一种大柴胡汤用炙枳实的制备方法与流程

1.本发明属于中药炮制领域，提供了一种大柴胡汤用炙枳实的制备方法。此外，本发明还提供了一种通过对大柴胡汤功效q-markers的精准分析，发现与特定功效对应的活性成分，进而以这些活性成分作为评价指标优化炙枳实炮制工艺的方法。


背景技术：

2.大柴胡汤方出自张仲景的《伤寒杂病论》，由柴胡、黄芩、芍药、半夏、生姜、枳实、大枣、大黄组成，具有和解少阳，内泻热结之功。在中医理论里，少阳包括胆与三焦，若少阳受邪，枢机不利，肝胆气机郁滞，必然影响三焦气化功能，若肝失疏泄，横逆犯胃，因而出现胸胁苦满，或胁下痞硬，或腹中痛等症，若伤及脾胃，气机壅塞，土壅木郁，燥热与糟粕互结，积于胃肠，阻滞腑气通降，可引起腹胀满而大便秘结等证候。由于少阳三焦为通行元气和运行水谷之要道，若邪热壅滞胆腑，上不得越，下不得泄，胆热木郁，克脾犯胃，胃失和降，可出现呕吐、泛酸、腹胀痛、纳差等病证。
3.方中柴胡专入少阳、疏邪透表为君药，黄芩擅清少阳之郁热，与柴胡同用，能和解少阳，是为少阳病未解、往来寒热、胸胁苦满而设；少用大黄泻热通腑，枳实行气破结，二者相配，可内泻热结，是为“热结在里”之心下痞满硬痛、大便不解、呕不止、郁郁微烦而设；芍药缓急止痛，配大黄可治腹中实痛，伍枳实能调和气血，协柴胡、黄芩清肝胆之热，以防木乘中土；半夏和胃降逆，生姜重用则止呕之功更著，以治呕逆不止；大枣和中益气，合芍药酸甘化阴，既可防热邪入里伤阴之虞，又能缓和枳实、大黄泻下伤阴之弊。总之，本方配伍体现了和解及攻下两法的结合运用，但以和解少阳为主、泻下之力较缓。
4.目前，大柴胡汤在临床应用广泛，疗效稳定清晰，但其具体的功效物质基础尚不明确。大柴胡汤临床常用药效为保肝、利胆、抗炎、降糖、降脂；现代药理研究也表明大柴胡汤具有保肝、降糖、降脂、利胆、抗炎的作用。大柴胡汤的功效侧重与其组成药物关系密切，各味药中活性成分是其起效关键，而各中药饮片的功效发挥与其炮制规格也密切相关。
5.枳实是芸香科植物酸橙(citrus aurantium l.)及其栽培变种或甜橙(citrus sinensis osbeck)的干燥幼果。在《神农本草经》中作为中品收载，具有破气消积，化痰散痞的功效。枳实主要有效成分为生物碱，如辛弗林、n-甲基酪胺等，黄酮类成分，如橙皮苷、柚皮素和柚皮苷等。炙枳实始载于《伤寒杂病论》的经典名方大柴胡汤中，炙枳实与大黄合用，发挥了内泻阳明热结的功效，但原方中并未明确炙法的工艺。枳实炮制后有缓和生品峻烈之性，免伤正气的作用，枳实历代有多种炮制方法，近代炮制方法主要有炒黄、炒炭、蜜炙、砂烫、酒炙、醋炙等，然而仅麸炒收载在《中国药典》(2020年版)中。
6.枳实炮制方法多种多样，但是目前尚无学者专门研究过采用何种炮制方法制备得到的炙枳实更适于在大柴胡汤中使用，以使得大柴胡汤能够最大限度地发挥其疗效。


技术实现要素：

7.为了解决上述技术问题，并填补在这一领域的技术空白，本发明人提供了一种大
柴胡汤用炙枳实的制备方法，还提供了一种通过大柴胡汤功效q-markers精准分析发现与特定功效对应的活性成分，进而以这些活性成分作为评价指标优化生品枳实炮制工艺的方法。
8.具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：
9.在第一个方面中，本发明提供了一种炙枳实的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
10.(1)取生枳实片，净制，阴干后备用；
11.(2)将适量生枳实切片平铺于烤盘上，预热烤箱，以80℃-250℃的烘烤温度，烤制3-60min，待枳实切片卷翘，边缘隆起，穰囊突出，有油迹，颜色棕黄，闻之芳香，味苦，取出，放凉，即得。
12.作为可选方式，在上述制备方法中，所述炙枳实的制备方法为大柴胡汤用炙枳实的制备方法，采用所述方法制备得到的炙枳实显著增强大柴胡汤内泻阳明热结的功效。
13.作为可选方式，在上述制备方法中，采用所述方法制备得到的炙枳实中活性成分橙皮苷、柚皮苷和新橙皮苷含量与通过麸炒或清炒制备得到的炙枳实相比显著增加，所述炙枳实按干燥品计算柚皮苷不得少于8.0％，橙皮苷不得少于2.4％以及新橙皮苷不得少于6.4％。
14.作为可选方式，在上述制备方法中，所述烤箱为家用电烤箱或实验室烘箱。
15.作为可选方式，在上述制备方法中，所述烘烤温度为150℃-200℃，烤制时间为5-30min。
16.作为可选方式，在上述制备方法中，所述烘烤温度为150℃、160℃、170℃、180℃、190℃或200℃，烤制时间为5min、6min、8min、10min、15min、20min或30min。
17.在第二个方面中，本发明提供了采用上述第一个方面所述的制备方法制备得到的炙枳实在制备大柴胡汤中的用途，所述炙枳实用于增加大柴胡汤中的活性成分橙皮苷、柚皮苷和新橙皮苷的含量，以及增强大柴胡汤内泻阳明热结的功效。
18.在第三个方面中，本发明提供了一种优化大柴胡汤用炙枳实的制备方法的方法，其特征在于：包括以下步骤：
19.(1)通过大柴胡汤功效q-markers精准分析发现与特定功效对应的一种或多种活性成分；
20.(2)以步骤(1)中的与特定功效对应的活性成分作为药效标志物(q-markers)，利用高效液相色谱法测量采用候选制备方法制备得到的炙枳实中所述一种或多种q-markers的含量；
21.(3)选择所述炙枳实中所述一种或多种q-markers含量较高并且炙枳实性状优良的所述炙枳实的制备方法，作为优化的大柴胡汤用炙枳实的制备方法。
22.作为可选方式，在上述方法中，所述特定功效为大柴胡汤内泻阳明热结的功效，所述与一种或多种q-markers为橙皮苷、柚皮苷或新橙皮苷，以及所述炙枳实性状优良指枳实饮片卷翘，边缘隆起，穰囊突出，有油迹，颜色棕黄，闻之芳香，味苦。
23.作为可选方式，在上述方法中，所述炙枳实的制备方法为烘烤、麸炒或清炒，所述优化的大柴胡汤用炙枳实的制备方法为上述第一个方面所述的制备方法。
24.本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
25.中药饮片的功效发挥与炮制规格密切相关，本发明人首次结合大柴胡汤功效q-markers精准分析的方法明确了大柴胡汤中炙枳实的炮炙规格，促进大柴胡汤发挥内泻阳明热结功效，使大柴胡汤临床药用精准化、稳定化。
附图说明
26.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
27.图1：大柴胡汤功效q-markers精准分析的流程图。
28.图2：采用不同制备方法制备得到的炙枳实的性状照片。2a：清炒法处理的枳实饮片；2b：电烤箱90℃处理的枳实饮片；2c：电烤箱120℃处理的枳实饮片；2d：电烤箱135℃处理的枳实饮片；2e：电烤箱150℃处理的枳实饮片；2f：电烤箱165℃处理的枳实饮片；2g：电烤箱180℃处理的枳实饮片；2h：烘箱120℃处理的枳实饮片；2i：烘箱160℃处理的枳实饮片；2j：烘箱180℃处理的枳实饮片；2k：烘箱200℃处理的枳实饮片；2l：枳实生品和麸炒枳实。
29.图3：枳实供试品溶液。1.柚皮苷，2.橙皮苷，3.新橙皮苷，4.辛弗林。
具体实施方式
30.下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
31.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
32.下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
33.实施例1：与大柴胡汤内泻阳明热结功效对应的q-markers的筛选
34.采用如图1中所示的流程对与大柴胡汤内泻阳明热结功效对应的q-markers进行筛选，得出与枳实相关的q-markers，结果如下表1所示。
35.此外，在后续的含量测定实验中，还引入了在灸枳实中含量较高，并且也是2020年版药典规定的检测成分辛弗林一并进行检测。
36.表1：涉及枳实的与大柴胡汤内泻阳明热结功效对应的q-markers
[0037][0038]
注：加粗的药效为关键药效；加粗的成分为q-markers。
[0039]
实施例2：大柴胡汤用炙枳实的制备方法筛选
[0040]
第一部分：性状对比
[0041]
药材由河北橘井药业有限公司提供，产于四川同一批次的生枳实片。
[0042]
1.实验方法
[0043]
1.1清炒法处理枳实
[0044]
取适量枳实药材置于炒锅中，设置温度为130℃，炒至枳实药材表面呈淡黄色，散发香气，取出晾凉，记录时间并编号。相同操作，设置温度为160℃，180℃，210℃，记录时间并编号。经清炒法处理的枳实样品信息见表2。
[0045]
表2：清炒法处理枳实
[0046][0047]
1.2.烘烤法处理枳实
[0048]
1.2.1家用电烤箱处理枳实
[0049]
将适量枳实药材平铺于烤盘上，选择烤箱上方加热，烤箱设置温度预热5min后，放入烤箱，设定一定的时间梯度，到达时间之后，取出晾凉，记录枳实性状并编号。相同操作，改变温度和时间，完成之后记录枳实性状并编号。经家用电烤箱处理的枳实样品信息见表3。
[0050]
表3：电烤箱烘烤处理枳实
[0051][0052]
1.2.2实验室烘箱处理枳实
[0053]
将适量枳实药材平铺于烤盘上，预热烘箱，设置温度为120℃，烘至枳实药材表面呈淡黄色，散发香气，取出晾凉，记录时间并编号。相同操作，设置温度为160℃，180℃，200℃，记录时间并编号。经实验室烘箱处理的枳实样品信息见表4。
[0054]
表4：实验室烘箱烘烤枳实
[0055][0056]
2.实验结果
[0057]
2.1清炒法处理枳实
[0058]
经130℃-210℃不同温度下清炒加工，枳实炮制品的性状特征见表5(见图2)。
[0059]
表5：清炒法处理枳实实验结果
[0060][0061]
2.2烘烤法处理枳实
[0062]
2.2.1烘烤加工初试
[0063]
经90℃-180℃不同温度下烘烤加工，枳实炮制品的性状特征见表6(见图2)。
[0064]
表6：电烤箱烘烤处理枳实实验结果
[0065][0066][0067]
2.2.2烘烤枳实
[0068]
经120℃-200℃不同温度下烘烤加工，枳实炮制品的性状特征见表7(见图2)。
[0069]
表7：实验室烘箱烘烤枳实实验结果
[0070]
[0071]
第二部分：含量测定
[0072]
第一部分实验经过处理所得的枳实炮制品(清炒枳实和烘烤枳实两种规格)与枳实生品(河北橘井药业有限公司，产地四川，同一批次，见表8)和麸炒枳实(购买于河北橘井药业有限公司，产地四川，同一批次，见表8)。
[0073]
表8：枳实不同种类炮制品样品信息表
[0074][0075][0076]
表9：药品与试剂信息表
14838.889，r2＝0.9999；新橙皮苷的回归方程：y＝2e+06x+452877，r2＝0.9987；辛弗林的回归方程：y＝151604.749x+44055.446，r2＝0.9990，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林的质量浓度线性范围分别为7.08-212.4μg/ml、1.995-199.5μg/ml、7.83-234.9μg/ml和2.535-253.5μg/ml。结果显示四种待测成分在线性范围内呈良好线性关系。
[0089]
精密度考察：取供试品溶液，连续进样6次，每次进样10μl，记录柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林的峰面积，计算rsd值分别为0.93％，1.01％，0.95％，2.55％，说明仪器精密度良好，符合含量测定的要求。
[0090]
稳定性考察：取同一供试品溶液，在0h、2h、4h、8h、12h、16h、24h分别进样，记录柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林的峰面积，计算rsd值分别为2.10％，0.69％，2.10％，1.44％。表明供试品溶液中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林在24h内稳定性良好。
[0091]
重复性考察：取同一样品，平行制备6份供试品溶液，分别进样，记录柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林的峰面积，计算rsd值分别为1.87％，0.73％，1.72％，2.46％，说明此方法测重复性良好。
[0092]
加样回收率实验：精密称取已知含量的同一样品6份，分别加入适量柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林对照品，按上述方法制得供试品溶液并检测，计算回收率，结果见表12。
[0093]
表12：橙皮苷、辛弗林加样回收率试验(n＝8)
[0094][0095]
2.实验结果
[0096]
图3给出了柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林的炙枳实供试品溶液的hplc色谱图。从图中可以看出，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林色谱峰峰形良好，分离度较高，检测时间较短。
[0097]
对生品枳实、市售麸炒炙枳实和采用本发明方法制备的炙枳实中针对大柴胡汤内泻阳明热结的功效的药效标志物(q-markers)橙皮苷、柚皮苷和新橙皮苷，以及炙枳实中含量较高的活性成分辛弗林的含量进行了比较。结果如下表13所示：
[0098]
表13：不同枳实样品中橙皮苷、辛弗林、柚皮苷和新橙皮苷的含量测定值(n＝3)
[0099][0100]
由表13中的实验结果可以看出，采用本发明方法炮制的炙枳实中橙皮苷、辛弗林、
柚皮苷和新橙皮苷的含量与生品和麸炒品存在较大差异。采用优选烘烤条件以200℃的烘烤温度，烤制8min制备得到的炙枳实中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林的含量(％)分别可达13.38％、7.16％、9.76％和1.34％。
[0101]
综上所述，大柴胡汤炙枳实可以采用烘烤法处理，以烘烤法温度为200℃，烘烤时间8分钟的枳实饮片进行精准经方标准创新与精准化开发研究，采用所述方法制备得到的炙枳实q-markers橙皮苷、柚皮苷和新橙皮苷的含量显著增加，从而显著增强与上述q-markers相关的大柴胡汤内泻阳明热结的功效。
[0102]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。