灵芝项下灵芝多糖、三萜及甾醇的检测方法，检测样品中灵芝多糖、三萜含量；按《食品安全国家标准食品中铬的测定》(gb 5009.123-2014)检测样品中重金属铬、镍的含量。检测结果见表1表1灵芝超微粉细度，灵芝多糖、三萜及甾醇和铬、镍的含量
注：样品
ⅴ
、样品ⅵ分别为水提取物、醇提取物，其有效成分的溶出与细度没有直接的关系，故未测定细度；样品
ⅴ
为灵芝水提取物，多糖含量比较高，三萜为脂溶性成分在水提取物中含量低，未测定，样品ⅵ为醇提取物，三萜含量比较高，多糖为水溶性成分在醇提取物中含量低，未测定。灵芝水提取物中的铬、镍相对于醇提取物，会偏高，因为铬、镍在水提取过程中更容易被提取出来，并且进行了浓缩。
39.从表1的检测结果可以看出，采用wzj100b型常规的振动式药物超微粉碎机和采用bcf-450型超低温冷冻粉碎机，粉碎的灵芝超微粉的细度、多糖和三萜含量比较接近。但是，常规的振动式的超微粉中铬的含量96.36(mg/kg)、镍的含量42.41(mg/kg)，而超低温冷冻式的超微粉中铬的3次平均含量0.70(mg/kg)、镍的含量0.35(mg/kg),前者分别是后者的138倍和121倍，它的铬、镍的含量已远远超出国家有关标准(铬≤2.0mg/kg、镍≤1.0mg/kg)的限量规定。
40.温度越低，样品越细，灵芝多糖含量越高。
41.实施例1、2、3、4、5、6所得的灵芝超微粉的样品ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、灵芝提取物
ⅴ
、ⅵ，取样，使用mtt法检测对肿瘤细胞增殖的抑制能力。
42.实验材料：灵芝超微粉样品ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ，灵芝醇提取物ⅵ分别用dmso溶解，离心，取上清，制备成不同浓度的dmso溶液；灵芝水提取物
ⅴ
用生理盐水溶解，离心，取上清，制备成不同浓度的水溶液。
43.实验方法：取对数生长期的人口腔上皮癌细胞(kb)，人宫颈癌癌细胞(hela)，小鼠乳腺癌细胞(4t1)以2000～4000个/孔的细胞数接种于96孔板中，每孔180μl细胞液，置于37℃5％co2饱和湿度培养箱中培养过夜，细胞完全贴壁后，加入20μl不同浓度上述实验材料，每个浓度3个复孔，放培养箱继续培养72h；药物作用72h后，每孔加入20μl 5mg/ml的mtt，继续培养4h；弃去培养基，加入150μl dmso，室温震荡10min，待结晶完全溶解，用酶标仪570nm波长测定od值，计算出各组分对细胞的ic
50
。结果见表2表2灵芝超微粉、灵芝水和醇提取物对不同癌细胞的半抑制浓度ic
50
(mg生药/ml)
注因灵芝超微粉为生药，灵芝提取物根据提取率折算成生药量进行对比，灵芝水提取物(
ⅴ
)的提取率为5.93％，灵芝醇提取物(ⅵ)的提取率为5.26％。
44.结论：灵芝超微粉ⅰ对kb细胞的半抑制浓度ic
50
为0.375mg/ml，灵芝超微粉(ⅱ、ⅲ、ⅳ)对kb细胞的半抑制浓度ic
50
平均为0.260(mg/ml)，而灵芝水提取物ic
50
为12.058(mg/ml)、醇提取物ic
50
为2.650(mg/ml),其ic
50
值分别比水提取物和醇提取物分别小了46倍和10倍。由于ic
50
数值越小，表明其对kb肿瘤细胞增殖的抑制能力越强，抗肿瘤的活性越高。同理可见，灵芝超微粉对hela细胞、对4t1细胞的增殖抑制能力，和抗肿瘤活性，都强于灵芝水提取物和灵芝醇提取物(折算成生药量计)。
45.总结实施例1-6和mtt实验结果显示：使用液氮超低温冷冻粉碎灵芝，粉碎效率高，可产业化连续生产，灵芝超微粉中的铬、镍含量低，符合国标的规定(铬≤2mg/kg、镍≤1mg/kg)，克服了有害重金属的危害。灵芝超微粉对人口腔上皮癌细胞(kb)、人宫颈癌癌细胞(hela)、小鼠乳腺癌细胞(4t1)增殖的抑制力，其抗肿瘤的活性都优于灵芝水提取物和灵芝醇提取物。灵芝超微粉达到一定的细度后，抗肿瘤活性增强，不单是灵芝多糖和灵芝三萜起作用，可能是达到一定的细度后，灵芝中的有效成分容易被释放出来，是灵芝中的多种成分综合起作用。
46.样品ⅱ、样品ⅲ、样品ⅳ为一种活性高重金属含量低的灵芝超微粉，它的粒径分布d
90
≤25μm，超微粉中多糖含量≥2.5％，三萜含量≥1.2％，灵芝超微粉中的铬(cr)≤2mg/kg、镍(ni)≤1mg/kg，灵芝超微粉具有对kb，hela和4t1肿瘤细胞增殖的抑制能力，对这三种肿瘤细胞增殖的半抑制浓度ic
50
均小于0.3mg/ml。