胆酸与氨基糖苷联用在制备抗金黄色葡萄球菌药物中的应用

1.本发明涉及抗金黄色葡萄球菌药物技术领域，更具体地说是涉及胆酸与氨基糖苷联用在制备抗金黄色葡萄球菌药物中的应用。


背景技术：

2.金黄色葡萄球菌是临床上常见的毒性较强的细菌，自首次发现以来，在全球的影响范围逐年递增。临床上针对金黄色葡萄球菌感染多采用抗生素疗法，代表药有糖肽类万古霉素和噁唑烷酮类利奈唑胺。近年来国内外有关耐万古霉素金黄色葡萄球菌和耐利奈唑胺金黄色葡萄球菌的临床分离株多有报道，这些抗生素对金黄色葡萄球菌的敏感性降低，且其价格昂贵、毒副作用强，使用限制多，在临床治疗中逐渐显示出不足之处。积极探索新的药物替代治疗方案已成为目前有效应对金黄色葡萄球菌感染的紧迫任务。
3.氨基糖苷类抗生素是广谱杀菌抗生素，包括庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素和新霉素。氨基糖苷类药物的治疗窗较窄，可产生毒性，包括肾毒性和耳毒性，可导致永久性听力损失，这种效应与治疗的剂量和持续时间有关，并因肾脏或肝脏损害或两者兼有而加剧，在老年人和新生儿中更可能发生。为降低全身用氨基糖苷类药物的耳毒性风险，需要定期进行血清浓度监测，以维持氨基糖苷水平低于耳蜗-前庭系统的毒性阈值。因此，氨基糖苷类药物的可利用途径受到限制。
4.因此，如何将氨基糖苷类抗生素与其他抗生素联用，以降低金黄色葡萄球菌的耐药性，降低药物毒性，提高治疗效果是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了一种通过抗生素与胆酸类化合物联合使用来杀灭金黄色葡萄球菌的方法，相比单独施用的抗生素，联合施用抗生素和胆酸具有显著提升杀菌效果或降低抗生素的用量的作用。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.胆酸与氨基糖苷联用在制备抗金黄色葡萄球菌药物中的应用。
8.作为上述技术方案优选的技术方案，胆酸能增强金黄色葡萄球菌细胞膜通透性，并协同增强氨基糖苷杀菌能力。
9.作为上述技术方案优选的技术方案，胆酸与氨基糖苷联用能消除金黄色葡萄球菌生物被膜。
10.作为上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种抗金黄色葡萄球菌的药物，包括胆酸与氨基糖苷，且两者的浓度比为1:1/64～1/64:1。
11.作为上述技术方案优选的技术方案，胆酸包括熊去氧胆酸或鹅去氧胆酸。
12.作为上述技术方案优选的技术方案，氨基糖苷包括：依替米星、阿米卡星、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素中的任意一种。
13.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明以胆酸类化合物与氨基糖苷
类抗生素联合应用，可特异性杀灭金黄色葡萄球菌，其作用与万古霉素及利奈唑胺相当，且不易产生耐药性，克服了抗生素在临床应用中的不足，为临床治疗mrsa感染性疾病提供新的治疗方案。
附图说明
14.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
15.图1附图为氨基糖苷类药物联用cdca针对s.a和mrsa的抑菌实验结果图；
16.图2附图为0.5倍mic阿米卡星联合40μg/ml鹅去氧胆酸对金黄色葡萄球菌的时间杀菌曲线图；
17.图3附图为8倍mic阿米卡星联合40μg/ml鹅去氧胆酸对金黄色葡萄球菌的时间杀菌曲线图；
18.图4附图为10倍mic阿米卡星联合40μg/ml鹅去氧胆酸对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的时间杀菌曲线图；
19.图5附图为鹅去氧胆酸对金黄色葡萄球菌细胞膜电位的影响图；
20.图6附图为鹅去氧胆酸和熊去氧胆酸对金黄色葡萄球菌细胞膜通透性的影响图；
21.图7附图为阿米卡星联合鹅去氧胆酸对被消除质子动力势的金黄色葡萄球菌的时间杀菌曲线图；
22.图8附图为阿米卡星联用鹅去氧胆酸作用于形成期细菌生物被膜cv染色图；
23.图9附图为阿米卡星联用鹅去氧胆酸作用于形成期细菌生物被膜xtt染色图；
24.图10附图为阿米卡星联用鹅去氧胆酸作用于成熟期细菌生物被膜cv染色图；
25.图11附图为阿米卡星联用鹅去氧胆酸作用于成熟期细菌生物被膜xtt染色图；
26.图12附图为连续30天诱导金黄色葡萄球菌对阿米卡星耐药性图；
27.图13附图为连续30天诱导耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对阿米卡星耐药性图；
28.图14附图为杀菌72h时正常细胞数量图；
29.图15附图为阿米卡星联用鹅去氧胆酸对小克隆突变的时间杀菌曲线。
具体实施方式
30.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.本发明实施例公开了：依替米星、阿米卡星、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素分别与熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸联合使用抑制金黄色葡萄球菌(staph ylococcus aureus,s.a)atcc 25923、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicill in-resistant staphylococcus aureus，mrsa)atcc43300，150907015，151010052，18041023，180211022，180126042，171213054，171116025，171031048，170911060，170807024，170714063，161019014，
161008022，160919055，151009009，151020006，160115091，160123012，1611017，1611078，1611099，1610057，1702123，1703118的实验。
32.熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸为两种同分异构体，两者均能显著提升氨基糖苷类药物杀灭金黄色葡萄球菌(包括耐甲氧西林金葡菌)的能力。氨基糖苷类药物与鹅去氧胆酸的协同效果优于熊去氧胆酸，同时阿米卡星是现在临床最经常使用的氨基糖苷抗生素，故后续的机制研究部分均选择鹅去氧胆酸与阿米卡星联用进行示范研究。
33.实验中，用平均数
±
标准差来表示每组所得的实验数据，然后用spss12软件对其进行单因素方差分析，方差齐者用lsd进行两两比较，方差不齐的用dunnet’t3分析，以p《0.05认为有统计学意义。
34.实验菌株
35.金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus,s.a)atcc 25923，购自美国模式培养物库；
36.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，mrsa)atcc43300，购自美国模式培养物库；
37.150907015，151010052，18041023，180211022，180126042，171213054，171116025，171031048，170911060，170807024，170714063，161019014，161008022，160919055，151009009，151020006，160115091，160123012，由中国中医科学院广安门医院检验科惠赠；
38.1611017，1611078，1611099，1610057，1702123，1703118，由北京中医药大学东直门医院检验科惠赠。
39.实验试剂见表1
40.表1
41.[0042][0043]
实验仪器见表2
[0044]
表2
[0045][0046][0047]
实施例1细菌培养条件
[0048]
抑菌实验培养条件：挑取细菌金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus,s.a)或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantstaphylococcus aureus，mrsa)于mh培养基(21g/l)中，置于37℃、225rpm的恒温振荡器中培养16-18h。
[0049]
实施例2抑菌、杀菌能力测定
[0050]
(1)最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration；mic)测定
[0051]
选用液体稀释法在96孔板中加入倍比稀释的药液100μl，以及菌液100μl(约1
×
106cfu)，完成后放置37℃、80％湿度培养箱培养16-24h，每个实验均为3个生物学重复。
[0052]
(2)分级抑菌浓度(fractional inhibitory concentration；fic)测定
[0053]
选用经典棋盘法，由两种抗菌药物的不同稀释度加以组合，组合见表3；每一种药物浓度都有单独的和另一个药物不同浓度的联合。它能精确地测定两种抗菌药物在适当浓度的比例下所产生的相互作用。取50μl的抗生素及50μl的胆酸，两两组合加入96孔平板中，加入100μl菌液(约1
×
106cfu)，37℃恒温箱中培养16-24h。计算fic值。每个实验均为3个生物学重复。判断标准：分级抑菌浓度指数(fici)＝mic
甲药联合
/mic
甲药单用
+mic
乙药联合
/mic
乙药单用
。根据fic指数判读标准，fici指数≤0.5为协同作用；0.5《fici≤1为相加作用；1《fici≤2为无关作用；fic》2为拮抗作用。
[0054]
表3.阿米卡星联合鹅去氧胆酸对金黄色葡萄球菌fic实验稀释度组合
[0055]
1:1/641:1/321:1/161:1/81:1/41:1/21:11/2:1/641/2:1/321/2:1/161/2:1/81/2:1/41/2:1/21/2:11/4:1/641/4:1/321/4:1/161/4:1/81/4:1/41/4:1/21/4:11/8:1/641/8:1/321/8:1/161/8:1/81/8:1/41/8:1/21/8:11/16:1/641/16:1/321/16:1/161/16:1/81/16:1/41/16:1/21/16:11/32:1/641/32:1/321/32:1/161/32:1/81/32:1/41/32:1/21/32:11/64:1/641/64:1/321/64:1/161/64:1/81/64:1/41/64:1/21/64:1
[0056]
根据上述浓度配比，将氨基糖苷类药物联用cdca针对s.a和mrsa的抑菌实验结果，实验中的范围是1:1/64至1/64:1，很多浓度都有协同作用，但1/8：1/8时fic值最小，故我们选择1/8mic的cdca即40μg/ml这一浓度开展其他实验进行机制探讨。结果见图1；
[0057]
(3)时间杀菌曲线
[0058]
观察抗菌药物的动态杀菌过程，以时间为横坐标，菌落数为纵坐标绘制杀菌曲线，从而判定或比较抗菌药物的杀菌强弱与快慢，以及最佳杀菌浓度。其中菌落数测定方法为点滴平皿活菌计数法，在各时间点选择适当浓度涂板，最终选择菌落数在30～300个cfu的浓度平板计数。每个实验均为3个生物学重复。
[0059]
结果显示：5种氨基糖苷类药物：依替米星、阿米卡星、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素联合熊去氧胆酸或鹅去氧胆酸后抗金黄色葡萄球菌(包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)效果均显著增强，鹅去氧胆酸与氨基糖苷类抗生素的协同作用强于熊去氧胆酸，见表4、表5。鹅去氧胆酸与阿米卡星的协同作用适用于实验中全部24株临床分离株，fic范围为0.1875～0.375，见表6。40μg/ml的鹅去氧胆酸增强阿米卡星的杀菌效果，与0.5倍最小抑菌浓度阿米卡星联用在8小时使细菌数量降低约为1/1000；与8倍mic阿米卡星联用在8小时杀灭金黄色葡萄球菌至最低检测限以下；与10倍mic阿米卡星联用延长杀菌效果长达6天，并在144小时杀灭耐甲氧西林金黄色葡萄球菌至最低检测限以下，见图2～图4。
[0060]
表4氨基糖苷类药物联合熊去氧胆酸对金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的fic
[0061][0062]
表5氨基糖苷类药物联合鹅去氧胆酸对金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的fic
[0063][0064]
表6阿米卡星联合鹅去氧胆酸对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌临床株的fic
[0065][0066]
实施例2胆酸与氨基糖苷联用对金黄色葡萄球菌细胞膜通透性
[0067]
采用1-n-苯基萘胺(npn)荧光作为外膜通透性的指示剂进行细胞通透性测定。在96孔板中分别加入：(1)100μl 1
×
106细菌；(2)50μl 40mm npn；(3)50μl待测药物；所有实验物质均悬浮于5mmoll-1
hepes缓冲液(ph7.2)，室温下静置30分钟后采用酶标仪测定，滤波器激发波长355nm(带宽40nm)，发射波长405nm(带宽8nm)，结果以相对荧光强度表示，对照组为在没有npn的情况下进行荧光校正。
[0068]
细胞膜电位变化
[0069]
baclight细菌膜电位试剂盒测量细菌膜电位。金黄色葡萄球菌过夜培养物在mh培养基中1：100传代培养3.5h，并分别置于不同浓度鹅去氧胆酸中暴露30min。然后将培养物在1ml pbs中稀释1：100至约1
×
106cfu/ml，用30μm dioc2处理约30分钟，然后在流式细胞仪上进行分析。并采用群体红绿线性平均荧光强度(mfi)值的比值计算了相对膜电位。
[0070]
阿米卡星联用鹅去氧胆酸破坏细菌生物被膜
[0071]
使用微孔板法，分别使用cv染色和xtt-pms法检测微孔板中的生物膜总量和活菌量，评价阿米卡星单独与联合鹅去氧胆酸后对于细菌生物被膜的形成及成熟期的影响。
[0072]
药物对形成期细菌生物被膜的作用：96孔板液体稀释法测定生物被膜形成情况，适量含0.25％葡萄糖的lb培养液调整菌液od600＝0.1，加入药液，将96孔板置于37℃恒温
培养箱培养24小时。
[0073]
药物对成熟期细菌生物被膜的作用：96孔板液体稀释法测定生物被膜形成情况，适量含0.25％葡萄糖的lb培养液调整菌液od600＝0.1，将96孔板置于37℃恒温培养箱培养24小时形成成熟细菌生物膜。弃去悬液，加入药物，37℃，作用24h。
[0074]
检测指标：结晶紫染色，检测药物对生物被膜总量的作用。xtt染色，检测药物对生物被膜内活菌的作用。
[0075]
结果显示：氨基糖苷类药物的起效需要靠细菌的pmf——质子动力势(标志细菌跨膜转运能力)使药物转运至胞内，该过程会引起膜电位的变化，40μg/ml浓度鹅去氧胆酸可以提升细菌细胞膜通透性但不影响细菌细胞膜电位，见图5、图6。加入cccp抑制金黄色葡萄球菌的pmf使细菌无法摄取药物，令原本有效的阿米卡星失效，加入40μg/ml的鹅去氧胆酸后，恢复了阿米卡星的杀菌能力，见图7。鹅去氧胆酸增大了细菌细胞膜的通透性，绕过了质子动力势增大细菌摄取氨基糖苷类药物的能力。
[0076]
在生物膜形成期鹅去氧胆酸可以显著增强增强阿米卡星对生物被膜内活菌的杀灭能力并且减少细菌生物被膜总量。细菌生物被膜成熟后，即使单独使用16倍mic的抗生素(包括阿米卡星和万古霉素)都无法对细菌造成影响，但联用40μg/ml鹅去氧胆酸后，阿米卡星无论是消除细菌生物被膜还是杀灭生物被膜内活菌的能力均显著增强，见图8、图9、图10和图11。
[0077]
实施例3耐药诱导实验
[0078]
在96孔板中用倍比浓度梯度的(1)抗生素组(2)鹅去氧胆酸组(3)抗生素联合鹅去氧胆酸组处理细菌，每组3个独立谱系。在适宜条件静置培养24小时后，选择不影响细菌生长最高浓度的孔在mhb中以5
×
105cfu/ml进行传代，共30天。每3代冻存一次，菌株收集在冻存管中-80℃保存。作为对照，标准菌株的mic和实验组每次同时测定。
[0079]
结果显示：阿米卡星单独使用时最小抑菌浓度在30天时升高数百倍，形成高度耐药的金黄色葡萄球菌；而鹅去氧胆酸与阿米卡星联用可以使其对金黄色葡萄球菌的mic始终维持在低水平(低于临床给药浓度)，见图12；在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中同样观察到这一现象，见图13。
[0080]
鹅去氧胆酸抑制小克隆突变产生与生长(small colony variation；scv)
[0081]
药物分别作用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌72小时后取，选择适当浓度涂板计数，统计正常细胞数量。每个实验均为3个生物学重复。
[0082]
用10
×
mic氨基糖苷类药物单独或联合鹅去氧胆酸作用于细菌，观察小克隆突变产生情况，分离小克隆突变，作杀菌曲线。
[0083]
结果显示：阿米卡星单独作用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌容易使耐甲氧西林金黄色葡萄球菌产生小克隆突变从而抵御抗生素的伤害，但阿米卡星联用鹅去氧胆酸后使小克隆突变产生减少，正常细胞数量与正常组无明显差异。阿米卡星直接作用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的小克隆突变时，没有杀伤能力，联合鹅去氧胆酸后阿米卡星对小克隆突变的杀伤能力得到恢复，见图14、图15。
[0084]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0085]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。
对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。