组织修复用注射剂组合物及其制备方法与流程

1.本发明涉及组织修复用注射剂组合物及其制备方法，更具体地，涉及可表现出改善受损皮肤、即时组织修复效果和通过形成胶原蛋白来产生长期组织修复效果的组织修复用注射剂组合物及其制备方法。


背景技术：

2.组织修复用注射剂组合物通常用于美容目的、生物组织的填充(filling)或代替目的(皱纹的填充、重塑面部(remodelling of the face)、增加唇部体积(lip volume)等)、以及通过中胚层疗法(mesotherapy)为皮肤补充水分(rehydrate)的治疗用途。
3.用作上述组织修复用注射剂组合物的透明质酸在2周至2个月之间迅速体内被再吸收，因此存在长期持续效果不足的问题。因此，正在销售如韩国公开专利第10-2004-0072008号中，将透明质酸和交联物质彼此交联以延长再吸收时间的产品。然而，这种交联产品也因交联物质的毒性而存在问题。
4.为了代替包括上述透明质酸的组织修复用注射剂组合物，开发了许多使用能够体内分解的高分子的组织修复用产品，作为使用现有生物相容性高分子的剂型，开发了将不溶于水的高分子加工成微型尺寸颗粒后，通过具有粘性的介质(media)分散而得剂型。
5.正在使用如下剂型：即将粒径为20至50μm的聚乳酸(poly lactic acid，pla)分散到羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose，cmc)水溶液中的剂型或将粒径为20至50μm的聚己内酯(polycaprolactone，pcl)颗粒分散到cmc和甘油(glycerin)水溶液中的剂型。
6.当注射使用上述能够体内分解的高分子的剂型时，存在注射时因针头被微粒堵塞而在施术时的不方便问题，以及由于颗粒未均匀分散而不能产生均匀的组织修复效果的问题。此外，上述高分子注入体内并诱导胶原蛋白的形成，从而可以表现出组织修复效果，然而与透明质酸一样，存在即时组织修复效果不足的问题。
7.因此，急需制备出如下的组织修复用注射剂组合物：即当将组织修复用注射剂组合物注射给药时，显示即时组织修复效果，同时可以显示长期持续组织修复效果，减少施术上的不便，颗粒均匀分散。
8.现有技术文献
9.专利文献
10.(专利文献1)kr10-2004-0072008 a1


技术实现要素：

11.发明要解决的问题
12.本发明的目的在于，提供如下的组织修复用注射剂组合物及其制备方法：即，通过注入体内改善生理环境，来恢复因老化和刺激受损的皮肤健康，具有即时组织修复效果，诱导胶原蛋白的生成，可长期持续修复组织。
13.本发明的另一目的在于，提供如下的组织修复用注射剂组合物及其制备方法：当
用作注射剂时，作为即用型注射剂组合物，使用前无需稀释，当注射时，不会因针头被颗粒堵塞而产生给药不方便的问题，由于组合物均匀分散，从而可以表现出均匀的组织修复效果。
14.用于解决问题的手段
15.为了实现上述目的，根据本发明一实施例的组织修复用注射剂组合物，包括：微球，包含生物降解性高分子，以及透明质酸；所述组织修复用注射剂组合物的根据以下第一式的值为3400至3600，
16.第一式：
17.g*/sinδ
18.在所述第一式中，
19.g*为复数剪切模量(complex shear modulus)，
20.δ为相位角(phase angle)。
21.所述组织修复用注射剂组合物还可包括多核苷酸(polynucleotide，pn)。
22.所述组织修复用注射剂组合物的弹性组分(elastic component)和粘性组分(viscous component)之比(elastic component/viscous component)为6至7。
23.所述微球的表面呈均匀的球形状，平均直径为35至55μm，平均直径的标准偏差为3.0至5.5。
24.所述微球的比表面积为1.40至1.50m2/g。
25.所述生物降解性高分子可以是选自由聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚己内酯以及它们的衍生物组成的组中的一者以上。
26.所述微球在注入体内后1至3年内被生物吸收。
27.所述组织修复用注射剂组合物是即用型(ready to use)，使用前无需稀释。
28.根据本发明另一实施例的组织修复用注射剂组合物的制备方法可包括：步骤1)，制备包含生物降解性高分子的微球，步骤2)，制备缓冲溶液，步骤3)，将多核苷酸与所述步骤2)的缓冲溶液混合，以制备多核苷酸稀释液，步骤4)，将透明质酸钠凝胶与所述多核苷酸稀释液混合，以制备混合稀释液，步骤5)，将所述步骤1)的微球与所述混合稀释液混合并消泡，以及步骤6)，将所述步骤5)的包括微球的稀释液注入预充式注射器。
29.所述缓冲溶液可以包括氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠以及注射用水。
30.所述步骤5)可以包括：步骤5-1)，将混合有微球的混合稀释液在公转和自转的速度比为1:1至2:1的条件下混合1至5分钟，步骤5-2)，所述混合完成后静置1至5分钟，步骤5-3)，重复所述步骤5-1)和所述步骤5-2)2至4次，以及步骤5-4)，将混合有微球的混合稀释液在公转和自转的速度比为2:1至5:1的条件下消泡5至20分钟。
31.所述步骤6)中，所述步骤5)的包括微球的稀释液以即用状态注入预充式注射器，使用前无需稀释。
32.在下文中，将更详细地描述本发明。
33.根据本发明一实施例的组织修复用注射剂组合物的特征在于，包括：微球，包含生物降解性高分子，以及透明质酸；所述组织修复用注射剂组合物的根据以下第一式的值为3400至3600，
34.第一式：
35.g*/sinδ
36.在所述第一式中，
37.g*为复数剪切模量，
38.δ为相位角。
39.现有组织修复用注射剂组合物包括透明质酸作为主要成分，上述透明质酸存在于关节液、软骨、皮肤等。当将上述透明质酸用作组织修复用注射剂组合物注入到体内时，透明质酸吸引水分子，从而可以表现出增加体内水分和皮肤弹性的效果。
40.然而，这种包括透明质酸的组织修复用注射剂组合物存在维持时间短(6至12个月)，需要定期将注射剂组合物注入体内的不便。
41.已开发出使用生物降解性高分子颗粒作为组织修复用注射剂组合物的技术，这种注射剂组合物不仅起到在体内凹陷部位填充体积的作用，而且从根本上诱导胶原蛋白的生成，从而可以长期维持组织修复效果。
42.然而，这种生物降解性高分子颗粒存在刚注入体内后，没有即刻出现组织修复效果的问题。
43.因此，本发明的组织修复用注射剂组合物用于改善将透明质酸和生物降解性高分子颗粒用作组织修复用注射剂组合物时的问题，其特征在于，包括：微球，包含生物降解性高分子，以及透明质酸；所述组织修复用注射剂组合物的根据以下第一式的值为3400至3600，
44.第一式：
45.g*/sinδ
46.在所述第一式中，
47.g*为复数剪切模量，
48.δ为相位角。
49.换言之，通过结合使用透明质酸的情况和使用生物降解性高分子颗粒的情况的优点，可以表现出短期组织修复效果，并通过对皮肤增加水分感来表现出自然的皮肤光泽，由于使用生物降解性高分子颗粒，诱导胶原蛋白的生成，从而可提高组织修复效果的维持时间。
50.此外，由于还包括具有皮肤再生效果的多核苷酸，可通过改善体内生理环境来恢复因老化和刺激而受损的皮肤健康。
51.本发明的组织修复用注射剂组合物包括透明质酸和微球，主要特征在于，表现出粘弹性行为特性，由于上述特征，可以以即用形式(ready to use)提供均匀混合的注射剂组合物。
52.可通过测量针对本发明的组织修复用注射剂组合物的复数剪切模量(complex shear modulus：g*)和相位角(phase angle：δ)来分析粘性和弹性行为特性。
53.反映g*和δ两种特性的值为g*/sinδ，g*/sinδ是表示组合物的粘弹性特性的特性值，通常，弹性强的组合物的g*/sinδ值高，粘性高的粘结剂的值低。
54.如在本发明中，为了以即用型提供包括透明质酸和微球且均匀混合的注射剂组合物，根据上述第一式的值应为3400至3600。
55.换言之，在落入上述范围内的值的情况下，不仅可以以均匀的注射剂组合物提供，
还可以以即用型提供，可以作为注射剂直接进行给药，而不需要在给药前进行稀释工艺。
56.通常，由于透明质酸而表现出注射剂组合物的粘性和弹性特性，可根据透明质酸的含量，对其特性产生影响。
57.然而，本发明的注射剂组合物的特征在于，还包括；微球，含生物降解性高分子，以及多核苷酸，从而影响注射剂组合物的粘性和弹性的特性。
58.如上所述，注射剂组合物本身的粘性和弹性在额外混合微球和多核苷酸的影响下发生变化，可通过调节注射剂组合物的含量范围来表示根据上述第一式的值。
59.由于满足根据第一式的值的范围，可以提供本发明的使用前无需稀释的即用型的组织修复用注射剂组合物，
60.具体地，本发明的组织修复用注射剂组合物的特征在于，测量本发明的注射剂组合物的粘性的值为75至85pa，测量弹性的值为500至550pa，弹性组分与粘性组分之比为6至7。
61.由于在上述范围内表示弹性和粘性特性，不仅可以以均匀混合的注射剂组合物提供，还可以以即用型提供。
62.此外，当以上述范围提供时，不仅可以易于注入体内，还可以提高由于包括透明质酸、含生物降解性高分子的微球和多核苷酸而带来的诱导胶原蛋白生成效果、以及恢复因老化和刺激而受损的皮肤健康的效果。
63.换言之，当组合物的弹性和粘性特性以本发明的范围包括时，可以提供均匀的注射剂组合物，给药后，上述透明质酸、微球以及多核苷酸在皮肤组织内也保持均匀状态，从而效果不会因部位的不同而存在差异。
64.以往，在将包括生物降解性高分子的微粒用作组织修复用注射剂组合物时，由于微粒的粒径不均匀，存在注入体内时组织修复效果不均匀的问题。
65.图1涉及本发明一实施例的包括生物降解性高分子的微球，可以确认呈表面均匀的球状。
66.图2是在其他产品中用作组织修复用组合物的生物降解性高分子颗粒的sem测量照片，可以确认是不规则形状而不是球状。
67.图3是在其他产品中用作组织修复用组合物的生物降解性高分子颗粒的sem测量照片，可以确认虽然与本发明一样，是球状，但颗粒的表面不均匀。
68.图2和图3涉及以往用作组织修复用注射剂组合物的生物降解性高分子颗粒，从sem照片可以确认，以往的产品是以不均匀的不规则形状提供。
69.如上所述，以往的组织修复用注射剂组合物存在由于微球的形状不规则、粒径彼此不同或表面不均匀，从而在注入体内时组织修复效果不均匀的问题。
70.具体地，若微球的形状大小不均匀、或表面不均匀，则会在注入体内时，分解速度有所不同，从而会导致皮肤内组织修复效果不同的问题。
71.具体地，上述微球的平均直径为35至55μm，对于平均直径的标准偏差为3.0至5.5，比表面积为1.40至1.50m2/g。
72.如上所述，本发明的主要特征为平均直径的偏差分布少，这意味着包括在组合物中的微球的直径范围分布非常小，由于表面均匀形成，因而可以表现出较大的比表面积值。
73.上述微球以均匀的大小分布，表现出较大的比表面积值，注入体内后1至3年内可
以被生物吸收。
74.具体地，如上所述，由于本发明的组织修复用组合物同时包括透明质酸和含生物降解性高分子的微球，可以通过透明质酸和微球诱导胶原蛋白的生成，其中，可通过透明质酸表现出短期组织修复效果，而当基于透明质酸的组织修复效果减退，还可以通过包括生物降解性高分子的微球表现出长期组织修复效果。
75.上述生物降解性高分子可以是选自由聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚己内酯以及它们的衍生物组成的组中的一者以上。
76.根据本发明另一实施例的组织修复用注射剂组合物的制备方法可包括：步骤1)，制备包含生物降解性高分子的微球，步骤2)，制备缓冲溶液，步骤3)，将多核苷酸与所述步骤2)的缓冲溶液混合，以制备多核苷酸稀释液，步骤4)，将透明质酸钠稀释液与所述多核苷酸稀释液混合，以制备混合稀释液，步骤5)，将所述步骤1)的微球与所述混合稀释液混合并消泡，以及步骤6)，将所述步骤5)的包括微球的稀释液注入预充式注射器。
77.上述步骤1)是制备包括生物降解性高分子的微球的步骤。
78.具体地，步骤1)是以如下顺序进行：即制备第一混合物的步骤a)，制备第二混合物的步骤b)，将第一混合物注入直线方向的微通道的步骤c)，将第二混合物注入两侧面或一侧面的微通道的步骤d)，收集微球的步骤e)，将收集到的微球进行搅拌的步骤f)，以及对微球进行洗涤和干燥的步骤g)。
79.步骤a)是制备第一混合物的步骤，是将生物降解性高分子溶解在有机溶剂中以制备第一混合物的步骤，上述生物降解性高分子可选自由聚乳酸，聚丙交酯，聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚丙交酯-乙交酯共聚物(plga)、聚磷腈、聚亚胺基碳酸酯、聚磷酸酯、聚酸酐、聚原酸酯、聚己内酯、聚羟基戊酸酯、聚羟基丁酸酯、聚左旋乳酸、聚氨基酸以及它们的组合组成的组，优选为聚左旋乳酸(plla)，但不限于上述示例。
80.此外，上述有机溶剂与水不混溶，例如，可以是选自由氯仿，氯乙烷，二氯乙烷，三氯乙烷以及他们的混合物组成的组中的一种以上，优选为二氯甲烷，但不限于上述示例，只要是能够溶解生物降解性高分子的有机溶剂，本领域技术人员可以容易选择的任何有机溶剂均可使用，而不限于上述示例。
81.更具体地，上述第一混合物中可包括1至10重量％的生物降解性高分子，优选为3至7重量％，但不限于上述示例。
82.上述步骤b)是制备第二混合物的步骤，通过将表面活性剂溶解在水中，来制备第二混合物。只要生物降解性高分子溶液能够帮助形成稳定的乳液，则上述表面活性剂可以不受限制地进行使用。具体地，可以是选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂以及它们的混合物组成的组中的一种以上，更具体地，可以是选自由甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、卵磷脂、明胶、聚乙烯醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、月桂基硫酸钠、硬脂酸钠、酯胺、直链二胺、脂肪胺以及它们的混合物组成的组中的一种以上，优选为聚乙烯醇，但不限于上述示例。
83.更具体地，上述第二混合物是将表面活性剂溶解在水中而形成的，可包括0.1至5重量％的上述表面活性剂，优选为0.1至0.5重量％，但不限于上述示例。
84.上述步骤c)和步骤d)是将第一混合物和第二混合物注入形成在晶片上的微通道并流动的步骤。
85.更具体地，微通道可形成在选自由硅晶片、或高分子膜组成的组中的材料，上述材料不限于上述示例，只要是能够形成微通道材料均可使用。
86.上述高分子膜可选自由聚酰亚胺(polyimide)、聚乙烯(polyethylene)、氟化乙烯丙烯(fluorinated ethylene propylene)、聚丙烯(polypropylene)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate)、聚萘二甲酸乙二醇酯(polyethylene naphthalate)、聚砜(polysulfone)以及它们的混合物组成的组，但不限于上述示例。
87.作为示例，上述微通道通过如下方式制备：即使用电子束蒸镀机对硅晶片蒸镀铝，并利用光刻技术用光刻胶在铝上进行图案化。之后，将光刻胶用作掩模并蚀刻铝，去除光刻胶后，将铝用作掩模并以深反应离子蚀刻(drie)蚀刻硅，去除铝后，在晶片上阳极接合玻璃并密封。
88.上述微通道的平均直径为80至120μm，优选为100μm，但不限于示例。
89.然而，上述微通道的平均直径可根据注入压力的范围改变。作为一例，当通道的直径为100μm时，上述第二混合物应以1500至2500mbar的压力注入，第一混合物可以以300至700mbar的压力注入。
90.上述微通道的平均直径不仅与颗粒的平均直径密切相关，还与第一混合物及第二混合物的注入压力密切相关，因此不限于上述示例，可以根据所制备的颗粒的平均直径或注入时的压力条件来进行改变。
91.上述步骤c)是将第一混合物注入直线方向的微通道并流动的步骤，上述步骤d)是将第二混合物注入以与直线方向的微通道形成交叉点的方式形成的两侧面或一侧面的微通道并流动。
92.换言之，第一混合物是沿着直线方向的微通道流动，第二混合物是以上述直线方向的微通道为基准，从两侧面或一侧面沿着与直线方向的微通道形成交叉点的微通道流动，从而与第一混合物的流动相遇。
93.此时，当将第一混合物注入到直线方向的微通道时，以一定的压力条件注入，使其以一定的流速流动，此时的压力条件为300至700mbar，优选为500mbar，但不限于示例。
94.此外，当将第二混合物注入到两个侧面或一个侧面的微通道时，以一定的压力条件注入，使其以一定的流速流动，此时的压力条件为1500至2500mbar，优选为2000mbar，但不局限于示例。
95.换言之，为了使与第一混合物的流动形成交叉点的第二混合物的流动以相比于注入到直线方向的微通道的第一混合物的流动更快的流速流动，使第二混合物流动在更高的压力条件下流动。
96.如上所述，使第一混合物及第二混合物的流速不同，且使第二混合物的流速快于第一混合物的流速，在第一混合物流和第二混合物流交汇的地点，具有相对更快的流速的第二混合物会压缩第一混合物，此时，因第一混合物及第二混合物的排斥力，第一混合物内的生物降解性高分子生成球状的微球。
97.上述步骤e)作为收集微球的步骤，在装有第二混合物的水槽内收集微球，以防止初期生成的微球间的聚集现象(aggregation)。
98.上述步骤e)是使用在上述步骤b)中制备的第二混合物，即表面活性剂和水的混合溶液的步骤，在上述步骤b)中制备第二混合物后，一部分注入到微通道，而另一部分移至步
骤e)的水槽，以用于防止收集到的微球间的聚集现象。
99.上述步骤f)是对收集到水槽内的微球进行搅拌的步骤，以一定温度条件和搅拌速度搅拌微球，以蒸发去除存在于缓释微球表面的有机溶剂。此时，搅拌条件可以以如下顺序进行：在10至15℃，以150至650rpm的速度搅拌0.5至1.5小时的第一次搅拌步骤；以及上述第一次搅拌步骤之后，在50至70℃温度条件，以500至1500速度搅拌2.0至4.0小时的第二次搅拌步骤。
100.以使第一次搅拌步骤和第二次搅拌步骤中的搅拌速度存在差异的方式来进行搅拌，使得在搅拌工序中，第二次搅拌工序中的速度比第一次搅拌工序中的速度快。
101.除了搅拌速度以外，温度条件的特征在于，以使第二次搅拌工序中的温度高于第一次搅拌工序中的温度的方式升温并进行搅拌，随着温度的逐步上升，可以调节存在于微球的表面的有机溶剂蒸发速度。即可以通过使存在于微球的表面的有机溶剂逐渐蒸发来制备具有光滑表面的微球。
102.第一混合物及第二混合物通过微通道流动时的温度为15至20℃，优选为15℃。即以在微通道流动并形成交叉点的方式生成微球后，直至第一次搅拌所收集的微球，将温度保持在15至20℃的一定的低温。只有在微球的制备过程中保持低温，才能够制备及保持球形的颗粒。即在非低温条件的情况下，会存在难以制备一定球状的颗粒的问题。
103.最后，上述步骤g)是洗涤及干燥缓释微球的步骤，用经过除菌过滤的纯净水洗涤多次通过搅拌完全去除表面的有机溶剂的微球，以去除残留在微球中的表面活性剂，之后冷冻干燥。
104.上述冷冻干燥条件可包括如下步骤进行：在-45至-40℃，冻结1至15小时的步骤；在上述冻结步骤之后，在150至250μbar的条件下，将温度升温至-30至-20℃，干燥1至15小时的第一干燥步骤；在上述第一干燥步骤之后，将温度升温至1至5℃，干燥1至15小时的第二干燥步骤；以及在上述第二干燥步骤之后，将温度升温至20至40℃，干燥1至25小时的第三干燥步骤。
105.如上所述，随着进行冻结干燥工艺，升华去除残留在微球表面的溶剂，不仅可以防止表面损伤，还可以防止溶剂去除过程中形成气孔(pore)，从而能够以颗粒表面均匀的状态制备微球。
106.如图2所示，若以与上述条件不同的条件制备，制备出的颗粒的表面不平滑，则微球的分解速度增加，会存在不能表现出如本发明的长期组织修复效果的问题。
107.上述步骤2)是制备缓冲溶液的步骤。上述缓冲溶液包括氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠以及注射用水。
108.具体地，氯化钠、磷酸氢二钠以及磷酸二氢钠以1:0.1:0.03至1:0.2:0.1的重量比溶于注射用水，所制备的缓冲溶液的ph为6至8。
109.上述步骤3)是将多核苷酸与上述步骤2)的缓冲溶液混合，以制备pn稀释液的步骤，相对于100重量份的缓冲溶液，混合10至30重量份的多核苷酸。将上述pn稀释液以50至150rpm的速度搅拌10至50分钟，以均匀混合。
110.上述步骤4)是将透明质酸钠凝胶与pn稀释液混合，以制备混合稀释液的步骤。上述混合后，以50至150rpm的速度搅拌5至20分钟。
111.上述步骤5)是将上述步骤1)的微球与上述混合稀释液混合并消泡的步骤，具体
地，可包括：步骤5-1)，将混合有微球的混合稀释液在公转和自转的速度比为1:1至2:1的条件下混合1至5分钟，步骤5-2)，所述混合完成后静置1至5分钟，步骤5-3)，重复所述步骤5-1)和所述步骤5-2)2至4次，以及步骤5-4)，将混合有微球的混合稀释液在公转和自转的速度比为2:1至5:1的条件下消泡5至20分钟。
112.可通过进行上述步骤5-1)至步骤5-3)的工艺来使组合物内的微球、多核苷酸以及透明质酸混合均匀，之后在步骤5-4)中，调节公转和自转速度比，即可进行最佳的消泡工艺。
113.随着上述步骤5)的混合和消泡工艺的进行，本发明的组合物可以以即用型剂型提供，之后步骤6)中，进行将稀释液注入预充式注射器的步骤。
114.发明的效果
115.本发明的组织修复用注射剂组合物可通过向体内给药改善生理环境，来恢复因老化和刺激受损的皮肤健康，具有即时组织修复效果，诱导胶原蛋白的生成，可长期持续修复组织。
116.此外，当用作注射剂时，作为即用型注射剂组合物，使用前无需稀释，当注射时，不会因针头被颗粒堵塞而产生给药不方便的问题，由于组合物均匀分散，从而可以表现出均匀的组织修复效果。
附图说明
117.图1是关于本发明一实施例的微球的sem测量照片。
118.图2是关于本发明一实施例的生物降解性高分子颗粒的sem测量照片。
119.图3是关于本发明一实施例的生物降解性高分子颗粒的sem测量照片。
120.图4是本发明一实施例组合物的组织修复和组织修复持续效果有关的实验结果。
具体实施方式
121.本发明涉及组织修复用注射剂组合物，上述组织修复用注射剂组合物包括：微球，包含生物降解性高分子，以及透明质酸；所述组织修复用注射剂组合物的根据以下第一式的值为3400至3600，
122.第一式：
123.g*/sinδ
124.在所述第一式中，
125.g*为复数剪切模量，
126.δ为相位角。
127.以下，将详细描述本发明的实施例，以便本领域的普通技术人员能够容易地实施本发明。然而，本发明可以以多种不同的形式实施并且不限于这里描述的实施例。
128.制备例1
129.微球的制备
130.将聚左旋乳酸溶解在二氯甲烷(dichloromethane)以制备第一混合物。此时，第一混合物中的聚左旋乳酸的含量为5重量％。
131.将作为表面活性剂的聚乙烯醇与水混合，以制备包括0.25重量％的聚乙烯醇的第
二混合物。
132.将上述第一混合物和上述第二混合物注入形成在硅晶片上的微通道以使其流动。此时，为了使第一混合物和第二混合物以一定速度流动，使第一混合物在500mbar压力条件下流动，使第二混合物在2000mbar压力条件下流动。温度条件保持在15℃。
133.将在上述第一混合物的流动和第二混合物的流动相遇的交叉点生成的微球收集到装有第二混合物的水槽内。
134.将收集在上述水槽内的微球在15℃，以200至400rpm的速度一次搅拌1小时，然后温度上升至60℃，以800至1200rpm的速度二次搅拌3小时。
135.用经过除菌过滤的纯净水洗涤数次完成搅拌的微球，冷冻干燥以制备成微球。
136.制备例2
137.组织修复用注射剂组合物的制备
138.将氯化钠、磷酸氢二钠以及磷酸二氢钠以1:0.15:0.06的重量比加入1000cc的注射用水，混合制备成缓冲溶液。所制备的缓冲溶液的ph为6至7。
139.相对于150重量份的上述缓冲溶液，混合20重量份的多核苷酸，以100rpm搅拌30分钟，来制备了pn稀释液。相对于150重量份的上述pn稀释液，混合800重量份的透明质酸钠凝胶，以100rpm的速度搅拌10分钟。
140.之后，混合在上述制备例1中制备的微球，在公转和自转的速度比为1.2:1的条件下混合1至5分钟，静置2分钟后，再次进行混合工艺。之后，在公转和自转的速度比为3:1的条件下进行消泡工艺10分钟。
141.通过将完成了混合和消泡工艺的组合物填充到注射器，来制备成了即用型。
142.实验例1
143.根据微球的冻结干燥条件的表面形状的确认
144.当制备上述制备例1的微球时，以如下不同冻结干燥条件制备后，测量sem照片，确认了表面是否均匀。
145.[表1]
[0146][0147]
当表面形成有气孔时，由于表面不均匀，注入体内时分解速度快，因而会存在不能表现出长期组织修复效果的问题。
[0148]
在sem测量结果中，将图1所示的情况用o表示，将图3所示的不均匀形成的情况用x表示。
[0149]
[表2]
[0150] 制备例1比较例1比较例2比较例3表面形状oxxx
[0151]
如上述表2所示，当以本发明的冻结干燥条件制备时，可制备出具有图1所示的均匀表面的微球，而在其他条件下，制备出的微球如图3所示，表面不均匀。
[0152]
实验例2
[0153]
组织修复用注射剂组合物的物性评价
[0154]
测量了注射剂组合物的弹性(储能模量，弹性模量)、粘性(损耗模量，粘性模量)、复数粘度(complex viscosity)以及相位角。
[0155]
首先，将试样注入平衡板和微小振动并旋转的几何结构(geometry)之间，来测量对给定力的阻力。在振幅变化(amplitude sweep)评价中确定剪切应变(shear strain)，通过频率变化(frequency sweep)评价来确认了粘弹性的特性。测量条件为剪切应变(shear strain)：0.15％、温度：25℃、频差(frequency gap)：0.5mm，测量对应频率(0.1～10hz)，在1hz确认了测量值。
[0156]
为了比较实验，对市售填料产品rejuran s(比较例4)和the chaeum四号(no.4)(比较例5)也测量了物性值。
[0157]
通过所测量的值，推导出下面第一式的值，并计算了弹性和粘性的比率：
[0158]
第一式：
[0159]
g*/sinδ
[0160]
在所述第一式中，
[0161]
g*为复数剪切模量，
[0162]
δ为相位角。
[0163]
上述测量和计算结果如下表3所示。
[0164]
[表3]
[0165][0166]
如上述表3的结果所示，可以确认本发明的注射剂组合物的第一式的值包括在本发明的范围内，在只测量透明质酸，或测量市售中的组织修复用注射剂组合物的情况下，未能测量到剪切模量(shear modulus)，因此可以确认无法推导出本发明的第一式的值。
[0167]
上述第一式的值仅对应于作为本发明的组织修复用注射剂组合物提供时所测量的值。
[0168]
实验例3
[0169]
组织修复效果和组织修复持续效果
[0170]
为了评价注射剂组合物的组织修复效果和持续效果，将6周龄裸鼠麻醉(舒泰(zoletil)：伦品(rompun)＝3:1)后，在背部左侧皮下注射了上述制备例2的组合物，而在右侧皮下注射了对照例(the chaeum sub-q)。
[0171]
共使用60只，皮下恒定注射0.15ml，注射后确认了经过4周、8周、12周、16周、20周、以及24周后的所给药的试样的组织修复力和持续性。
[0172]
实验结果如图4所示。具体地，比对照例相比，制备例2的组合物保持注入形态，而对照例则在试验期间逐渐失去形态，呈向周边组织扩散的趋势。
[0173]
初期，在注射了制备例2的组合物的所有小鼠中均观察到异物反应，但显示出逐渐减少的倾向。而注射对照例后，初期没有异物反应，但试验期间逐渐扩大。
[0174]
根据上述实验结果，与对照例相比，制备例1的组合物在保持注射形态的有效性方面和对于异物反应的稳定性方面优异。
[0175]
以上，尽管已经详细说明了本发明的优选实施例，但是本发明的范围不限于此，本领域技术人员使用权利要求中限定的本发明的基本概念进行各种修改和改进也属于本发明的范围内。
[0176]
工业实用性
[0177]
本发明涉及组织修复用注射剂组合物及其制备方法，更具体地，涉及可表现出改善受损皮肤、即时组织修复效果和通过形成胶原蛋白来产生长期组织修复效果的组织修复用注射剂组合物及其制备方法。