一种基于大米蛋白酶解物的复合纳米粒子及其制备方法和应用

1.本发明属于功能性食品生产工艺技术领域，更具体地，涉及一种基于大米蛋白酶解物的复合纳米粒子及其制备方法和应用。


背景技术：

2.纳米输送体系是采用机械或化学方法制备、平均粒径10-1000nm的药物或功能因子输送体系，可实现保护、缓释和靶向输送小分子药物或功能因子的作用。
3.通过纳米输送体系构建复合纳米粒子是食品和医药行业中输送物质的一种手段，纳米输送体系可提高生物活性分子在加工、运输和贮藏过程中的稳定性，保护生物活性分子免受胃肠道环境的破坏，提高其生物利用度。用于制备纳米输送体系的材料有很多，人们倾向于使用天然来源的材料。蛋白质纳米输送载体是基于蛋白质与难溶性功能因子之间的疏水相互作用，蛋白质多肽链中的疏水性区域可作为难溶性功能因子的结合位点。蛋白质纳米输送体系具有资源丰富、递送能力强、降解性强的优势，可作为输送疏水性黄酮的纳米输送载体。
4.大米蛋白具有优良营养品质，是公认的谷类蛋白中的优质植物蛋白，拥有丰富的必需氨基酸、合理的氨基酸配比和极低的致敏性。但是大米蛋白含80％以上的碱溶性谷蛋白，导致其溶解性差、利用率低。酶解处理可以改善蛋白的结构和功能特性，使蛋白拥有较强的反应活性，更易与生物小分子或者天然高分子进行非共价结合。在有限酶解精确控制水解度的条件下，溶解度显著改善的大米蛋白酶解物有望具备良好的两亲性与自组装特性，是一种有希望的纳米输送载体。
5.黄酮是广泛存在于自然界的植物次生代谢产物，具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒抗菌等多种生理活性，在预防心脑血管疾病、延缓衰老等方面有着重要意义；但黄酮由于两个苯环分别与羰基共轭形成交叉共轭体系，具共平面性，分子间紧密，引力大，导致黄酮难溶于水，生物利用度不到10％，极大地限制了黄酮类化合物的应用和潜在健康效应的发挥。
6.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

7.针对现有技术所存在的不足，本发明提供了一种基于大米蛋白酶解物的复合纳米粒子及其制备方法和应用。
8.为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
9.一种基于大米蛋白酶解物的复合纳米粒子，包括载体和负载在所述载体上的黄酮类化合物，所述载体为大米蛋白酶解物，所述基于大米蛋白酶解物的复合纳米粒子的粒径为40-200nm。
10.在上述技术方案中，所述大米蛋白酶解物与所述黄酮类化合物的质量比为5-40∶1。
11.优选地，在上述技术方案中，所述大米蛋白酶解物与所述黄酮类化合物的质量比为8-12.5∶1。
12.在上述技术方案中，所述黄酮类化合物为以c6-c3-c6为基本碳架的化合物，具体为黄芩素、槲皮素、白杨素、大豆苷元中的至少一种。
13.进一步地，在上述技术方案中，所述大米蛋白酶解物的水解度为3-12％。
14.优选地，在上述技术方案中，所述大米蛋白酶解物为大米蛋白粉经胰蛋白酶酶解后的产物。
15.又进一步地，在上述技术方案中，所述大米蛋白酶解物采用如下方法制备：
16.将大米蛋白粉均匀分散于去离子水中，室温水化后，调节ph至碱性后置于40-60℃的水浴中保温10-20min，加入质量为大米蛋白粉质量的0.005-0.015倍的胰蛋白酶酶解，酶解过程控制ph恒定不变，通过控制酶解时间得到水解度为3-12％的大米蛋白酶解物，酶解结束后通过加热钝化胰蛋白酶并冷却至室温，调节ph至中性后离心，取上清液即得。
17.本发明另一方面还提供了上述基于大米蛋白酶解物的复合纳米粒子的制备方法，包括：
18.将黄酮类化合物的醇类溶液滴加到均匀透明的大米蛋白酶解物的水溶液中，调节混合溶液的ph≥7.0，在35-50℃下搅拌均匀，旋蒸去除醇类溶剂后即得。
19.在上述技术方案中，所述黄酮类化合物的醇类溶液的浓度为0.8-1.5mg/ml。
20.在上述技术方案中，所述大米蛋白酶解物的水溶液的浓度为0.6-1.8mg/ml。
21.在上述技术方案中，所述黄酮类化合物的醇类溶液的滴加速度为0.5-1.2ml/min。
22.在上述技术方案中，所述混合溶液的ph调节为7.0-11.0。
23.在上述技术方案中，所述搅拌的时间为45-90min。
24.本发明又一方面还提供了上述基于大米蛋白酶解物的复合纳米粒子或上述基于大米蛋白酶解物的复合纳米粒子的制备方法在制备食品、药品、保健品和化妆品中的应用。
25.本发明与现有技术相比，具有以下优点：
26.(1)本发明通过反溶剂法利用大米蛋白酶解物作为纳米输送载体，包埋黄酮类化合物，制备的大米蛋白酶解物-黄酮复合纳米粒子包封率高，稳定性好，有效提高了黄酮的溶解度和生物利用度；
27.(2)本发明利用酶解的方式，改善大米蛋白的溶解性，扩大了大米蛋白的应用范围，提高大米加工副产物的利用率；
28.(3)本发明操作简单易行，对设备没有特殊要求。制备原料是天然生物分子，可降解，廉价易得。使用的试剂对人体无毒，对环境友好，制备的基于大米蛋白酶解物的复合纳米粒子应用广泛。
附图说明
29.图1为黄芩素、所制备的大米蛋白酶解物和实施例4所制备的大米蛋白酶解物-黄芩素复合纳米粒子的ftir图谱；
30.图2为黄芩素、所制备的大米蛋白酶解物和实施例4所制备的大米蛋白酶解物-黄芩素复合纳米粒子的xrd图谱。
具体实施方式
31.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
32.应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
33.实施例中，如无特别说明，所用手段均为本领域常规的手段。
34.本文中所用的术语“包含”、“包括”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
35.此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
36.本发明实施例所用的黄酮类均为市售产品。
37.本发明实施例所用的大米蛋白酶解物采用如下方法制备：
38.将大米蛋白粉均匀分散于(1g/15ml)去离子水中，室温搅拌水化3h后，调节ph至8，置于50℃的水浴中保温15min，加入质量为大米蛋白粉质量的0.01倍的胰蛋白酶酶解，酶解过程控制ph为8恒定不变，通过控制酶解时间得到水解度为3-12％的大米蛋白酶解物，酶解结束后通过置于95℃的水浴中加热15min钝化胰蛋白酶，随后冷却至室温，调节ph至中性后在3000rpm下离心10min，取上清液即得大米蛋白酶解物。
39.具体地，蛋白质水解物的水解度(dh)采用ph-stat法测定，其计算公式如下：
40.dh(％)＝(b
×
nb)/(m
p
×htot
×
α)
41.式中：
42.b：以ml为单位的氢氧化钠消耗量；
43.nb：氢氧化钠的浓度；
44.m
p
：蛋白质质量，单位为g/kg；
45.h
tot
：meqv/g蛋白质中的肽键总数，本技术中的大米蛋白质取7.4；
46.α：-nh基团的平均解离度，其中，ph是实验中使用的蛋白酶的最佳ph，pk是氨基酸的解离常数，即取为7。
47.实施例1
48.本发明实施例提供了一种大米蛋白酶解物-黄芩素复合纳米粒子的制备方法，具体包括以下步骤：
49.s1、常温常压下，称取80mg水解度为12％的大米蛋白酶解物，溶于20ml的去离子水中，通过磁力搅拌器搅拌至溶液均匀透明，配制成1mg/ml的大米蛋白酶解物水溶液；
50.s2、称取50mg黄芩素，溶于50ml无水乙醇中，通过磁力搅拌器搅拌至溶液均匀透明，配制成1mg/ml的黄芩素乙醇溶液；
51.s3、采用注射器将2ml黄芩素乙醇溶液以1ml/min的速度加入到20ml大米蛋白酶解物水溶液中，用0.1m的氢氧化钠溶液将其ph调至6.0，于40℃下搅拌60min，旋蒸除去乙醇，定容，制得大米蛋白酶解物-黄芩素复合纳米粒子。
52.实施例2
53.本发明实施例提供了一种大米蛋白酶解物-黄芩素复合纳米粒子的制备方法，具
体包括以下步骤：
54.s1、常温常压下，称取80mg水解度为12％的大米蛋白酶解物，溶于20ml的去离子水中，通过磁力搅拌器搅拌至溶液均匀透明，配制成1mg/ml的大米蛋白酶解物水溶液；
55.s2、称取50mg黄芩素，溶于50ml无水乙醇中，通过磁力搅拌器搅拌至溶液均匀透明，配制成1mg/ml的黄芩素乙醇溶液；
56.s3、采用注射器将2ml黄芩素乙醇溶液以1ml/min的速度加入到20ml大米蛋白酶解物水溶液中，用0.1m的氢氧化钠溶液将其ph调至7.0，于40℃下搅拌60min，旋蒸除去乙醇，定容，制得大米蛋白酶解物-黄芩素复合纳米粒子。
57.实施例3
58.本发明实施例提供了一种大米蛋白酶解物-黄芩素复合纳米粒子的制备方法，具体包括以下步骤：
59.s1、常温常压下，称取80mg水解度为12％的大米蛋白酶解物，溶于20ml的去离子水中，通过磁力搅拌器搅拌至溶液均匀透明，配制成1mg/ml的大米蛋白酶解物水溶液；
60.s2、称取50mg黄芩素，溶于50ml无水乙醇中，通过磁力搅拌器搅拌至溶液均匀透明，配制成1mg/ml的黄芩素乙醇溶液；
61.s3、采用注射器将2ml黄芩素乙醇溶液以1ml/min的速度加入到20ml大米蛋白酶解物水溶液中，用0.1m的氢氧化钠溶液将其ph调至8.0，于40℃下搅拌60min，旋蒸除去乙醇，定容，制得大米蛋白酶解物-黄芩素复合纳米粒子。
62.实施例4
63.本发明实施例提供了一种大米蛋白酶解物-黄芩素复合纳米粒子的制备方法，具体包括以下步骤：
64.s1、常温常压下，称取80mg水解度为12％的大米蛋白酶解物，溶于20ml的去离子水中，通过磁力搅拌器搅拌至溶液均匀透明，配制成1mg/ml的大米蛋白酶解物水溶液；
65.s2、称取50mg黄芩素，溶于50ml无水乙醇中，通过磁力搅拌器搅拌至溶液均匀透明，配制成1mg/ml的黄芩素乙醇溶液；
66.s3、采用注射器将2ml黄芩素乙醇溶液以1ml/min的速度加入到20ml大米蛋白酶解物水溶液中，用0.1m的氢氧化钠溶液将其ph调至9.0，于40℃下搅拌60min，旋蒸除去乙醇，定容，制得大米蛋白酶解物-黄芩素复合纳米粒子。
67.实施例5
68.本发明实施例提供了一种大米蛋白酶解物-黄芩素复合纳米粒子的制备方法，具体包括以下步骤：
69.s1、常温常压下，称取80mg水解度为12％的大米蛋白酶解物，溶于20ml的去离子水中，通过磁力搅拌器搅拌至溶液均匀透明，配制成1mg/ml的大米蛋白酶解物水溶液；
70.s2、称取50mg黄芩素，溶于50ml无水乙醇中，通过磁力搅拌器搅拌至溶液均匀透明，配制成1mg/ml的黄芩素乙醇溶液；
71.s3、采用注射器将2ml黄芩素乙醇溶液以1ml/min的速度加入到20ml大米蛋白酶解物水溶液中，用0.1m的氢氧化钠溶液将其ph调至10.0，于40℃下搅拌60min，旋蒸除去乙醇，定容，制得大米蛋白酶解物-黄芩素复合纳米粒子。
72.实施例6
73.本发明实施例提供了一种大米蛋白酶解物-白杨素复合纳米粒子的制备方法，具体包括以下步骤：
74.s1、常温常压下，称取80mg水解度为12％的大米蛋白酶解物，溶于20ml的去离子水中，通过磁力搅拌器搅拌至溶液均匀透明，配制成1mg/ml的大米蛋白酶解物水溶液；
75.s2、称取50mg白杨素，溶于50ml无水乙醇中，通过磁力搅拌器搅拌至溶液均匀透明，配制成1mg/ml的白杨素乙醇溶液；
76.s3、采用注射器将2ml白杨素乙醇溶液以1ml/min的速度加入到20ml大米蛋白酶解物水溶液中，用0.1m的氢氧化钠溶液将其ph调至9.0，于40℃下搅拌60min，旋蒸除去乙醇，定容，制得大米蛋白酶解物-白杨素复合纳米粒子。
77.实施例7
78.本发明实施例提供了一种大米蛋白酶解物-槲皮素复合纳米粒子的制备方法，具体包括以下步骤：
79.s1、常温常压下，称取80mg水解度为12％的大米蛋白酶解物，溶于20ml的去离子水中，通过磁力搅拌器搅拌至溶液均匀透明，配制成1mg/ml的大米蛋白酶解物水溶液；
80.s2、称取50mg槲皮素，溶于50ml无水乙醇中，通过磁力搅拌器搅拌至溶液均匀透明，配制成1mg/ml的槲皮素乙醇溶液；
81.s3、采用注射器将2ml槲皮素乙醇溶液以1ml/min的速度加入到20ml大米蛋白酶解物水溶液中，用0.1m的氢氧化钠溶液将其ph调至9.0，于40℃下搅拌60min，旋蒸除去乙醇，定容，制得大米蛋白酶解物-槲皮素复合纳米粒子。
82.分别采用乙酸乙酯萃取法检测实施例1-7所制备的复合纳米粒子的包封率和荷载率，具体过程包括：取1ml复合纳米粒子样品，加入5ml乙酸乙酯，涡旋30s后于3100
×
g下离心5min，以乙酸乙酯为空白对照，测定上清液在260nm处的吸光度值，根据黄酮标准曲线方程计算游离的黄酮含量，包封率(ee)和荷载量(lc))分别按下式计算：
83.ee(％)＝[1-游离黄酮含量(mg)/黄酮总含量(mg)]
×
100％；
[0084]
lc(％)＝[黄酮总含量(mg)-游离黄酮含量(mg)]/总蛋白含量(mg)
×
100％。
[0085]
实施例1-7所制备的复合纳米粒子的粒径和电位采用粒度分析仪进行测定，具体过程包括：将样品稀释适当倍数后，使用激光粒度仪测定粒径和zeta-电位，测定温度为25℃，平衡时间5min。
[0086]
结果如下表1所示。
[0087]
表1复合纳米粒子的包封率、荷载率、粒径和zeta电位检测结果
[0088][0089]
从表1中可以看出，随着ph升高，包封率和荷载率逐渐升高，在ph＝9时，获得最大包封率(93.0％)和荷载量(2.3％)。大米蛋白的主要成分为碱溶性谷蛋白，较高的ph条件可能有利于rph结构的展开，使黄芩素与其结合，从而有利于提高复合纳米粒子的包封率和荷载量。
[0090]
如图1所示为黄芩素、所制备的大米蛋白酶解物和实施例4所制备的大米蛋白酶解物-黄芩素复合纳米粒子的ftir图谱(图中：rph-大米蛋白酶解物；rph-bai nps-大米蛋白酶解物-黄芩素复合纳米粒子；bai-黄芩素)。
[0091]
从图1中可以看出，大米蛋白酶解物和黄芩素分别在3450cm-1
和3430cm-1
处出现宽峰，3100-3500cm-1
范围内的宽带归因于羟基的拉伸振动；复合纳米粒子的羟基峰移至3440cm-1
，表明纳米粒子的形成中有氢键的作用；大米蛋白酶解物在1640cm-1
和1540cm-1
处出现强峰，分别代表酰胺i和酰胺ii谱带；黄芩素在500-1600cm-1
之间发现许多特征吸收峰，归因于苯环的c＝c和c＝o分别为1620cm-1
和1510cm-1
在处有峰，芳族c-o拉伸振动为1340cm-1
，c-o-c拉伸振动为1090cm-1
。黄芩素的许多特征峰在被大米蛋白酶解物荷载后消失了，且大米蛋白酶解物的一些特征峰也消失了，这些结果表明纳米颗粒中黄芩素和大米蛋白酶解物发生了相互作用，改变了黄芩素化学基团的红外吸收特性。
[0092]
如图2所示为黄芩素、所制备的大米蛋白酶解物和实施例4所制备的大米蛋白酶解物-黄芩素复合纳米粒子的xrd图谱。
[0093]
从图2中可以看出，黄芩素在多处具有尖锐特征峰，表明其具有高结晶度；大米蛋白酶解物的图谱为平缓曲线，表明其为无定形状态；当黄芩素被封装到大米蛋白酶解物中后，其特征性尖峰消失，表明黄芩素已成功地被包封在纳米颗粒中，这可能归因于黄芩素和大米蛋白酶解物之间形成无定形复合物，或通过大米蛋白酶解物的封装抑制了黄芩素的晶体结构。
[0094]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。
[0095]
应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围
应以所附权利要求为准。