包含程序性细胞死亡配体1蛋白的融合蛋白及其用途的制作方法

1.本发明涉及一种包含程序性细胞死亡配体1(pd-l1)蛋白及修饰免疫球蛋白的fc区域的融合蛋白及其用途。


背景技术：

2.人程序性细胞死亡配体1(pd-l1，programmed cell death-ligand 1)作为程序性死亡受体1(pd-1，programmed death-1)的配体，是在如t淋巴细胞、b淋巴细胞、树突状细胞(dendritic cell)或巨噬细胞的造血细胞和如角化细胞、胰岛细胞、肝细胞等的非-造血细胞中表达的1型跨膜蛋白。另一方面，为了使t细胞活性化，除t细胞受体(receptor)和抗原的第一信号刺激之外，同时需要第二信号刺激(协同刺激(co-stimulation))。在此情况下，若没有两个信号中的任何一个信号，t细胞处于非活性化(anergy)状态。程序性死亡受体1是调节t细胞的第二信号活性的第二信号刺激因子(免疫检查点(immune check point)或免疫调节剂(immune modulator))，可通过与如活性化的t细胞(cd8和/或cd4)或树突状细胞的在细胞表面表达的程序性细胞死亡配体1或b7.1(cd80)等结合，起到抑制t细胞的增殖、减少细胞因子(cytokine)的表达等的抑制t细胞的功能的作用。
3.已知程序性死亡受体1：程序性细胞死亡配体1之间的结合诱导调节t细胞的活性(immunol rev.2010jul；236:219-42)，当利用这种程序性细胞死亡配体1的免疫耐受诱导功能，向胶原性关节炎(cia，collagen-induced arthritis)小鼠模型注射与免疫球蛋白g1的fc融合的程序性细胞死亡配体1蛋白(pd-l1-ig)时，观察到关节炎症状得到缓解(rheumatol int.2011apr；31(4):513-9)。由于程序性死亡受体1在活性化的t细胞中表达，因此，预测pd-l1蛋白不仅在自身免疫性疾病而且在器官移植过程中诱导免疫耐受，可有用地用作特异性靶向活性免疫细胞的治疗剂。
4.迄今为止，对于程序性死亡受体1/程序性细胞死亡配体1细胞信号体系的治疗剂朝着作为拮抗剂(antagonist)通过阻碍免疫耐受(tolerance breaking)增加t细胞活性的方向开发。但是，目前为止，尚未开发以利用兴奋剂(agonist)诱导t细胞免疫耐受为基础的免疫治疗剂。这是因为，在程序性死亡受体1/程序性细胞死亡配体1拮抗剂的情况下，可容易地利用抗体融合技术开发，但在技术上，难以开发需要开发为可溶性(soluble)形态的蛋白质的程序性死亡受体1/程序性细胞死亡配体1信号兴奋剂。
5.免疫球蛋白(immunoglobulin，ig)的fc融合技术是用于增加蛋白质治疗剂的体内半衰期的技术中的一种。然而，在用于现有的免疫球蛋白融合技术的免疫球蛋白g1的情况下，由于在体内引起抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，adcc)及补体依赖性细胞毒作用(complement dependent cytotoxicity，cdc)，因此，作为自身免疫性疾病治疗剂或器官移植中的免疫耐受诱导剂的免疫球蛋白融合蛋白无法起到抑制炎症反应的作用，反而存在使炎症恶化的问题。
6.因此，需要开发将程序性细胞死亡配体1的半衰期维持为与现有的免疫球蛋白融合蛋白治疗剂相似，并且，不诱发抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用及补体依赖性细胞毒
作用，从而提高作为免疫抑制剂的程序性细胞死亡配体1治疗功效的技术。


技术实现要素：

7.发明要解决的问题
8.本发明的目的在于，提供一种融合蛋白，包含程序性细胞死亡配体1蛋白及修饰免疫球蛋白的fc区域。
9.并且，本发明的另一目的在于，本发明提供一种核酸分子，对所述融合蛋白进行编码。
10.并且，本发明的另一目的在于，提供一种表达载体，包含所述核酸分子。
11.并且，本发明的另一目的在于，提供一种宿主细胞，包含所述表达载体。
12.并且，本发明的另一目的在于，提供一种用于预防或治疗免疫疾病的药物组合物，包含融合蛋白作为有效成分，所述融合蛋白包含程序性细胞死亡配体1蛋白及修饰免疫球蛋白的fc区域。
13.并且，本发明的另一目的在于，提供一种包含程序性细胞死亡配体1蛋白及修饰免疫球蛋白的fc区域的融合蛋白的用途，用于生产具有免疫疾病的预防或治疗效果的医药制剂。
14.并且，本发明的另一目的在于，提供一种免疫疾病的预防或治疗方法，包括将包含程序性细胞死亡配体1蛋白及修饰免疫球蛋白的fc区域的融合蛋白与药学上可接受的载体施用于个体的步骤。
15.解决问题的手段
16.为了达到上述目的，本发明提供一种融合蛋白，包含程序性细胞死亡配体1(pd-l1)蛋白及修饰免疫球蛋白的fc区域。
17.并且，本发明提供一种核酸分子，对所述融合蛋白进行编码。
18.并且，本发明提供一种表达载体，包含所述核酸分子。
19.并且，本发明提供一种宿主细胞，包含所述表达载体。
20.本发明提供一种用于预防或治疗免疫疾病的药物组合物，包含融合蛋白作为有效成分，所述融合蛋白包含程序性细胞死亡配体1(pd-l1)蛋白及修饰免疫球蛋白的fc区域。
21.并且，本发明提供一种包含程序性细胞死亡配体1蛋白及修饰免疫球蛋白的fc区域的融合蛋白的用途，用于生产具有免疫疾病的预防或治疗效果的医药制剂。
22.并且，本发明提供一种免疫疾病的预防或治疗方法，包括将包含程序性细胞死亡配体1蛋白及修饰免疫球蛋白的fc区域的融合蛋白与药学上可接受的载体施用于个体的步骤。
23.发明的效果
24.根据本发明的融合蛋白是程序性细胞死亡配体1蛋白及修饰免疫球蛋白的fc区域通过由免疫球蛋白g1(igg1)铰链构成的序列与gs序列相连接的融合蛋白，其特征在于，通过由免疫球蛋白g1铰链构成的序列与gs序列相连接来以诱导二聚体且维持柔韧性的方式制备。并且，根据本发明的融合蛋白具有如下的效果：相比于现有的融合蛋白，纯度及生产收率显著高，对程序性死亡受体1的结合能力高，减少活性化的t细胞的增殖，抑制通过活性化的t细胞生成的细胞因子的产生，抑制t细胞或巨噬细胞浸润组织，从而可有用地用于治
疗免疫疾病。
附图说明
25.图1示出包含程序性细胞死亡配体1蛋白及修饰免疫球蛋白的fc区域的融合蛋白(程序性细胞死亡配体1-hyfc21(pd-l1-hyfc21)融合蛋白)的结构。
26.图2a是分析表达程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白的细胞的按照不同时间的细胞浓度的结果，图2b是在表达程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白的细胞的细胞培养液中，通过尺寸排阻高效液相色谱法(se-hplc)分析目标蛋白的纯度的结果。
27.图3a是分析表达程序性细胞死亡配体1-hyfc5(pd-l1-hyfc5)融合蛋白的细胞的按照不同时间的细胞浓度的结果，图3b是在表达程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白的细胞的细胞培养液中通过尺寸排阻高效液相色谱法分析目标蛋白的纯度的结果。
28.图4是纯化的程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分析结果。
29.图5a是纯化的程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白的尺寸排阻高效液相色谱法分析结果，图5b为纯化的程序性细胞死亡配体1-hyfc5蛋白的尺寸排阻高效液相色谱法分析结果。
30.图6是纯化的程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白的凝胶等电聚焦电泳(gel ief)分析结果。
31.图7是纯化的程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白的差示扫描荧光法(dsf)分析结果。
32.图8是比较程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白对程序性死亡受体1的结合能力(binding affinity)的结果。
33.图9是比较通过程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白的混合淋巴细胞反应抑制能力的结果。
34.图10a是比较通过程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白活性化的人cd4 t细胞增殖抑制能力的结果，图10b是比较活性化的人cd4 t细胞的细胞因子表达抑制能力的结果。
35.图11是比较通过程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白活性化的小鼠cd4 t细胞的细胞因子表达抑制能力的结果。
36.图12a是向咪喹莫特(imq)-诱导银屑病小鼠模型皮下施用程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白之后，测量小鼠的耳朵厚度的结果，图12b是向咪喹莫特-诱导银屑病小鼠模型静脉施用程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白之后，测量小鼠的耳朵厚度的结果。
37.图13a是向rtta-peli1银屑病小鼠模型皮下施用程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白之后，通过苏木精-伊红(h&e)染色法确认皮肤上皮组织的变化的结果，图13b是测量皮肤上皮层的厚度的结果。
38.图14是在未诱发银屑病的对照组(rtta)或诱发银屑病的rtta-peli1银屑病小鼠模型中，通过免疫荧光分析法示出t细胞及巨噬细胞的浸润程度的结果(左侧面板：rtta；以及右侧面板：rtta-peli1)。
39.图15是向rtta-peli1银屑病小鼠模型皮下施用程序性细胞死亡配体1-hyfc21融
合蛋白之后，测定浸润到皮肤组织的t细胞及巨噬细胞的数量的结果。
40.图16是向rtta-peli1银屑病小鼠模型皮下施用程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白之后，测定皮肤组织中的k14
+
角蛋白生成细胞的数量的结果。
41.图17是向rtta-peli1银屑病小鼠模型静脉施用程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白之后，以评分指数分析皮肤上皮层的变化的结果。
42.图18是向rtta-peli1银屑病小鼠模型静脉施用程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白之后，测量腹部皮肤厚度的结果。
43.图19a是向rtta-peli1银屑病小鼠模型静脉施用程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白之后，通过苏木精-伊红染色法确认皮肤上皮组织的变化的结果，图19b是测量皮肤上皮层的厚度的结果。
44.图20是向rtta-peli1银屑病小鼠模型静脉施用程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白之后，通过qrt-pcr确认th17细胞-相关基因(白细胞介素-17a(il-17a)及白细胞介素-22(il-22))与先天性免疫细胞-相关基因(白细胞介素-1β(il-1β)及白细胞介素-24(il-24))的信使核糖核酸(mrna)表达变化的结果。
具体实施方式
45.在下文中，将详细描述本发明。
46.本发明提供一种包含程序性细胞死亡配体1蛋白及修饰免疫球蛋白的fc区域的融合蛋白。
47.所述程序性细胞死亡配体1蛋白可以是程序性细胞死亡配体1蛋白的胞外域(extracellular domain)或其片段。程序性细胞死亡配体1蛋白的胞外域可以是包含程序性细胞死亡配体1的免疫球蛋白v(ig v)样结构域(immunoglobulin v like domain)及程序性细胞死亡配体1的免疫球蛋白c(ig c)样结构域(immunoglobulin c like domain)的多肽。
48.具体地，程序性细胞死亡配体1蛋白的胞外域是暴露在细胞膜外部的蛋白部分，可以是由seq id no:1的第19至238位的氨基酸组成的多肽或由seq id no；1的第19至239位的氨基酸组成的多肽。
49.此时，所述程序性细胞死亡配体1蛋白的胞外域包含作为与免疫球蛋白的氨基酸序列类似的保守序列(conserved sequence)的免疫球蛋白v样(ig v，ig v like)序列，高度保守(highly conserved)的免疫球蛋白v样序列是seq id no:1的第68至114位的氨基酸序列。并且，包含免疫球蛋白c样(ig c，ig c like)序列，高度保守的序列位点是seq id no:1的第153至210位的氨基酸序列。并且，所述程序性细胞死亡配体1蛋白的胞外域的片段可包含全部或部分免疫球蛋白v样结构域，所述免疫球蛋白v样结构域包含程序性细胞死亡配体1的免疫球蛋白v样序列。
50.并且，在所述程序性细胞死亡配体1蛋白的胞外域中，免疫球蛋白v样结构域作为可与程序性死亡受体1相互作用的位点，可以是由seq id no:1的第19至239位氨基酸序列组成的多肽(seq id no:3)，可以是由seq id no:1的第21至239位氨基酸序列组成的多肽。并且，可以是由seq id no:1的第19至133位的氨基酸序列组成的多肽(seq id no:4)，可以是由seq id no:1的第21至133位的氨基酸序列组成的多肽。并且，可以是由seq id no:1的
第21至114位的氨基酸序列组成的多肽，可以是由seq id no:1的第19至114位的氨基酸序列组成的多肽。并且，可以是由seq id no:1的第21至120位的氨基酸序列组成的多肽，可以是由seq id no:1的第19至120位的氨基酸序列组成的多肽。并且，可以是由seq id no:1的第19至127位的氨基酸序列组成的多肽(seq id no:5)，可以是由seq id no:1的第21至127位的氨基酸序列组成的多肽(seq id no:6)。并且，可以是由seq id no:1的第21至130位的氨基酸序列组成的多肽，可以是由seq id no:1的第19至130位的氨基酸序列组成的多肽。并且，可以是由seq id no:1的第21至131位的氨基酸序列组成的多肽，可以是由seq id no:1的第19至131位的氨基酸序列组成的多肽。
51.并且，在所述程序性细胞死亡配体1蛋白的的胞外域的片段包含免疫球蛋白v样结构域或其片段的情况下，所述程序性细胞死亡配体1蛋白的胞外域的片段还可包含程序性细胞死亡配体1蛋白的胞外域的免疫球蛋白c样结构域。所述免疫球蛋白c样结构域可以是由seq id no:1的第133至225位的氨基酸序列组成的多肽或由seq id no:1的第134至225位的氨基酸序列组成的多肽。
52.并且，在所述程序性细胞死亡配体1蛋白的胞外域的片段包含免疫球蛋白v样结构域或其片段的情况下，所述程序性细胞死亡配体1蛋白的胞外域的片段还可包含多肽或其片段，所述多肽包含程序性细胞死亡配体1蛋白的胞外域的免疫球蛋白c样结构域。包含所述免疫球蛋白c样结构域的多肽是指包含除免疫球蛋白v结构域之外的程序性细胞死亡配体1蛋白的胞外域，可以是具有seq id no:1的第134至239位的氨基酸的多肽(seq id no:7)或具有seq id no:1的第134至238位的氨基酸的多肽(seq id no:8)。
53.并且，所述程序性细胞死亡配体1蛋白的胞外域或其片段可来源于人或小鼠。
54.所述人程序性细胞死亡配体1蛋白的胞外域是由seq id no:1的第19至239位的氨基酸序列组成的多肽(seq id no:3)，小鼠程序性细胞死亡配体1蛋白的胞外域是由seq id no:2的第19至239位的氨基酸序列组成的多肽。并且，所述程序性细胞死亡配体1蛋白的胞外域可与由seq id no:1的第19至239位的氨基酸序列组成的多肽序列具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的同源性。
55.具体地，人程序性细胞死亡配体1蛋白具有290个氨基酸残基，包含seq id no:1(accession number:q9nzq7)的氨基酸序列。在seq id no:1的氨基酸序列中，n-端的第1至18位的氨基酸残基是信号序列，成熟的人程序性细胞死亡配体1蛋白包含seq id no:1的第19至290位的氨基酸序列。人程序性细胞死亡配体1蛋白的胞外域包含seq id no:1的第19至238位的或seq id no:1的第19至239位的氨基酸序列。
56.人程序性细胞死亡配体1蛋白包含作为seq id no:1的第19至127位的氨基酸的免疫球蛋白v样结构域和作为seq id no:1的第134至226位的氨基酸的免疫球蛋白c样结构域。
57.据报告，小鼠程序性细胞死亡配体1蛋白包含290个氨基酸，其包含seq id no：2(accession number:q9ep73)的氨基酸序列。seq id no:2的第1至18位的氨基酸残基是信号序列，成熟的小鼠程序性细胞死亡配体1蛋白包含seq id no:2的第19至290位的氨基酸序列。小鼠程序性细胞死亡配体1蛋白的胞外域包含seq id no:2的第19至239位的氨基酸序列。小鼠程序性细胞死亡配体1蛋白包含作为seq id no:2的第19至127位的氨基酸的免疫球蛋白v样蛋白和作为seq id no:2的第133至224位的氨基酸的免疫球蛋白c样结构域。
58.所述程序性细胞死亡配体1蛋白的胞外域可包含免疫球蛋白v样结构域的全部或其片段。并且，所述程序性细胞死亡配体1蛋白的胞外域的片段还可包含多肽(除免疫球蛋白v样结构域之外的程序性细胞死亡配体1的胞外域)，所述多肽还包含免疫球蛋白c样结构域或免疫球蛋白c样结构域。
59.程序性细胞死亡配体1蛋白的胞外域或其片段可包含多种修饰的蛋白质或肽。只要不修饰程序性细胞死亡配体1的功能，则可通过在野生型程序性细胞死亡配体1蛋白中取代、缺失或添加一种以上的蛋白质的方法执行所述修饰。这样的多种蛋白质或肽可以与野生型蛋白质具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。
60.本发明的术语“程序性细胞死亡配体1蛋白的胞外域”也作为包含“程序性细胞死亡配体1蛋白的胞外域及其片段”的概念使用。
61.除非另有说明，否则本发明的术语“蛋白质”、“多肽”及“肽”可作为互换的概念使用。
62.本发明的术语“程序性细胞死亡配体1融合蛋白”及“程序性细胞死亡配体1-修饰免疫球蛋白的fc区域融合蛋白”指程序性细胞死亡配体1蛋白、程序性细胞死亡配体1蛋白的胞外域或其片段与修饰免疫球蛋白fc区域结合的融合蛋白。
63.在本发明中，所述程序性细胞死亡配体1蛋白可与修饰免疫球蛋白的fc区域的n-端或c-端融合，优选地，所述程序性细胞死亡配体1蛋白可与修饰免疫球蛋白的fc区域的n-端融合。所述程序性细胞死亡配体1蛋白可通过连接肽与免疫球蛋白fc区域连接。所述连接肽可包含gggsggs(seq id no:10)、aagsgggggsggggsggggs(seq id no:17)、ggsgg(seq id no:18)、ggsggsggs(seq id no:19)、gggsgg(seq id no：20)、(g4s)n(n是1至10的整数)、(ggs)n(n是1至10的整数)、(gs)n(n是1至10的整数)、(gssggs)n(n是1至10的整数)、kesgsvsseqlaqfrsld(seq id no:21)、egkssgsgseskst(seq id no:22)、gsagsaagsgef(seq id no:23)、(eaaak)n(n是1至10的整数)、crrrrrreaeac(seq id no:24)、a(eaaak)4alea(eaaak)4a、gggggggg(seq id no:25)、gggggg(seq id no:26)、aeaaakeaaaaka(seq id no:27)、papap(seq id no:28)、(ala-pro)n(n是1至10的整数)、vsqtskltraetvfpdv(seq id no:29)、plglwa(seq id no:30)、trhrqprgwe(seq id no:31)、agnrvrrsvg(seq id no:32)、rrrrrrrr(seq id no:33)、gflg(seq id no:34)及gssggsgssggsgggdeadgsrgsqkagvde(seq id no:35)等。优选地，程序性细胞死亡配体1与免疫球蛋白fc区域可通过由gggsggs(seq id no:10)的氨基酸序列组成的连接肽连接。在利用所述连接肽连接程序性细胞死亡配体1蛋白与免疫球蛋白的fc区域的情况下，可使所述融合蛋白的活性、稳定性及生产性最优化。
64.并且，所述融合蛋白能够以二聚体形态存在。构成二聚体的融合蛋白之间的结合可以由存在于连接肽中的半胱氨酸通过二硫键结合实现。构成二聚体的融合蛋白是相同的。即，所述二聚体可以是同源二聚体(homodimer)。此时，所述融合蛋白可以是可溶性的，尤其，可被纯净水或生理盐水溶化。
65.所述修饰免疫球蛋白的fc区域可以为免疫球蛋白g1、免疫球蛋白g2、免疫球蛋白g3、免疫球蛋白d及免疫球蛋白g4的fc区域中的任意一种或它们的组合。所述fc区域被修饰以不发生与fc受体的结合和/或补体(complement)的结合。尤其，所述修饰免疫球蛋白的fc
区域沿着从n-端至c-端的方向包含铰链区、ch2结构域以及ch3结构域，所述铰链区包含人免疫球蛋白g1铰链区(seq id no:16)，所述ch2结构域包含人免疫球蛋白d和人免疫球蛋白g4的ch2结构域的氨基酸残基部分，所述ch3结构域可包含人免疫球蛋白g4的ch3结构域的氨基酸残基部分。
66.本发明的术语“fc区域”、“fc片段”或“fc”指包含免疫球蛋白的重链恒定区2(ch2)及重链恒定区3(ch3)且不包含免疫球蛋白的重链及轻链的可变区及轻链恒定区1(cl1)的蛋白质。其还可包含重链恒定区的铰链区。在本发明中，还将杂合fc或杂合fc片段称为“hfc”或“hyfc”。
67.并且，本发明的fc片段可以是天然糖链的形式、与天然形式相比增加糖链的形式或者与天然形式相比减少糖链的形式，或者可以是去糖基化形式。可通过如化学方法、酶法和使用微生物的基因工程法等的常规方法修饰免疫球蛋白fc糖链。当从fc片段去除糖链时，使第一补体成分c1与c1q的结合亲和力急剧降低，使抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用或补体依赖性细胞毒作用减少或丧失，从而不会在体内诱导生物不必要的免疫反应。就这点而言，去糖基化(deglycosylated)或非糖基化(aglycosylated)形式的免疫球蛋白fc片段作为药物载体可能更适合于本发明的目的。如本文所用，术语“去糖基化(deglycosylation)”是指糖从fc片段以酶促去除。并且，术语“非糖基化”(aglycosylation)是指通过原核生物、优选的通过大肠杆菌(e.coli)产生未糖基化(unglycosylated)形式的fc片段。
68.在本发明的一实施例中，所述修饰免疫球蛋白的fc区域可由seq id no:11的氨基酸序列(以下，为“hyfc”)组成。
69.在本发明的一实施例中，所述融合蛋白可由下述结构式i所示。
70.n'-x-l-y-c'(结构式i)
71.其中，
72.n'是融合蛋白的n端，c'是融合蛋白的c端；
73.所述x是程序性细胞死亡配体1蛋白、程序性细胞死亡配体1蛋白的胞外域或其片段；
74.l是连接肽；
75.y是免疫球蛋白fc区域。
76.优选地，所述融合蛋白可由seq id no:12或seq id no:13的氨基酸序列组成。并且，本发明的融合蛋白可与seq id no:12的氨基酸序列具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的同源性。
77.并且，本发明提供一种对所述融合蛋白进行编码的核酸分子。
78.优选地，所述核酸分子可以是对由seq id no:12或seq id no:13的氨基酸序列组成的多肽进行编码的核酸分子。并且，所述核酸分子还可包含信号序列(或信号肽)或前导序列。
79.本发明的术语“信号序列(或信号肽)”是指存在于分类为分泌途径的新合成的蛋白质的n-端的短肽。在本发明中有用的信号序列包含如抗体1418(gillies et al.,j immunol meth 1989 125:191-202)的抗体轻链信号序列、如mopc141抗体重链信号序列(sakano et al,nature 1980 286:676-683)的抗体重链信号序列以及本领域公知的其他
信号序列(参见，例如watson等,nucleic acid research1984 12:5145-5164)。
80.所述信号肽的特征在本领域已公知，已知通常包含16个至30个氨基酸残基，并且可包含更多或更少的氨基酸残基。常规的信号肽由碱性n-端区、中心疏水区和更具极性(polar)的c-端区的三个区域构成。
81.中心疏水区包含4个至12个疏水残基，所述疏水残基在未成熟多肽的易位期间通过膜脂双层固定信号序列。在启动后，信号序列通常在内质网(er)的腔(lumen)内被公知为信号肽酶(signal peptidases)的细胞酶切割。此时，所述信号序列可以是组织型纤溶酶原激活剂(tpa，tissue plasminogen activation)、单纯疱疹病毒糖蛋白d(hsv gds)或生长激素的分泌信号序列。优选地，可使用在包括哺乳动物等的高级真核细胞中使用的分泌信号序列，更优选地，可使用组织型纤溶酶原激活剂序列或seq id no:1的第1至18位的氨基酸序列。并且，本发明的信号序列可通过在宿主细胞中的表达频率高的密码子替换来使用。
82.并且，本发明提供一种包含所述核酸分子的表达载体。
83.本发明的术语“载体”应理解为包含核苷酸序列的核酸单元，所述核苷酸序列能够引入到宿主细胞中以重组、插入在宿主细胞基因组中，或能够作为附加体(episome)自主复制。所述载体包括线性(linear)核酸、质粒、噬菌粒(phagemids)、粘粒(cosmids)、rna载体、病毒载体及其类似物。病毒载体的示例包括逆转录病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)和腺-相关的病毒(adeno-associated virus)，但并不限于此。
84.在本发明中，有用的表达载体可以是rccmv(invitrogen，carlsbad)或其变体。有用的表达载体可包含用于促进在哺乳类细胞中目标基因的连续转录的人巨细胞病毒(cmv，cytomegalovirus)启动子及用于提高转录后核糖核酸的稳定状态水平的牛生长激素(bovine growth hormone)多聚腺苷酸化信号序列。在本发明的一个实施方案中，表达载体是pad15，所述pad15为rccmv的修饰载体。
85.本发明的术语“宿主细胞”表示可引入重组表达载体的原核及真核细胞。
86.在本发明中，适当的宿主细胞可利用本发明的脱氧核糖核酸(dna)序列转化或转染，可用于目标蛋白的表达和/或分泌。目前可用于本发明的优选宿主细胞包含永生性杂交瘤细胞(immortal hybridoma cells)、ns/0骨髓瘤细胞(ns/0myeloma cells)、293细胞、中国仓鼠卵巢细胞(cho cell)、海拉细胞(hela)、capt细胞(源自人羊水的细胞)和cos细胞。
87.本发明的术语“转化”及“转染”指通过本领域公知的多种技术在细胞中引入核酸(例如，载体)。
88.并且，本发明提供一种用于预防或治疗免疫疾病的药物组合物，包含融合蛋白作为有效成分，所述融合蛋白包含程序性细胞死亡配体1蛋白及修饰免疫球蛋白的fc区域。
89.所述免疫疾病可以是选自由自身免疫性疾病、炎症性疾病及细胞、组织或器官的移植排斥(transplantation rejection)疾病组成的组中的疾病。
90.所述自身免疫性疾病可选自由关节炎[急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风性(gouty)关节炎、急性痛风性关节炎、慢性炎症性关节炎、退行性关节炎、感染性关节炎、莱姆(lyme)关节炎、增生性关节炎、银屑病关节炎、脊柱性关节炎及风湿性关节炎，诸如幼年型类风湿性关节炎(juvenile-onset rhematoid arthritis)、骨关节炎、慢性进行性关节炎(arthritis chronica progrediente)、变形性(deformans)关节炎、原发慢性多发性关节炎(polyarthritis chronica primaria)、反应性关节炎(reactive arthritis)和强直
性脊柱炎(ankylosing spondylitis)]、炎症性增生性皮肤病、银屑病，诸如斑块状银屑病(plaque psoriasis)、滴状银屑病(gutatte psoriasis)、脓疱型银屑病(pustular psoriasis)和指甲银屑病(psoriasis of the nails)、皮炎，包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、过敏性皮炎、过敏性接触性皮炎、疱疹样皮炎(herpetiformis dermatitis)和特应性皮炎(atopic dermatitis)、x-连锁高免疫球蛋白m症候群；荨麻疹(urticaria)，诸如慢性特发性荨麻疹(chronic idiopathic urticaria)，所述荨麻疹包括慢性过敏性荨麻疹和慢性自身免疫性荨麻疹、多发性肌炎/皮肌炎(polymyositis/dermatomyositis)、幼年型皮肌炎(juvenile dermatomyositis)、中毒性表皮坏死松解症(toxic epidermal necrolysis)、硬皮病(scleroderma)(包括系统性硬皮病)、系统性硬化症(systemic sclerosis)、硬化症(sclerosis)包括如视神经脊髓型多发性硬化症(spino-optical ms)、原发性进展型多发性硬化症(primary progressive ms；ppms)及复发缓解型多发性硬化症(relapsing remitting ms；rrms)的多发性硬化症(multiple sclerosis；ms)、进行性系统性硬化症(progressive systemic sclerosis)、动脉粥样硬化(atherosclerosis)、动脉硬化(arteriosclerosis)、播散性硬化(sclerosis disseminata)及共济失调硬化症(ataxic sclerosis)、炎症性肠病(inflammatory bowel disease；ibd)[例如，克罗恩病、自身免疫介导的胃肠疾病、结肠炎，诸如溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、溃疡性结肠炎(colitis ulcerosa)、显微镜性结肠炎(microscopic colitis)、胶原性结肠炎(collagenous colitis)、息肉状结肠炎(colitis polyposa)、新生儿坏死性小肠结肠炎(necrotizingenterocolitis)及透壁性结肠炎(transmural colitis)、和自身免疫性炎症性肠病(autoimmune inflammatory bowel disease)]、坏疽性脓皮病(pyoderma gangrenosum)、结节性红斑(erythema nodosum)、原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis，episcleritis)、包括成人或急性呼吸窘迫综合征(adult or acute respiratory distress syndrome；ards)的呼吸窘迫综合征(respiratory distress syndrome)、脑膜炎(meningitis)、全部或部分葡萄膜(uvea)的炎症、虹膜炎(iritis)、脉络膜炎(choroiditis)、自身免疫性血液疾病(autoimmune hematological disorder)、类风湿性脊柱炎(rheumatoid spondylitis)、突发性听力丧失、如过敏反应(anaphylaxis)以及过敏性及特应性鼻炎的免疫球蛋白e介导的疾病、如拉斯马森脑炎(rasmussen's encephalitis)及边缘叶和/或脑干脑炎(limbic and/or brainstem encephalitis)的脑炎(encephalitis)、如前葡萄膜炎(anterior uveitis)、急性前葡萄膜炎、肉芽肿型葡萄膜炎(granulomatous uveitis)、非肉芽肿型葡萄膜炎(nongranulomatous uveitis)、晶状体抗原性葡萄膜炎(phacoantigenic uveitis)、后葡萄膜炎(posterior uveitis)或自身免疫性葡萄膜炎(autoimmune uveitis)的葡萄膜炎、具有或不具有如原发性肾小球肾炎(primary gn)的慢性或急性肾小球肾炎的肾病综合征(nephrotic syndrome)的肾小球肾炎(glomerulonephritis；gn)、免疫介导的肾小球肾炎、膜性肾病(membranous gn，membranous nephropathy)、特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy)或特发性膜性肾病(idiopathic membranous gn)、包括i型及ii型的rnembrano-或膜增生性肾小球肾炎(membranous proliferative gn；mpgn)及快速进展性肾小球肾炎、过敏性疾病、过敏反应、包括过敏性或特应性湿疹在内的湿疹(eczema)、如支气管性气喘(asthma bronchiale)、支气管哮喘(bronchial asthma)及自身免疫哮喘
的哮喘、与t细胞侵袭及慢性炎症反应相关的疾病、慢性肺部炎性疾病(pulmonary inflammatory disease)、自身免疫性心肌炎(myocarditis)、白细胞黏附缺陷病(leukocyte adhesion deficiency)、如系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus；sle)或皮肤sle的系统性红斑狼疮、亚急性皮肤型红斑狼疮(subacute cutaneous lupus erythematosus)、新生儿狼疮综合征(neonatal lupus syndrome；nle)、播散性红斑狼疮(lupus erythematosus disseminatus)、狼疮[包括肾炎(nephritis)、脑炎(cerebritis)、小儿(pediatric)、非肾性(non-renal)、肾外(extra-renal)、盘状(discoid)、脱发(alopecia)]、包括小儿胰岛素依赖型糖尿病(pediatric insulin-dependent diabetes mellitus；iddm)的幼年型(i型)糖尿病(juvenile onset(type i)diabetes mellitus)、成人型糖尿病(ii型)、自身免疫性糖尿病、特发性尿崩症(idiopathic diabetes insipidus)、与细胞因子和t淋巴细胞及介导的急性及迟发性超敏反应相关的免疫应答、结核病、结节病(sarcoidosis)、包括淋巴瘤样肉芽肿病(lymphomatoid granulomatosis)的肉芽肿病(granulomatosis)、韦格纳肉芽肿病(wegener's granulomatosis)、粒细胞缺乏症(agranulocytosis)、血管炎(vasculitis)[包括大血管性血管炎(风湿性多肌痛(polymyalgia rheumatica)及巨细胞(takayasu's)动脉炎)]、包括川崎病、结节性多动脉炎(polyarteritis nodosa)的中等血管炎、显微镜下多动脉炎(microscopic polyarteritis)、中枢神经系统(cns)关节炎、包括坏死性、皮肤性或过敏性血管炎、系统性坏死性血管炎(systemic necrotizing vasculitis)、包括如变应性肉芽肿性血管炎(churg-strauss vasculitis)或churg-strauss综合征(css)的anca相关血管炎的血管炎、颞动脉炎(temporal arteritis)、再生障碍性贫血(aplastic anemia)、自身免疫再生障碍性贫血、库姆斯(coombs)阳性贫血、先天性纯红细胞再生障碍性贫血(diamond blackfan anemia)、包括溶血性贫血(hemolytic anemia)或自身免疫性溶血性贫血(autoimmune hemolytic anemia；aiha)的免疫性溶血性贫血、恶性贫血(pernicious anemia；anemia perniciosa)、艾迪生氏病(addison's disease)、纯红细胞性贫血再生障碍(pure red cell anemia aplasia；prca)、vhi因子缺乏症、血友病a、与自身免疫性中性粒细胞减少症(autoimmune neutropenia)、全血细胞减少症(pancytopenia)、白细胞减少症(leukopenia)、白细胞渗出(leukocyte diapedesis)相关的疾病、中枢神经系统炎性障碍、如败血症(septicemia)、创伤(trauma)、出血(hemorrhage)的继发的多器官损伤、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜疾病、抗磷脂抗体综合征、过敏性神经炎、白塞病(bechet's或behcet's disease)、castlema综合征(castleman's syndrome)、肺出血-肾炎综合征(goodpasture's syndrom)、雷诺氏综合征(raynaud's syndrome)、干燥综合征(sjogren's syndrome)、史提芬-强生症候群(stevens-johnson syndrome)、如大疱性类天疱疮(pemphigoid bullous)及皮肤类天疱疮(skin pemphigoid)的类天疱疮(pemphigoid)、天疱疮(pemphigus)[包括寻常型天疱疮(pemphigus vulgaris)、落叶型天疱疮(pemphigus foliaceus)、天疱疮粘膜类天疱疮(pemphigus mucous-membrane pemphigoid)及红斑型天疱疮(pemphigus erythematosus)]、自身免疫性多内分泌腺病(autoimmune polyendocrinopathies)、瑞特综合征(reiter's disease)或综合征、免疫复合物性肾炎、抗体介导的肾炎、视神经脊髓炎(neuromyelitis optica)、多发性神经病(polyneuropathies)、如免疫球蛋白m多发性神经
lymphocytosis)、周围神经病变(peripheral neuropathy)、副肿瘤综合征(paraneoplastic syndrome)、癫痫(epilepsy)、偏头痛(migraine)、心律失常(arrhythmia)、肌肉疾病、耳聋(deafness)、失明(blindness)、周期性麻痹(periodic paralysis)及如中枢神经系统离子通道病的离子通道病(channelopathies)、自闭症(autism)、炎症性肌病(inflammatory myopathy)、局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis；fsgs)、内分泌性眼病(endocrine ophthalmopathy)、葡萄膜视网膜炎(uveoretinitis)、脉络膜视网膜炎(chorioretinitis)、自身免疫性肝病(autoimmune hepatological disorder)、纤维肌痛(fibromyalgia)、多发性内分泌衰竭(multiple endocrine failure)、施密特综合征(schmidt's syndrome)、肾上腺炎(adrenalitis)、胃萎缩(gastric atrophy)、早老性痴呆(presenile dementia)、如自身免疫性脱髓鞘性疾病(autoimmune demyel mating diseases)的脱髓鞘性疾病(demyelinating diseases)、糖尿病性肾病(diabetic nephropathy)、德雷斯勒氏综合征(dressler's syndrome)、斑秃(alopecia areata)、crest综合征(钙质沉着(calcinosis)、雷诺氏现象(raynaud's phenomenon)、食管运动功能障碍(esophageal dysmotility)、指端硬化(sclerodactyl)和毛细管扩张征(telangiectasia))、男女不孕不育症、混合性结缔组织病、恰加斯氏病(chagas'disease)、风湿热(rheumatic fever)、复发性流产(recurrent abortion)、农民肺(farmer's lung)、多形性红斑(erythema multiforme)、心脏切开后综合征(post-cardiotomy syndrome)、库欣综合征(cushing's syndrome)、饲鸟者肺(bird-fancier's lung)、过敏性肉芽肿性血管炎(allergic granulomatous angiitis)、良性淋巴细胞血管炎(benign lymphocytic angiitis)、alport综合征(alport's syndrome)、如过敏性肺泡炎及纤维性骨膜炎的肺泡炎(alveolitis)、间质性肺病(interstitial lung disease)、输血疾病、麻风病(leprosy)、疟疾(malaria)、利什曼病(leishmaniasis)、锥虫病(trypanosomiasis)、血吸虫病(schistosomiasis)、蛔虫病(ascariasis)、曲霉病(aspergillosis)、sampter综合征(samter's syndrome)、卡普兰综合征(caplan's syndrome)、登革热(dengue)、心内膜炎(endocarditis)、心内膜心肌纤维化(endomyocardial fibrosis)、弥漫性肺间质纤维化(diffuse interstitial pulmonary fibrosis)、肺间质纤维化(interstitial lung fibrosis)、特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis)、囊性纤维化(cystic fibrosis)、眼内炎(endophthalmitis)、持久性隆起性红斑(erythema elevatum et diutinum)、胎儿成红细胞增多病(erythroblastosis fetalis)、嗜酸性筋膜炎(eosinophilic fasciitis)、舒尔曼综合征(shulman's syndrome)、felty综合征(felty's syndrome)、丝虫病(flariasis)、如慢性睫状体炎、异色性慢性睫状体炎、虹膜睫状体炎(iridocyclitis)或异色性虹膜睫状体炎(fuch's cyclitis)的睫状体炎(cyclitis)、过敏性紫癜(henochschonlein综合征(henoch-schonlein purpura))、人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus；hiv)感染、echo病毒感染、心肌病(cardiomyopathy)、阿尔茨海默病(alzheimer's disease)、细小病毒感染(parvovirus infection)、风疹病毒感染(rubella virus infection)、接种后综合征(post-vaccination syndromes)、先天性风疹感染、eb病毒感染(epstein-barr virus infection)、腮腺炎(mumps)、evan综合征(evan's syndrome)、自身免疫性腺衰竭(autoimmune gonadal failure)、sydenham舞蹈病(sydenham's chorea)、链
球菌感染后肾炎(poststreptococcal nephritis)、血栓闭塞性脉管炎(thromboangiitis obliterans)、甲状腺毒症(thyrotoxicosis)、脊髓痨(tabes dorsalis)、脉络膜炎(chorioiditis)、巨细胞性多肌痛(giant cell polymyalgia)、内分泌性眼病(endocrine ophthamopathy)、慢性过敏性肺炎(chronic hypersensitivity pneumonitis)、干燥性角结膜炎(keratoconjunctivitis sicca)、流行性角结膜炎、特发性肾病综合征(idiopathic nephritic syndrome)、微小病变性肾病(minimal change nephropathy)、良性家族性(benign familial)及缺血-再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury)、自身免疫性视网膜病变(retinal autoimmunity)、关节炎(joint inflammation)、支气管炎(bronchitis)、慢性阻塞性气道疾病(chronic obstructive airway disease)、矽肺(silicosis)、口疮(aphthae)、阿弗他口炎(aphthous stomatitis)、动脉硬化性疾病(arteriosclerotic disorders)、无精子产生症(aspermatogenesis)、自身免疫性溶血(autoimmune hemolysis)、boeck病(boeck's disease)、冷球蛋白血症(cryoglobulinemia)、杜普伊特伦挛缩(dupuytren's contracture)、晶状体过敏性眼内炎(endophthalmia phacoanaphylactica)、过敏性肠炎(enteritis allergica)、麻风结节性红斑(erythema nodosum leprosum)、特发性面神经麻痹(idiopathic facial paralysis)、慢性疲劳综合征(chronic fatigue syndrome)、风湿热(febris rheumatica)、hamman-rich综合征(hamman-rich's disease)、感觉神经性听力损失(sensoneural hearing loss)、阵发性血红蛋白尿(haemoglobinuria paroxysmatica)、性腺机能减退(hypogonadism)、局限性回肠炎(ileitis regionalis)、白细胞减少症(leucopenia)、传染性单核细胞增多症(mononucleosis infectiosa)、横贯性脊髓炎(traverse myelitis)、原发性特发性黏液水肿(primary idiopathic myxedema)、肾病(nephrosis)、交感性眼炎(ophthalmia symphatica)、肉芽肿性睾丸炎(orchitis granulomatosa)、胰腺炎(pancreatitis)、急性多神经根炎(polyradiculitis acuta)、坏疽性脓皮病(pyoderma gangrenosum)、quervain甲状腺炎(quervain's thyreoiditis)、获得性脾萎缩(acquired spenic atrophy)、抗精子抗体导致的不育症(infertility due to antispermatozoan antobodies)、非恶性胸腺瘤(non-malignant thymoma)、白癜风(vitiligo)、scid和eb病毒相关疾病(epstein-barr virus-associated diseases)、获得性免疫缺陷综合症(acquired immune deficiency syndrome；aids)、如利什曼原虫病(leishmania)的寄生虫疾病、中毒性休克综合征(toxic-shock syndrome)、食物中毒(food poisoning)、与t细胞浸润的疾病、白细胞粘附缺陷、与细胞因子及t淋巴细胞介导的急性及迟发性超敏感性有关的免疫应答、白细胞渗出相关疾病、多器官损伤综合征(multiple organ injury syndrome)、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜病(antiglomerular basement membrane disease)、过敏性神经炎(allergic neuritis)、自身免疫性多内分泌腺病(autoimmune polyendocrinopathies)、卵巢炎、原发性粘液性水肿(primary myxedema)、自身免疫性萎缩性胃炎(autoimmune atrophic gastritis)、交感性眼炎(sympathetic ophthalmia)、风湿性疾病(rheumatic diseases)、混合性结缔组织病、肾病综合征(nephrotic syndrome)、胰岛炎(insulitis)、多内分泌衰竭(polyendocrine failure)、周围神经病变(peripheral neuropathy)、自身免疫性多内分泌腺病综合征i型(autoimmune polyglandular syndrome type i)、成年发病型特发性甲状旁腺功能减退症
purpura)、原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis)、硬皮病(scleroderma)、白癜风(vitiligo)、恶性贫血(pernicious anemia)及乳糜泻(celiac disease)组成的组中。
[0092]
所述炎症性疾病可选自由关节炎(arthritis)、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)、反应性关节炎(reactive arthritis)、瑞特综合征(reiter's syndrome)、晶体性关节病(crystal arthropathies)、莱姆病(lyme disease)、风湿性多肌病(polymyalgia rheumatica)、系统性硬化症(systemic sclerosis)、多肌炎(polymyositis)、皮肌炎(dermatomyositis)、结节性多动脉炎(polyarteritis nodosa)、韦格纳肉芽肿病(wegener's granulomatosis)、变应性肉芽肿性血管炎(churg-strauss syndrome)、结节病(sarcoidosis)、粥样硬化血管疾病(atherosclerotic vascular disease)、动脉粥样硬化(atherosclerosis)、缺血性心脏病(ischaemic heart disease)、心肌梗塞(myocardial infarction)、脑卒中(stroke)、周围血管疾病(peripheral vascular disease)、葡萄膜炎(uveitis)、角膜疾病(cornealdisease)、虹膜炎(iritis)、虹膜睫状体炎(iridocyclitis)及白内障(cataracts)组成的组中。
[0093]
所述移植排斥疾病可以为组织或器官的移植排斥反应，所述组织或器官的移植排斥反应可选自骨髓移植、心脏移植、角膜移植、肠移植、肝移植、肺移植、胰腺移植、肾脏移植及皮肤移植中的排斥反应。
[0094]
本发明的术语“炎症性皮肤疾病”指通过炎症反应在皮肤中发生的疾病。皮肤角质形成细胞作为构成大部分表皮细胞的成分，形成角质并生产多种细胞因子参与多种炎症反应和免疫反应。如果皮肤角质形成细胞暴露在环境、生理的压力下，则引起炎症反应，由此，分泌各种炎症细胞因子，诸如肿瘤坏死因子-α(tnf-α，tumor necrosis factor-α)、白细胞介素-1β(il-1β，interleukin-1β)、白细胞介素-6(il-6)及趋化因子配体(ccl，chemokine(c-c motif)ligand)。这种细胞因子降低皮肤角质形成细胞的增殖速度，通过妨碍真皮层基质的形成，从而降低受损的皮肤的治愈速度。因此，在炎症性皮肤疾病中，皮肤角质形成细胞的增殖起到重要作用，与炎症性皮肤疾病，诸如皮肤老化、特应性皮炎、银屑病等有密切相关。因此，所述炎症性皮肤疾病可以是银屑病或特应性皮炎，优选地，可以是银屑病。
[0095]
本发明的术语“银屑病”指皮肤被银白色的鳞屑覆盖且边界明显、形成大小不同的红斑性丘疹及斑块的疾病。在组织学上具有上皮的过度增殖为特征，显示出多种临床表现，是反复恶化和好转的慢性炎症性皮肤疾病中的一种。
[0096]
所述药物组合物的优选剂量根据患者的状态及体重、患病程度、药物形态、施用途径及时间不同，但本领域技术人员可适当选择。在根据本发明的用于治疗或预防银屑病的药物组合物中，只要其有效成分表现出银屑病治疗活性，可根据用途、剂型、配制目的等包含任意量(有效量)，以组合物的总重量为基准，常规的有效量可确定在0.001重量％至20.0重量％的范围内。其中，“有效量”是指可引导银屑病治疗(treatment)效果的有效成分的量。这种有效量可在本领域技术人员的常规能力范围内通过实验确定。
[0097]
本发明的术语“治疗”可以使用包括治疗处理及预防处理的两者的含义。此时，预防可以使用指缓解或减少个体的病理状态或疾病。在一个实施方案中，术语“治疗”包含在包括人的哺乳类中用于治疗疾病的应用或任何形式的施用。并且，所述术语的含义包括：抑制或减缓疾病或疾病的进展；通过恢复或修复损伤或缺失的功能来部分缓解或完全缓解疾病；而且，刺激效率低的流程；缓解严重的疾病。
[0098]
其中，“治疗有效量”或“药用有效量”作为用于预防或治疗目标疾病有效的化合物或组合物的量，意味着能够应用于医学治疗的足以以合理的效益/风险比例治疗疾病而不引起副作用的量。所述有效量的水平可根据患者的健康状态、疾病的种类、严重程度、药物活性、对于药物的敏感度、施用方法、施用时间、施用途径及包括排泄比例、治疗时间、配制或同时使用的药物的要素及其他医学领域周知的要素确定。在一个实施方案中，治疗有效量是指用于有效治疗银屑病的药物的量。
[0099]
本发明的组合物可包含药学上可接受的载体，除了所述载体外，还可包含药学上可接受的助剂、赋形剂或稀释剂。
[0100]
本发明的术语“药学上可接受的”是指在生理上可接受并且当施用于人时通常不引起过敏性反应例如胃肠病症、或头晕或类似反应的组合物。作为所述载体、赋形剂和稀释剂的实例，可举例乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁及矿物油。并且，还可包括填充剂、抗结剂、润滑剂、湿润剂、香料、乳化剂及防腐剂等。
[0101]
本发明的药物组合物可使用本领域公知的方法配制，以当施用于哺乳动物时，可迅速释放或持续释放或延迟释放活性成分。剂型包括粉末、颗粒、片剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂、软质或硬质明胶胶囊、无菌注射溶液、无菌粉末形态。
[0102]
本发明的组合物可与药学上可接受的载体一同以适当制剂进行配制。药学上可接受的载体的实例包括用于肠胃外施用载体，诸如水、适当的油、盐水、水溶性葡萄糖及乙二醇等，还可包括稳定剂及防腐剂。作为适当的稳定剂包括抗氧化剂，诸如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸。作为适当的防腐剂包括苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯及氯丁醇。并且，基于其施用方法或剂型，需要时，根据本发明的组合物可适当包含悬浮剂、助溶剂、稳定剂、等渗剂、防腐剂、吸附抑制剂、表面活性剂、稀释剂、赋形剂、ph调节剂、无痛剂、缓冲剂、抗氧化剂等。在文献《雷明登氏药学全书(remington's pharmaceutical sciences，最新版)》中详细记载了包括上述示例在内的适合于本发明的药学上可接受的载体及制剂。
[0103]
本发明的组合物可通过常规公知的灭菌技术进行灭菌。组合物可包括为了生理条件的调节例如ph值的调节所需的药学上可接受的辅助物质及助剂、毒性调节制剂及其类似物，例如，包括乙酸钠(sodium acetate)、氯化钠(sodium chloride)、氯化钾(potassium chloride)、氯化钙(calcium chloride)、乳酸钠(sodium lactate)等。在这种剂型中，融合蛋白的浓度可以有各种不同，例如，根据重量，可以约小于等于0.5％，通常或至少可以是约1％至15％或20％，可根据所选择的特定施用方法，可优先基于体液体积、粘度(viscosities)等选择。
[0104]
根据患者的状态、体重、性别、年龄、患者的严重程度、施用途径，对于本发明的组合物的优选施用量可在1天0.01μg/kg至10g/kg的范围或者0.01mg/kg至1g/kg的范围内。可一天一次或分为多次施用。在任何方面，这种施用量不应解释为限制本技术的范围。
[0105]
本发明的组合物可应用(处方)于哺乳动物和人，尤其，优选为人。根据患者的状态及副作用的有无，所述融合蛋白或融合蛋白二聚体的施用途径、施用量及施用次数可通过多种方法及用量施用于目标对象，本领域技术人员能够以适当范围选择最佳施用方法、施
用量及施用次数。
[0106]
本发明的组合物可通过任何途径施用。本发明的组合物能够直接地(例如，向组织部位注射、移植或局部施用，局部地)或系统地(例如，肠胃外或口服地)通过任意适当的手段提供给动物。本发明的组合物以肠胃外施用的形式提供时，诸如静脉内、皮下、眼(ophthalmic)、腹腔内、肌肉内、口腔、直肠、眼眶内(intraorbital)、大脑内(intracerebral)、颅内(intracranial)、脊椎内(intraspinal)、脑室内(intraventricular)、鞘内(intrathecal)、脑池内(intracisternal)、囊内(intracapsular)、鼻腔内(intranasal)或气雾剂，优选地，组合物包含水性(aqueous)或生理学上可适用的体液悬浮液或溶液的一部分。由此，载体或载体(vehicle)在生理上可接受，从而可添加在组合物来传递给患者，这对患者的电解质和/或体积平衡(balance)没有不利影响。因此，作为用于制剂的体液介质，通常可包含生理盐水(physiologic saline)。
[0107]
将包含对本发明的融合蛋白进行编码的核酸的脱氧核糖核酸结构体(或基因结构体)可用作携带对所述融合蛋白结构进行编码的核酸的基因治疗方案的一部分。
[0108]
本发明在特定细胞类型中，将在生物体内感染和表达所述融合蛋白的表达载体与任意生物学有效载体一同施用，使得所需所述融合蛋白的功能重建或补充，例如，其可以是能够有效地转运对生物体内细胞所需的融合蛋白进行编码的基因或其融合蛋白的任意剂型或组合物等。
[0109]
可在包括重组逆转录酶病毒、腺病毒、腺相关病毒及单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus-1)在内的病毒载体或重组病毒质粒或重组真核质粒内插入目标对象基因，用于利用对所述融合蛋白进行编码的核酸的基因治疗。
[0110]
对本发明的融合蛋白进行编码的核酸的人体施用量在0.1mg至100mg的范围内，优选为1mg至10mg，更优选为2mg至10mg。可通过属于本领域技术水平的常规实验确定最佳施用量及施用形式。
[0111]
本发明的融合蛋白的人体单位剂量是0.1mg/kg至1500mg/kg，优选为1mg/kg至100mg/kg，更优选为5mg/kg至20mg/kg。单位剂量可根据治疗目标对象的疾病及副作用的有无而不同。然而，可通过常规实验确定最佳剂量。融合蛋白的施用可通过定期的快速浓注(periodic bolus injections)或从外侧供给源(external reservoir)(例如，静脉输液袋(intravenous bag))或内侧(例如，生物可降解植入物(bioerodable implant))的持续性静脉内、皮下或腹膜内施用进行。
[0112]
本发明的组合物可与具有对于所要预防或治疗的疾病的预防或治疗效果的其他药物或生理学活性物质组合施用，或者能够以与所述其他药物的组合制剂(combination formulation)形式进行配制。
[0113]
采用本发明的融合蛋白或组合物来预防或治疗疾病的方法还可包括将本发明的融合蛋白或组合物与具有疾病的预防或治疗效果的其他药物或生理学活性物质组合施用，可根据疾病的种类、患者的疾病状态、治疗或预防的目的及组合的其他药物或生理学活性物质确定组合施用的途径、施用时间及施用量。
[0114]
并且，本发明提供包含程序性细胞死亡配体1蛋白及修饰免疫球蛋白的fc区域的融合蛋白的用途，用于生产具有免疫疾病的预防或治疗效果的医药制剂。
[0115]
并且，本发明提供免疫疾病的预防或治疗方法，包括将包含程序性细胞死亡配体1
cloning)。简而言之，在96孔板(well plate)中接种细胞，使其为1cell/well后，在第0天、第7天及第14天，利用克隆筛选成像仪(clone selection imager，molecular devices)存储细胞图像，并逆向查找来源于一个细胞的克隆(clone)。利用fc酶联免疫吸附试验(fc elisa)(人免疫球蛋白g酶联免疫吸附试验试剂盒(human igg elisa quantitation set)，bethyl，e80-104)确认了筛选的来源单细胞(single cell)细胞株的生产性。对最终筛选的5～6个克隆进行分批培养(batch culture)和长期稳定性评价，将确认稳定性的克隆制备为研究细胞库(rcb，research cell bank)。
[0124]
实施例2.确保程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白
[0125]
为了大量生产程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白，从在所述实施例1中获得的程序性细胞死亡配体1-hyfc5或从利用程序性细胞死亡配体1-hyfc21悬浮细胞株生产的细胞培养液分离出及纯化目标蛋白。
[0126]
为了大量获得程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白，通过相同的补料分批培养(fed-batch culture)法在15l的玻璃生物反应器(glass bioreactor)20天中培养程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白的表达细胞株，从而生产程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白。当进行补料分批培养时，测量了表达融合蛋白的细胞株的细胞生存率，为了确认目标蛋白的最终表达量及纯度，执行了尺寸排阻高效液相色谱法(se-hplc)。
[0127]
确认表达细胞株的不同时间的最大细胞浓度及融合蛋白的最终表达量的结果，确认了程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白的表达细胞株的不同时间的最大细胞浓度为13.9
×
106cells/ml(图2a)，最终回收的融合蛋白的表达量为5.6g/l(图2b)。与之相比，经确认，程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白的表达细胞株的不同时间的最大细胞浓度为16.7
×
106cells/ml(图3a)，最终回收的融合蛋白的表达量为2.2g/l(图3b)。
[0128]
并且，确认融合蛋白的纯度的结果，确认了程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白的纯度为79.5％，包括7.7％的高分子杂质(hmw)、9.8％的低分子杂质(lmw)(表1)。与之相比，经确认，程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白的纯度为47.8％，包含31.7％的高分子杂质、20.5％的低分子杂质(表1)。
[0129]
【表1】
[0130][0131]
*hmw：高分子杂质(high molecular weight impurity)；main：目标蛋白(target protein)；以及lmw：低分子杂质(low molecular weight impurity)。
[0132]
之后，为了获得高纯度的程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白，执行了以下3个步骤的纯化工序：培养液＝》蛋白a亲和层析(protein a affinity chromatography)＝》阴离子交换层析1(anion exchange chromatography 1)＝
》阴离子交换层析2(anion exchange chromatography 2)＝》超滤/渗滤。
[0133]
通过尺寸排阻高效液相色谱法(se-hplc)分析确认了所获得的目标蛋白的纯度及收获率。结果，程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白的纯度为97.3％且收率为30.2％。与之相比，经确认，程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白的纯度为93.2％且收率为5.1％(表2)。
[0134]
【表2】
[0135][0136]
由所述结果可确认，相比于程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白，程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白显示出高约2.5倍的生产量，蛋白质的纯度也高。
[0137]
实施例3.程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白的特性分析
[0138]
3.1.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，sds-page)
[0139]
为了确认纯化的程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白的分子量，执行了十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，sds-page)。简而言之，利用去离子水稀释融合蛋白，与nupage
tm
lds样品缓冲液(sample buffer)(赛默飞世尔科技(thermo fisher scientific))混合并加载(loading)至4～12％的bis-tris凝胶(gel)(invitrogen)执行电泳，使其成为3μg/well。通过考马斯染色法对结束电泳的凝胶进行染色。
[0140]
结果，在非还原条件(non-reducing condition)下，在大小标记(size marker)98kda附近确认了纯化的程序性细胞死亡配体1-hyfc21及程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白(图4)两者。但是，纯化的程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白中包括切割形态的低分子杂质。
[0141]
3.2.尺寸排阻高效液相色谱法(size-exclusion chromatography，se-hplc)
[0142]
为了在纯化的程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白中分析杂质峰值，诸如主峰值及二聚体、多聚体或切割形态的异常肽等，执行了尺寸排阻高效液相色谱法(size-exclusion chromatography，se-hplc)。简而言之，利用剂型缓冲液稀释融合蛋白制备成1.0mg/ml后，利用凝胶过滤色谱柱(tosoh tsk-gel g3000swxl column,7.8mm
×
300mm)分析了分离的峰值中融合蛋白的主峰值的面积比(％area)。
[0143]
结果，经确认，程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白的纯度为97.3％(图5a)，与之相比，程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白的纯度为93.2％(图5b)。
[0144]
3.3.等电聚焦电泳(isoelectric focusing，ief)
[0145]
为了确认纯化的程序性细胞死亡配体1-hyfc5及程序性细胞死亡配体1-hyfc21蛋白的电荷变异(charge variants)及分布(distribution)，执行了等电聚焦电泳。等电聚焦
电泳是利用蛋白质具有的pi值分析分离的蛋白质的电泳法，pi值是带电荷的蛋白质变为带电中性时的ph值，将其称为等电点。在等电点电泳中，达到等电点的蛋白质不再移动，停留在凝胶(gel)上并被分离。简而言之，在本发明中，利用ph值为3～10的等电点凝胶(invitrogen)，根据pi值分离了融合蛋白，利用12％的三氯乙酸(tca，trichloroacetic acid)溶液固定电泳结束的凝胶后，通过考马斯染色法进行染色。
[0146]
结果，经确认，程序性细胞死亡配体1-hyfc21及程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白的pi值均在5.2～6.0范围内(图6)。
[0147]
3.4.差示扫描荧光法(differential scanning fluorimetry，dsf)
[0148]
为了分析纯化的程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白的热稳定性，利用热移动稳定性分析试剂盒执行实验。分析试剂盒包含用于检测蛋白凝聚的荧光染料，可在热应激条件下，确认大量蛋白质凝聚的温度。凝聚温度(tagg)作为蛋白质稳定性的指标，可确认蛋白质结构的稳定性。
[0149]
结果，经确认，程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白的凝聚温度为55.8℃，与之相比，程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白的凝聚温度为50.7℃(图7)。由此可确认，在结构上，相比于程序性细胞死亡配体1-hyfc5，程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白的热稳定性更优秀。
[0150]
实施例4.程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白的试管内(in vitro)活性分析
[0151]
4.1.对于利用表达程序性死亡受体1的jurkat(shp-1)细胞株的程序性死亡受体1的结合能力分析
[0152]
利用表达程序性死亡受体1的jurkat(shp-1)细胞株分析了程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白对程序性死亡受体1的结合能力。简而言之，在96-孔板中接种jurkat细胞(jurkat pd-1(shp-1)，discoverx)，在37℃的5％co2培养箱中稳定化2小时。之后，分别添加程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白来使其成为75nm及600nm，然后，在37℃的5％co2培养箱中反应1小时。反应结束后，添加通过程序性死亡受体1：程序性细胞死亡配体1信号响应(signaling response)表达的检测shp-1的试剂(bioassay detection kit,discoverx)来测定shp-1的发光程度(luminescence)。
[0153]
结果，相比于程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白处理组，在程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白处理组中，在75nm及600nm的浓度下，所有shp-1的发光程度高(图8)。由此可确认，相比于程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白，程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白对程序性死亡受体1的结合能力更高，尤其，随着浓度的增加，对程序性死亡受体1的结合能力进一步增加。
[0154]
4.2.混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction)的抑制能力分析
[0155]
分析了通过程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白的混合淋巴细胞反应的抑制能力。简而言之，准备供体和受体的外周血单个核细胞(pbmc，peripheral blood mononuclear cells)，并实施对细胞内蛋白质进行染色的ctv(celltracetm violet)及ctr(celltracetm far red)染色。将各个供体及受体外周血单个
核细胞作为反应细胞和刺激细胞，以1:1的比例混合并添加至96-孔u形底板(well u-bottom)，添加0.5μm的程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白，然后，在37℃的5％co2培养箱中反应5天。在反应结束的细胞中，分析染色在反应细胞的ctv(celltracetm violet)的荧光减少的程度，从而比较了通过程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白抑制混合淋巴细胞反应的程度。
[0156]
结果，经确认，相比于对照组(allo、hyfc处理组)，在程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白处理组中，通过混合淋巴细胞反应活性化的反应细胞的cd4 t细胞和cd8 t细胞的增殖(proliferation)减少(图9)。尤其，经确认，在相同浓度条件下，相比于程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白处理组，在经程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白处理组中，活性化的反应细胞的cd4 t细胞和cd8 t细胞的增殖进一步显著减少(图9)。
[0157]
4.3.活性化的人t细胞的增殖抑制能力(proliferation inhibition)及细胞因子表达抑制能力(cytokine production inhibition)分析
[0158]
在t细胞活性化条件下，利用人外周血单个核细胞比较了通过程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白的人t细胞的增殖抑制能力。简而言之，在96孔板中将程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白与抗-cd3抗体一起处理，在4℃的温度下涂敷1天。利用微珠(microbead，macs)从正常人的外周血单个核细胞分离cd4t细胞后，实施对所分离的cd4 t细胞进行细胞内蛋白质染色的ctv(celltracetm violet，2.5μm)染色。利用磷酸盐缓冲液(pbs)清洗完成涂敷的板，然后将以ctv染色的cd4 t细胞放入试验板，在37℃的5％co2培养箱中培养3天。4天后，回收试验板的细胞，并利用流式细胞仪(flow-cytometry)分析了ctv的荧光减少程度。
[0159]
结果，经确认，相比于对照组(未处理(no treatment)或hyfc处理组)，在程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白处理组中，活性化的人t细胞的增殖(proliferation)减少(图10a)。尤其，经确认，相比于程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白处理组，在经程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白处理组中，活性化的人t细胞的增殖显著抑制约2倍左右(图10a)。
[0160]
并且，在t细胞活性化条件下，利用人外周血单个核细胞比较了通过程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白的人t细胞的细胞因子表达抑制能力。简而言之，将程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合与抗-cd3抗体一起稀释处理为0.5μm，在48孔板中4℃的温度下涂敷1天。利用微珠(miltenyi biotech)从正常人外周血单个核细胞中分离cd4 t细胞。利用微珠(macs)从正常人的外周血单个核细胞分离cd4 t细胞。利用磷酸盐缓冲液清洗完成涂敷的板，然后将分离的cd4 t细胞放入试验板，在37℃的5％co2的培养箱中培养3天。将抗-干扰素-γ(ifn-γ)抗体(duoset human ifn-gamma elisa set，r&d system)放入试验板并在常温条件下涂敷。利用加入0.05％的吐温20(tween-20)的磷酸盐缓冲液(pbst)将完成涂敷的试验板清洗3次后，将加入1％的牛血清蛋白(bsa)的磷酸盐缓冲液添加，在常温条件下，阻断试验板2小时。将培养液转放入试验板的cd4细胞中，在常温条件下反应2小时。利用磷酸盐缓冲液清洗5次，添加检测抗体在常温条件下反应2小时后，再次利用磷酸盐缓冲液清洗5次。向清洗结束的试验板添加链霉亲和素-hrp(streptavidin-hrp)后，在常温条件下反应20分钟。之后，利
用磷酸盐缓冲液清洗5次，添加底物溶液(tmb substrate)，然后添加2n浓度的硫酸(h2so4)，在450nm处测定吸光度。利用测定的吸光度值，分析了通过程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白的活性化的cd4 t细胞生成的干扰素-γ生成抑制能力。
[0161]
结果，经确认，相比于对照组(未处理(no treatment)或hyfc处理组)，在程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白处理组中，活性化的人cd4 t细胞生成的干扰素-γ的量显著减少(图10b)。尤其，经确认，相比于程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白处理组，在程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白处理组中，活性化的人cd4 t细胞生成的干扰素-γ的量显著抑制约3倍左右(图10b)。
[0162]
4.4.活性化的小鼠t细胞的细胞因子表达抑制能力(cytokine production inhibition)分析
[0163]
在小鼠t细胞活性化条件下，比较了通过程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白的小鼠t细胞的细胞因子表达抑制能力。简而言之，将程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白(0.5μm)与5μg/ml的抗-cd3抗体一起放入试验板中，在4℃的温度下涂敷1天。利用微珠(miltenyi biotech)在从小鼠的淋巴结分离的淋巴细胞中分离了cd4 t细胞。利用磷酸盐缓冲液清洗所涂敷的板后，放入分离的cd4 t细胞，在37℃的5％co2培养箱中培养3天。将抗-白细胞介素-2(il-2)抗体(mouse il-2elisa maxtmdeluxe，biolegend)及抗-干扰素-γ抗体(mouseifngamma elisa maxtmdeluxe，biolegend)放入新的试验板，并在常温条件下涂敷。利用清洗缓冲液将前一天涂敷的试验板清洗4次后，添加分析稀释液a(assay diluent a)，在常温条件下阻断1小时。再次利用清洗缓冲液将试验板清洗4次后，放入了cd4 t细胞培养液，在常温条件下反应2小时。利用清洗缓冲液清洗4次后，添加检测抗体来在常温条件下震荡1小时进行反应，再次利用清洗缓冲液清洗4次。向清洗结束的试验板添加链霉亲和素-hrp后，在常温条件下反应30分钟。利用清洗缓冲液清洗5次并添加底物溶液(tmbsubstrate)，然后在阻断光的常温条件下，反应30分钟。添加反应终止液(stopsolution)，并在15分钟内在450nm处测定吸光度。利用测定的吸光度值计算了白细胞介素-2及干扰素-γ的浓度，并分析了通过程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白的活性化的cd4 t细胞生成的白细胞介素-2及干扰素-γ生成抑制能力。
[0164]
结果，经确认，相比于对照组(未处理组(no treatment)或hyfc处理组)，在程序性细胞死亡配体1-hyfc21或程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白处理组中，从活性化的小鼠cd4 t细胞生成的白细胞介素-2及干扰素-γ的量显著减少(图11)。尤其，经确认，相比于程序性细胞死亡配体1-hyfc5融合蛋白处理组，在程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白处理组中，从活性化的人cd4 t细胞生成的白细胞介素-2的量显著抑制约1.8倍左右，干扰素-γ的量显著抑制约4倍左右(图11)。
[0165]
实施例5.程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白的体内(in vivo)活性分析
[0166]
5.1.咪喹莫特(imiquimod，imq)-诱导银屑病小鼠模型中的程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白的功效评价
[0167]
银屑病发病时，树突状细胞(dendritic cells)通过toll样受体7/8(tlr7/8，toll-like receptor 7/8)活性化，咪喹莫特(imiquimod，imq)作为toll样受体7(tlr7)和
toll样受体8(tlr8)的配体，已知若在小鼠皮肤反复处理，则诱发如银屑病的炎症反应。咪喹莫特不仅参与树突状细胞，还参与作为适应性免疫细胞(adaptive immune cell)的t细胞，其中，分泌白细胞介素-17(interleukin-17)的γδt细胞(gamma delta t cell，γδt17)优先参与银屑病炎症(psoriatic inflammation)。因此，咪喹莫特-诱导银屑病小鼠模型具有与银屑病患者类似的表现型，可用作适合研发银屑病治疗剂的模型。
[0168]
简而言之，为了在小鼠动物模型诱导银屑病，每天以20mg/mouse/day向小鼠的两侧耳朵涂抹咪喹莫特乳膏6天。从涂抹咪喹莫特乳膏的第0天至试验结束日的第6天为止，每天共7天利用卡尺测量各组小鼠的耳朵厚度，以未涂抹咪喹莫特乳膏的小鼠(no treatment)的耳朵厚度为基准，比较各组的小鼠耳朵厚度变化。在第0天、第1天、第3天、第5天皮下或静脉施用程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白。或者，在试验第二天，单次静脉施用(iv)抗-白细胞介素12p40抗体(anti-il12p40 antibody)。对照组及实验组如下述表3所示。
[0169]
【表3】
[0170][0171]
结果，经确认，相比于咪喹莫特的未处理对照组(no treatment-vehicle)，在咪喹莫特处理组(img-vehicle)中，在试验结束日的第6天，耳朵厚度增加约68％(图12a)。然而，在皮下施用3mg/kg、10mg/kg及30mg/kg的程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白的组中，从第4天开始，小鼠耳朵厚度显示出差异(图12a)。尤其，相比于咪喹莫特处理组(img-vehicle)，在皮下施用最低剂量3mg/kg的程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白的组中，在试验结束的第6天，耳朵厚度抑制51％左右，相比于咪喹莫特处理组(img-vehicle)，在皮下施用中剂量及高剂量10mg/kg和30mg/kg的程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白的组中，分别示出67％及66％的抑制率(图12a)。并且，在施用10mg/kg或30mg/kg的组与施用低容量3mg/kg的组之间，根据剂量示出了显著差异，在施用10mg/kg的组与施用30mg/kg的组之间，未示出显著差异。
[0172]
并且，相比于咪喹莫特处理组(img-vehicle)，在静脉施用3mg/kg、10mg/kg及30mg/kg的程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白的组中，均确认具有如下的效果，即，到试验结束日的第6天为止，小鼠耳朵厚度显著抑制约87～92％(图12b)。
[0173]
5.2.向强力霉素(doxycycline)-诱导peli1基因转化的银屑病小鼠模型皮下施用程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白的功效评价
[0174]
为了评价慢性炎症(chronic inflammation)的银屑病小鼠模型中的程序性细胞
死亡配体1-hyfc21融合蛋白的功效，除了咪喹莫特(imiquimod，imq)-诱导银屑病小鼠模型之外，本发明人还利用了通过施用强力霉素(doxycycline)进行转化，使peli1(pellino同系物1(pellino homolog 1))基因过度表达，诱发长期慢性银屑病症状的银屑病小鼠模型(以下，为“rtta-peli1银屑病小鼠模型”)。rtta-peli1银屑病小鼠模型随着银屑病的发作，诱发上皮(epidermis)的银屑病病变的发生、炎症反应的增加，诸如炎症性细胞因子(inflammatory cytokine)的增加、上皮细胞层的增加以及在真皮中巨噬细胞、树突状细胞及th17细胞的浸润增加。
[0175]
简而言之，为了对小鼠诱导银屑病，给4周龄小鼠饮用6个月的包含5％蔗糖(sucrose)和2mg/ml的强力霉素的饮用水。在试验期间，也持续供给包含强力霉素的盐水。将未经peli基因转化的小鼠(以下，“rtta”)用作对照组。在8周的时间内，每周1次皮下施用程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白。
[0176]
首先，向rtta-peli1银屑病小鼠模型皮下施用程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白之后，执行了通过苏木精-伊红染色测定皮肤上皮组织的变化及皮肤上皮层的厚度的实验。以200
×
的倍率观察苏木精-伊红染色结果，任选定各个照片的6个部分并测定。结果，经确认，在未诱发银屑病的对照组(rtta)中，上皮层的平均厚度为8.74μm，在诱发银屑病的rtta-peli1组(rtta-peli1 vehicle)中，上皮层的平均厚度为48.56μm，相比于对照组，在诱发银屑病的rtta-peli1组(rtta-peli1 vehicle)中，上皮层的厚度增加约5.6倍左右(图13a及图13b)。然而，经确认，在皮下施用3mg/kg、10mg/kg及30mg/kg的程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白的组中，上皮层的平均厚度分别为38.29μm、40.18μm及31.74μm，相比于诱发银屑病的rtta-peli1组(rtta-peli1 vehicle)，具有上皮层的厚度减少的效果(图13a及图13b)。但是，未示出剂量依赖性效果。
[0177]
并且，向rtta-peli1银屑病小鼠模型皮下施用程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白之后，通过免疫荧光染色法执行了比较t细胞及巨噬细胞(macrophage)浸润至真皮层的程度的实验。为了检测t细胞，使用了抗-cd3抗体，为了检测巨噬细胞，使用了抗-f4/80抗体。通过免疫荧光显微镜的400
×
倍率观察结果并计算相同面积内的细胞数量。
[0178]
结果，经确认，在未诱发银屑病的对照组(rtta)中，t细胞和巨噬细胞几乎未浸润至皮肤组织，在诱发银屑病的rtta-peli1组(rtta-peli1 vehicle)中，浸润至皮肤组织的t细胞及巨噬细胞的数量增加(图14)。尤其，经确认，在诱发银屑病的rtta-peli1组(rtta-peli1 vehicle)中，浸润至皮肤组织的t细胞的数量约为47个(图15)。然而，经确认，在皮下施用3mg/kg、10mg/kg及30mg/kg的程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白的组中，浸润至皮肤组织的t细胞的数量分别约为32个、14个及7个，剂量依赖性地显著减少了浸润的t细胞的数量(图15)。
[0179]
并且，向rtta-peli1银屑病小鼠模型皮下施用程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白之后，通过利用抗-角蛋白14(k14)抗体的免疫荧光染色法分析了皮肤组织中的角蛋白生成细胞的变化。在负责增殖的基底层(basal layer)示出角蛋白(k14，keratin 14)的表达，它们的表达增加可解释为在角蛋白生成细胞中负责增殖的细胞增加。测定相同面积内的细胞数量并进行比较结果。结果，在未诱发银屑病的对照组(rtta)中，k14
+
角蛋白生成细胞的数量为59个，在诱发银屑病的rtta-peli1组(rtta-peli1 vehicle)中，角蛋白生成细胞的数量为197个，相比于对照组，在诱发银屑病的rtta-peli1组中，角蛋白生成细胞的数
17a)、白细胞介素-22(il-22)的信使核糖核酸表达增加的状态，然而，在静脉施用程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白的组中，th17细胞-相关基因的信使核糖核酸表达减少(图20)。并且，与之类似地，相比于对照组(rtta)，在诱导银屑病的rtta-peli1组(rtta-peli1 vehicle)中，示出先天性免疫细胞-相关基因，诸如白细胞介素-1β(il-1β)、白细胞介素-24(il-24)的信使核糖核酸表达增加的状态，然而，在静脉施用程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白的组中，示出th17细胞-相关基因的信使核糖核酸表达减少的趋势(图20)。尤其，在静脉施用10mg/kg的程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白的组中，白细胞介素-24信使核糖核酸的表达显著减少(图20)。
[0185]
从所述结果可确认，程序性细胞死亡配体1-hyfc21融合蛋白具有如下的效果：通过皮下施用或静脉施用，抑制作为在如银屑病的自身免疫性疾病的病因中的重要因素的cd4 t细胞的增殖，抑制伴随病变的炎症性细胞因子的表达，从而可用作如银屑病的免疫疾病的治疗剂。