乐卡地平在制备治疗和/或预防结直肠癌药物中的应用

1.本发明属于生物医药技术领域，特别涉及乐卡地平在制备治疗和/或预防结直肠癌药物中的应用。


背景技术：

2.结直肠癌是最为常见的恶性肿瘤之一，根据2020年全球癌症数据统计报告，其发病率和死亡率分别居世界第三位和第二位，总体生存率很差。结直肠癌因其发病部位处于结直肠，其发展早期十分隐秘，因此患者确诊时往往已经处于中晚期，而且由于结直肠癌的高转移性和高浸润性，晚期结直肠癌治疗难度较大；同时，由于结直肠癌细胞在对化疗药物的耐药性，加剧了结直肠癌治疗的困难。耐药已经成为克服结直肠癌的一个重要关节，逆转耐药和寻找新的抗癌药物成为了目前结直肠癌治疗的两大难题，已经上市使用的药物在药效、机制、安全性和稳定性上较为明确，如果能寻找到具有强效抗癌作用的这类药物的话，将大大降低抗癌药物研发成本并缩短研发周期，增加临床结直肠癌治疗的选择，便于药物快速应用并使患者受益。在此情形下，寻找更稳定、有效、安全的抗结直肠癌药物已成为当务之急。
3.lercanidipine(乐卡地平)是一种亲脂性的第三代二氢吡啶-钙通道阻滞剂(dhp-ccb)，其在高血压治疗中无论是单独使用还是联合使用，都具有较好且持久的降压作用，是用于治疗原发性高血压的一线抗高血压药物；同时，乐卡地平具有较好的耐受性，副作用发生率较低，尤其还表现出优于其他药物的肾脏低毒性。乐卡地平在抗高血压、抗炎症等方面的研究已经十分深入，但迄今为止，关于乐卡地平对结直肠癌的治疗作用尚未见报道，其分子机制也不清楚。


技术实现要素：

4.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供乐卡地平在制备治疗和/或预防结直肠癌药物中的应用。
5.本发明的上述目的通过以下技术方案予以实现：
6.乐卡地平在制备治疗和/或预防结直肠癌药物中的应用。
7.所述的乐卡地平的结构式如式(ⅰ)所示：
[0008][0009]
所述的乐卡地平的有效浓度优选为2～18μm。
[0010]
所述的治疗和/或预防结直肠癌药物优选为能够抑制结直肠癌细胞生长、增殖和/或迁移侵袭的药物。
[0011]
所述的结直肠癌优选为结直肠腺癌和结肠癌中的至少一种。
[0012]
一种用于治疗和/或预防结直肠癌的药物，包括乐卡地平。
[0013]
所述的用于治疗和/或预防结直肠癌的药物还包含药学上可接受的辅料。
[0014]
所述的药学上可接受的辅料优选为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂和润滑剂中的至少一种。
[0015]
所述的用于治疗和/或预防结直肠癌的药物的给药形式优选包括但不限于口服给药。
[0016]
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0017]
本发明的乐卡地平能够有效抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移侵袭和凋亡。经试验发现有效浓度为2～18μm的乐卡地平能够有效抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移侵袭和凋亡。本发明提供了一种新的用于治疗和/或预防结直肠癌的药物，为治疗和/或预防结直肠癌提供了新的治疗药物和策略。
附图说明
[0018]
图1为乐卡地平的结构式图。
[0019]
图2为乐卡地平处理时间和处理浓度对dld-1细胞、ht-29细胞和hct-116细胞的增殖能力影响结果图。
[0020]
图3为不同浓度的乐卡地平对dld-1细胞迁移能力的影响结果图。
[0021]
图4为不同浓度的乐卡地平对ht-29细胞迁移能力的影响结果图。
[0022]
图5为不同浓度的乐卡地平对hct-116细胞迁移能力的影响结果图。
[0023]
图6为不同浓度的乐卡地平对dld-1细胞、ht-29细胞和hct-116细胞迁移能力影响的结晶紫染色结果图。
[0024]
图7为不同浓度的乐卡地平对dld-1细胞、ht-29细胞和hct-116细胞侵袭能力影响的结晶紫染色结果图。
[0025]
图8为不同浓度的乐卡地平对dld-1细胞、ht-29细胞和hct-116细胞凋亡的流式细胞仪检测结果图。
具体实施方式
[0026]
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0027]
实施例1
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(1)实验材料
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人结直肠腺癌上皮细胞(dld-1)、人结肠癌细胞(ht-29)和人结肠癌细胞(hct-116)均购自于atcc；乐卡地平购于selleck chemicals(huston,tx,usa)，结构式如图1所示；cck-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；1640基础培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素、pbs缓冲液(ph7.4)均购自于美国gibco；dmso购自于美国sigma，乐卡地平溶于dmso，以储存浓度10mm保存于-80℃冰箱；annexin v-fitc/pi荧光双染细胞凋亡检测试剂盒购于中国南京凯基生物科技发展有限公司；transwell小室和基质胶购于corning，united states。
[0030]
(2)cck-8实验
[0031]
以每孔50μl/1000个细胞的数量分别接种dld-1细胞、ht-29细胞和hct-116细胞于96孔板中，细胞贴壁后，将10mm乐卡地平用1640完全培养基稀释成含乐卡地平的培养基；其中，含乐卡地平的培养基中乐卡地平的浓度分别为4μm、8μm、12μm、16μm、20μm、24μm、28μm、32μm和36μm，按照不同的浓度梯度每孔加入50μl含乐卡地平的上述培养基，同时以不含乐卡地平的培养基为对照，即得乐卡地平浓度分别为0、2μm、4μm、6μm、8μm、10μm、12μm、14μm、16μm和18μm的细胞处理组。于0、第1天、第2天、第3天、第4天和第5天按照cck-8试剂盒说明书每孔加10μl cck-8试剂到对应孔中，并于37℃、5％co2培养箱中孵育2小时，用酶联免疫检测仪在450nm波长处检测。
[0032]
结果如图2，随着乐卡地平浓度和处理时间的增加，乐卡地平对结直肠癌细胞(dld-1、ht-29、hct-116)的杀伤效果(抑制细胞增殖)显著增加(乐卡地平处理组相较于对照组，存活细胞减少，od450读数显著减小)，表明乐卡地平对dld-1细胞、ht-29细胞和hct-116细胞的杀伤效果具有剂量和时间依赖性(时间越长，乐卡地平药物浓度越高，对结直肠癌细胞杀伤作用越强)。
[0033]
(3)细胞划痕实验
[0034]
取生长状态良好的细胞(dld-1细胞、ht-29细胞和hct-116细胞)，消化计数调整细胞密度，分别接种适量dld-1细胞、ht-29细胞和hct-116细胞于6孔板中(每孔2ml完全培养基)，每组设置3个复孔，并设置对照孔，37℃，5％co2恒温培养箱培养过夜。用10μl枪头在孔内划线以在细胞间产生缝隙，吸走完全培养基，pbs缓冲液(ph7.4)洗涤2次，尽量洗干净缝隙内及脱落的细胞，补加2ml含2％fbs并含有相应浓度乐卡地平(0μm、8μm、16μm)的1640完全培养基。在6孔板背面垂直方向划线标记，以确定每次拍照的位置一致，每隔24小时(即第0天、第1天和第2天)显微镜拍照记录每个组别内划线处细胞的生长情况及间隙大小，根据间隙距离来确定不同浓度乐卡地平对结直肠癌细胞迁移的抑制作用。
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(4)细胞迁移侵袭实验
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将适当数量的dld-1细胞、ht-29细胞和hct-116细胞用含有不同浓度乐卡地平(0μm、8μm、16μm)的无血清1640基础培养基重悬并添加到相应的transwell上室中，添加含有20％fbs的1640完全培养基到下室中。然后，将培养板在37℃培养箱中培养24小时，并进行结晶紫染色检测。对于侵袭实验，基质胶(美国，康宁)用不含fbs的1640基础培养基以1:25
的比例稀释并在接种细胞前均匀涂抹于transwell小室上室膜表面，基质胶凝固后接种细胞，以下步骤与细胞迁移实验相同。
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(5)细胞凋亡实验
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以浓度为0μm、8μm、16μm的乐卡地平1640完全培养基培养细胞(dld-1细胞、ht-29细胞和hct-116细胞)48小时，参考annexin v-fitc/pi荧光双染细胞凋亡检测试剂盒说明书，用不含edta的胰蛋白酶轻柔收集细胞，并用适量结合缓冲液重悬细胞，得到细胞悬浮液。在避光条件下，取annexin v-fitc和碘化丙啶(pi)各5μl添加到细胞悬浮液中并混匀，然后在室温下反应5-15分钟以确保染料充分结合。在1小时内，通过流式细胞仪和facs calibur系统(bd biosciences)测定凋亡细胞的数量。
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结果如图3-5所示。从图3-5可以看出，经8μm、16μm乐卡地平处理的dld-1细胞、ht-29细胞和hct-116细胞的划痕宽度明显宽于0μm乐卡地平处理的细胞的划痕宽度，说明乐卡地平能显著减弱癌细胞(dld-1细胞、ht-29细胞和hct-116细胞)的迁移能力。从图6可以看出在细胞迁移实验中，随着乐卡地平的处理浓度增加，dld-1细胞、ht-29细胞和hct-116细胞从transwell小室膜的上表面迁移到下表面的细胞数量大幅减少，表明乐卡地平能显著减弱癌细胞(dld-1细胞、ht-29细胞和hct-116细胞)的迁移能力；从图7可以看出在细胞侵袭实验中，随着乐卡地平的处理浓度增加，dld-1细胞、ht-29细胞和hct-116细胞从transwell小室膜的上表面侵袭到下表面的细胞数量大幅减少，表明乐卡地平能显著减弱结直肠癌细胞的侵袭能力；从图8可以看出在细胞凋亡实验中，随着乐卡地平的处理浓度增加，dld-1细胞、ht-29细胞和hct-116细胞在药物处理后发生凋亡的细胞大幅增多，表现为凋亡细胞占总计数细胞的比例增加，表明乐卡地平能显著诱导癌细胞(dld-1细胞、ht-29细胞和hct-116细胞)发生细胞凋亡。
[0040]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。