NAT10抑制剂在诊治压力超负荷所致心力衰竭中的应用

nat10抑制剂在诊治压力超负荷所致心力衰竭中的应用
技术领域
1.本发明涉及nat10抑制剂在诊治压力超负荷所致心力衰竭中的应用，属于生物医药领域。


背景技术：

2.心力衰竭作为各种心血管疾病进展的终末阶段，其发病率高、预后差。尽管“金三角”、“新四联”等抑制神经内分泌过度激活等药物治疗使心衰患者生存率有所提高，但其生活质量以及远期预后仍然很差，心衰患者的1年死亡率仍高达 17％。
3.心力衰竭因发生机制不同，分为不同的类型。从病理生理角度来看，心力衰竭大致可分为由原发性心肌损害及心脏长期容量(或)压力负荷过重，导致心脏泵功能由代偿最终发展为失代偿两大类。心衰发生机制主要为心室重构，即心衰进展过程中心肌发生适应不良性改变导致心室病理性重构，包括心室大小、形态、组织结构及功能状态的改变，是心衰发生发展的基本病理过程。
4.心脏重构是心力衰竭发生和发展的重要病理生理基础。在大体形态水平，心肌重构多表现为局部或大部分甚至整个心室壁或/和心房壁增厚、质量增加。在细胞水平，不能分裂的单个心肌细胞肥大，间质成分如成纤维细胞增殖，胶原合成和分泌增加，并伴随着心肌细胞凋亡，引起心肌组织成分发生改变。在分子水平，促进心肌肥厚的基因表达增加，如结缔组织生长因子ctgf、转化生长因 tgfβ，i型和iii型胶原等，使心室壁的僵硬度增加，心肌顺应性下降。尽管心脏重构最初是一种代偿机制，长期持续性的心脏重构能够明显增加心力衰竭的发病率和病死率。目前，对于心脏重构导致的心力衰竭临床上尚无十分有效的防治方法。因此，发现阻断心脏重构导致心力衰竭的特异性分子以及分子通路，寻找防治心力衰竭的药物靶点具有非常重要的理论意义和临床意义。
5.表观遗传作为基因表达调控的重要手段，越来越多地受到心衰领域研究者的重视。rna表观转录后修饰是表观遗传中重要的环节，既往通过靶向6-甲基腺苷在多种疾病进展中的保护作用提示了rna表观转录后修饰机制在心衰治疗中的潜能。4-乙酰胞苷(n4-acetylcytidine，ac4c)是一种存在于多种rnas上保守的转录后化学修饰核苷类型。ac4c的形成主要受n-乙酰基转移酶10 (n-acetyltransferase 10，nat10)的催化，参与多种疾病的发病及进展，包括免疫炎症反应、代谢性疾病、自身免疫性疾病以及癌症等。然而，目前关于nat10 抑制剂在制备治疗压力超负荷所致心力衰竭中的作用还未见报道。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是：如何改善心脏重构等压力超负荷所致心力衰竭的疗效和预后。
7.为了解决上述技术问题，本发明提供了nat10基因或蛋白的抑制剂在制备治疗压力超负荷所致心力衰竭的药物中的应用。
8.优选地，所述nat10基因或蛋白的抑制剂包括remodelin，其分子式为 c
15h14
n4s，分
子量为282.36，化学结构式为
9.本发明还提供了一种用于治疗压力超负荷所致心力衰竭的药物或药物组合物，所述的药物或药物组合物包括药学上可接受的载体和有效量的活性成分，所述活性成分包括nat10基因或蛋白的抑制剂。
10.优选地，所述nat10基因或蛋白的抑制剂包括remodelin。
11.本发明还提供了用于检测nat10基因或蛋白的表达或活性的试剂在制备诊断压力超负荷所致心力衰竭的试剂或试剂盒中的应用。
12.优选地，所述的用于检测nat10基因或蛋白的表达或活性的试剂包括 nat10抗体。
13.本发明还提供了用于检测ac4c修饰水平的试剂在制备诊断压力超负荷所致心力衰竭的试剂或试剂盒中的应用。
14.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
15.本发明创造性地利用nat10的特异性抑制剂remodelin来干预tac诱导的小鼠病理性心肌重构与心力衰竭，发现remodelin干预后ac4c被显著抑制，可显著改善tac诱导的小鼠心脏重构和心功能，本发明为临床上诊治压力超负荷所致心力衰竭提供了新的靶点和策略。
附图说明
16.图1为人的心衰心脏组织和tac诱导的小鼠心衰心脏组织的ac4c修饰及 nat10的表达水平；其中，a为人的心衰心脏组织和正常组织中ac4c修饰水平， b为人的心衰心脏组织和正常组织中nat10表达水平，c为tac诱导的小鼠心衰心脏组织和假手术小鼠心脏组织中ac4c修饰水平，d为tac诱导的小鼠心衰心脏组织和假手术小鼠心脏组织中nat10表达水平；
17.图2为在构建的tac诱导的心力衰竭小鼠基础上进行2周的nat10抑制剂的灌胃，发现remodelin干预可显著降低ac4c的修饰水平(a)、降低射血分数ef(b)以及降低缩短分数fs(c)；
18.图3为tac术后4周小鼠心脏组织的he染色、masson染色和wga染色图(a)、心肌纤维化检测结果(b)、心肌细胞肥大水平检测结果(c)、rt-qpcr检测心衰相关标志物分子的表达水平(d)以及rt-qpcr检测胶原及细胞外基质沉积相关基因的表达水平(e)；
19.以上各图中，＊表示经过统计学分析，两组间具有显著性差异，p《0.05；＊＊表示经过统计学分析，两组间具有显著性差异，p《0.01；＊＊＊表示经过统计学分析，两组间具有显著性差异，p《0.001。
具体实施方式
20.为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
21.本发明的第一方面，提供了nat10基因或蛋白的抑制剂在制备治疗心力衰竭的药物中的应用。
22.所述的心力衰竭是压力超负荷所引起的心力衰竭。
23.所述的nat10基因或蛋白的抑制剂是指令nat10蛋白失去活性或活性降低的抑制剂。
24.所述的nat10基因或蛋白的抑制剂选自小分子化合物或生物大分子。
25.所述的小分子化合物为remodelin，其分子式c
15h14
n4s，分子量282.36，化学结构式为
26.本发明的第二方面，提供了一种治疗心力衰竭的药物组合物，所述的药物组合物以nat10基因或蛋白的抑制剂为活性成分，并进一步包含药学上可接受的载体。
27.所述的心力衰竭是压力超负荷所引起的心力衰竭。
28.所述的nat10基因或蛋白的抑制剂是指促进nat10蛋白失去活性或活性降低的抑制剂。
29.所述的药物组合物的剂型为注射剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂、丸剂或口服液等。
30.本发明的第三方面，提供了nat10作为诊断标志物在制备心力衰竭诊断的试剂或试剂盒中的应用。
31.本发明的第四方面，提供了检测ac4c修饰水平的试剂在制备心力衰竭诊断的试剂或试剂盒中的应用。
32.需要说明的是，心力衰竭因发生机制不同，分为不同的类型。从病理生理角度来看，心力衰竭大致可分为由原发性心肌损害及心脏长期容量(或)压力负荷过重，导致心脏泵功能由代偿最终发展为失代偿两大类。心衰发生机制主要为心室重构，即心衰进展过程中心肌发生适应不良性改变导致心室病理性重构，包括心室大小、形态、组织结构及功能状态的改变，是心衰发生发展的基本病理过程。如本文所用，所述的“nat10抑制剂”包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等，只要它们能够使nat10蛋白活性降低或丧失，或下调nat10的表达水平或抑制其活性。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括dna、rna)的，也可以是抑制nat10表达的病毒产品。作为实例，所述的抑制剂是：化合物remodelin，分子式c
15h14
n4s，分子量282.36。核酸抑制物，蛋白抑制剂，核酸酶，核酸结合分子，只要其能够使nat10蛋白活性降低或丧失，或下调nat10的表达。
33.以下实施例中涉及的小鼠购自集萃药康生物科技公司，nat10特异性抑制剂remodelin购自mce(medchemexpress)公司，动物实验已通过复旦大学附属中山医院伦理委员会批准。
34.实施例
35.本实施例提供了nat10抑制剂在诊治压力超负荷所致心力衰竭中的应用：
36.1、小鼠主动脉弓缩窄(transverse aortic constriction，tac)模型构建：
37.选择8周龄、体重20-25g左右的成年雄性c57bl/6小鼠，经麻醉、固定、脱毛、备皮后从胸骨上窝上缘剪开皮肤、沿胸骨正中线剪至第二肋间隙(约1cm 切口)。于胸骨上窝处钝性分离筋膜暴露出气管后小弯镊子进入胸骨上窝，将胸腺组织向两侧推挤。采用牵拉器暴露视野，通过自制的注射器针头(前段剪断、制作成直角)前段于头臂干处血管穿入5号线并预先打结。随后垫上4毫米27g 针头(制作成直角)并打结。结扎后缓慢拔除4毫米27g针头，缝合肌肉组织，缝皮后置于温暖环境中待苏醒，模型构建完成。假手术组方法一致，只穿线
不结扎。
38.2、临床心衰心脏标本及tac所致心衰小鼠心脏标本的nat10表达及ac4c 乙酰化修饰检测：
39.经伦理审查通过及知情同意，收集复旦大学附属中山医院临床诊断为原发性扩张型心肌病所致终末期心衰，需进行心脏移植手术患者的左心室心肌组织3 例。同时收集非心脏疾病患者的对照组非心力衰竭的左心室心肌组织3例。另外，收集上述假手术组与tac所致心衰组的小鼠心脏组织各6例。分别提取上述样本的total rna，采用液相色谱串联质谱法(liquid chromatography-tandem massspectrometry，lc-ms)检测ac4c乙酰化修饰的含量，采用rt-qpcr法检测nat10 的表达。
40.3、nat10抑制剂remodelin干预：
41.按前述方法行tac手术诱导压力超负荷所致小鼠心力衰竭。tac术后第3 天开始随机分组，处理组通过灌胃方式给予nat10抑制剂remodelin(100 mg/kg/d)，对照组给与同等体积的dmso灌胃，连续给药2周，直至tac后4 周小鼠行心脏超声检测心功能、he染色检测心肌形态学变化、masson染色检测纤维化、wga染色检测心肌细胞肥大水平、rt-qpcr检测心衰相关标志物分子、胶原及细胞外基质沉积相关基因的表达。
42.4、心脏超声检测心脏结构及功能：
43.小鼠脱毛后，用异氟醚麻醉后固定在加热垫上(1％-2％)。小心控制异氟醚流量，使心率维持在450次/分左右。采用配备30mhz线性换能器的二维(2-d) 引导m型超声心动图(visualsonics vevo 2100，加拿大)评估心脏的几何结构和功能。获得胸骨旁长轴视图，同时记录心率。得到心脏几何形状和功能指标：射血分数(ef)、缩短分数(fs)。每个测量指标至少经过5个连续的心脏周期取平均值。
44.5、心脏标本切片染色检查：
45.tac 4周后心脏取材，多聚甲醛固定后行常规石蜡包埋及切片。切片制作完成后常规脱蜡水化，行he、masson及wga染色观察心脏组织形态、纤维化程度及心肌细胞表面积大小。
46.6、使用rt-qpcr方法分析nppa、nppb、myh7、col1a1、col3a1、ctgf及 lox等心衰相关标志物、胶原及细胞外基质沉积相关基因的表达，探明nat10 抑制剂对tac诱导的心力衰竭相关标志物分子表达的改善情况。
47.7、实验结果：
48.(1)实验中，通过lc-ms与rt-qpcr法检测收集到的临床诊断为扩张型心肌病所致心衰的心脏组织和tac诱导的小鼠心衰心脏组织的ac4c修饰及 nat10的表达，发现无论是在人的心脏标本还是在小鼠的心脏标本中ac4c修饰和nat10的表达均发生了显著的上调，如图1所示。
49.(2)在构建的tac诱导的心力衰竭小鼠基础上进行2周的nat10抑制剂的灌胃，发现remodelin干预可显著降低ac4c的修饰水平，改善心功能指标，如图2所示，nat10抑制剂还可改善tac诱导的心功能不全和心室重构、降低心肌肥厚及心衰相关标志物分子的表达、改善胶原及细胞外基质的沉积，如图3 所示。
50.上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出
若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。