视黄酸修饰的LYTAC分子及其制备方法和应用

视黄酸修饰的lytac分子及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及靶向蛋白降解技术领域，尤其涉及一种视黄酸修饰的lytac分子及其制备方法和应用。


背景技术：

2.靶向蛋白降解(targeted protein degradation，tpd)通过劫持内源性蛋白质降解机制来诱导致病蛋白质的消耗或减少。与传统抑制剂的“占位驱动”(occupancy-driven)模式不同，tpd只需要结合剂来招募目标蛋白进行降解，不依赖高亲和力的占据，因此可以靶向无酶活性或缺乏可用药物结合口袋的“不可成药”蛋白。同时，由于其催化作用模式，tpd技术能在低药物浓度(nm级)下实现高效、快速的靶蛋白消耗，延长药物作用时间，从源头避免了传统抑制剂的脱靶效应和不良反应(20)。
3.目前，tpd中发展最为成熟的是基于泛素化-蛋白酶体系统降解胞内蛋白的蛋白水解靶向嵌合体(proteolysis-targeting chimera,protac)技术。基于该技术开发的首款靶向雄激素受体的降解剂arv-110已完成i期临床试验(nct03888612)，在转移性去势抵抗性前列腺癌患者中显示出较好的有效性和安全性。目前，众多国内外知名药企：arvinas、诺华等纷纷布局protac技术，显示了该技术广大的市场潜力。
4.作为protac的补充，2020年carolyn bertozzi等提出溶酶体靶向嵌合体(lysosome-targeting chimeras，lytac)技术，首次利用了内吞-溶酶体途径，通过靶向蛋白的胞外结构域，实现胞外蛋白和膜蛋白的靶向降解。目前报道的lytac主要由两个结合域组成，其中一个是靶向细胞表面的溶酶体靶向受体(lysosome-targeting receptor,ltr，例如非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体(cation-independent mannose-6-phosphate receptor,ci-m6pr))的寡聚糖结构，另外一个是靶向靶蛋白的抗体、多肽或小分子。
5.lytac和ci-m6pr、靶蛋白结合后，将m-6-p修饰的蛋白转移到溶酶体，被报道可实现egfr、her2、pd-l1和载脂蛋白e4的成功降解，且解离的ci-m6pr能再次进入循环。
6.但上述lytac降解剂都存在如下缺点：1、目前lytac针对ci-m6pr的配体poly(m6pn)合成路线复杂，超过15步以上化学反应，难以推广应用。2、非特异性糖基修饰的抗体在小鼠体内会被很快清，因此如何调节lytac的药代动力学特性以控制lytac的脱靶清除率，是该技术面临的另一难点。3、目前lytacs分子的ltr配体是化学合成的非天然糖结构，因此在人体内可能产生较强免疫原性。因此亟需开发新型简单易得且具有较高生物相容性的ltr配体。
7.视黄酸是体内维生素a的代谢中间产物，主要影响骨的生长和促进上皮细胞增生、分化、角质溶解等代谢作用。有文献报道视黄酸也可以作为ci-m6pr的配体。但目前尚无报道将视黄酸偶联抗体或多肽等作为lytac药物来降解膜蛋白。由于视黄酸生物安全性高，且结构中的羧基易于修饰偶联其他药物，因此本发明试图将其偶联抗体、多肽或小分子化合物来实现膜受体蛋白的降解。


技术实现要素：

8.本发明提供了一种视黄酸修饰的lytac分子及其制备方法和应用，将视黄酸通过化学偶联靶向靶蛋白的抗体、多肽或小分子化合物制备靶向药物，该靶向药物可应用于新型靶向蛋白质降解技术——溶酶体靶向嵌合体技术。
9.本发明的技术方案如下：
10.一种视黄酸修饰的lytac分子，所述视黄酸修饰的lytac分子的结构如式(i)所示：
[0011][0012]
式(i)中，n表示peg的分子量，n为60-5000；r为靶向靶蛋白的抗体、多肽或小分子化合物。
[0013]
视黄酸分子式为c
20h28
o2，是体内维生素a的代谢中间产物，其生物安全性高，简单易得，易于修饰。将视黄酸偶联任何靶向靶蛋白的抗体、多肽或小分子化合物可得到视黄酸修饰的lytac分子，可实现靶蛋白的降解。
[0014]
优选的，所述的n为120-3000。
[0015]
优选的，所述的r为egfr抗体cetuximab、pdl-1抗体atezolizumab、egfr靶向多肽ge11、her2抗体herceptin、cpcr相关抗体、fgfr抗体、vegfr抗体、ctla4抗体或il-5rα抗体。
[0016]
本发明还提供了所述视黄酸修饰的lytac分子的制备方法，包括以下步骤：
[0017]
(1)将视黄酸与nh
2-peg
n-mal(氨基聚乙二醇马来酰亚胺)反应，经分离提纯后获得中间体；
[0018]
(2)将中间体与带有巯基的靶向靶蛋白的抗体、多肽或小分子化合物反应，经后处理后得到所述视黄酸修饰的lytac分子。
[0019]
优选的，步骤(1)包括：将视黄酸溶解到溶剂中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺，冰浴反应30-60min；在向其中加入nh
2-peg
n-mal，室温反应10-15h；反应液经后处理后得到中间体。
[0020]
步骤(1)中，所述的后处理包括：
[0021]
除去反应液中的溶剂得到油状浓缩物；将油状浓缩物用体积比为4:1的超纯水：甲醇的混合溶剂溶解后，采用制备型高效液相色谱进行分离与提纯；
[0022]
色谱柱型号为cosmosil 5c18-ms-ii 20mm*250mm；流动相是体积比为3:7的超纯水：甲醇的混合溶剂；洗脱速度为4ml/min；柱温为30℃；保留时间为14min。
[0023]
优选的，步骤(1)中，视黄酸与nh
2-peg
n-mal的摩尔比为1：0.5-2；最优选为1：1。
[0024]
优选的，步骤(2)包括：将中间体与带有巯基的靶向靶蛋白的抗体、多肽或小分子化合物溶于pbs缓冲液中，室温反应1-5h，反应结束后除去未反应的原料，干燥后得到视黄酸修饰的lytac分子。
[0025]
优选的，步骤(2)中，中间体与带有巯基的靶向靶蛋白的抗体、多肽或小分子化合物的摩尔比为8-10：1；最优选为10：1。
[0026]
本发明的视黄酸修饰的lytac分子具有较强的靶向蛋白降解作用，可作为靶向蛋
白降解剂。
[0027]
本发明还提供了所述视黄酸修饰的lytac分子在靶向蛋白降解中的应用，用于靶向降解egfr、pdl-1或her2蛋白。
[0028]
本发明还提供了所述视黄酸修饰的lytac分子在制备肿瘤细胞活性抑制剂中的应用。
[0029]
所述的肿瘤细胞为乳腺癌细胞、口腔癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、结直肠癌细胞、膀胱癌细胞或前列腺癌细胞。
[0030]
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0031]
本发明提供了一种结构简单、易于制备的视黄酸修饰的lytac分子，可作为靶向蛋白降解剂。视黄酸生物安全性高，简单易得，易于修饰，可以与任何靶向结合蛋白受体的抗体、多肽或小分子偶联实现胞外或膜上蛋白的溶酶体降解，可用于制备肿瘤细胞活性抑制剂，用于肿瘤、炎症等疾病的治疗，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0032]
图1为实施例2制得的视黄酸偶联egfr抗体cetuximab后的产物ra-peg2k-ctx的质谱测试结果。
[0033]
图2为实施例3制得的视黄酸偶联pdl-1抗体atezolizumab后的产物ra-peg2k-ate的质谱测试结果。
[0034]
图3为实施例4中ra-peg2k-ctx对两种肿瘤细胞(孵育24小时后)的egfr受体蛋白的降解效果评价；其中，a为肺癌细胞h1975，b为肺癌细胞pc9。
[0035]
图4为实施例5中ra-peg2k-ctx对两种肿瘤细胞(孵育48小时后)的egfr受体蛋白的降解效果评价；其中，a为肺癌细胞h1975，b为肺癌细胞pc9。
[0036]
图5为实施例6中ra-peg2k-ate对肿瘤细胞mda-mb-231(孵育24小时后)的pdl-1蛋白的降解效果评价。
具体实施方式
[0037]
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
[0038]
本发明所述室温为25-30℃。
[0039]
实施例1、中间体ra-peg2k-mal的合成
[0040][0041]
将视黄酸(10.2mg,34μmol)加入二氯甲烷中溶解，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc.hcl)(17.1mg,90μmol)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs)(10.3mg,90μmol)，冰浴反应半小时，再向其中加入nh2-peg2k-mal(氨基聚乙二醇马来酰亚胺，mw:2000)(34μmol,68mg),常温反应12h。反应液旋转蒸发去二氯甲烷后，获得油状浓缩物；浓缩物用体积比4:1的超纯水：甲醇的混合溶剂溶解后，采用制备型高效液相色谱进行分离与提纯(色谱柱型号为cosmosil 5c18-ms-ii 20mm*250mm)，以体积比3:7的超纯水：甲醇的混合
溶剂为流动相进行洗脱，洗脱速度为4ml/min，检测波长为254nm，柱温为30℃，保留时间为14min，收集产物ra-peg2k-mal，旋转蒸干甲醇后，再冻干，得中间体ra-peg2k-mal 0.071g。
[0042]
实施例2、视黄酸偶联egfr抗体cetuximab后的产物ra-peg2k-ctx的合成
[0043][0044]
将egfr抗体cetuximab(14.5mg,0.1μmol)与三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep)(0.28mg,1μmol)在2ml pbs缓冲液中孵育半小时，再将实施例1方法制备的中间体ra-peg2k-mal(2.4mg,1μmol)加入上述溶液中，室温反应3小时，反应结束后用超滤离心管(mwco 50kd)离心去除未反应的原料。冻干后，得到式(i)所示lytac药物(记为ra-peg2k-ctx)10.2mg。质谱见图1，cetuximab(ctx)的分子量为145779.44，产物ra-peg2k-ctx测得的分子量为158465.73，因此每个抗体接了5个视黄酸分子。
[0045][0046]
实施例3、视黄酸偶联pdl-1抗体atezolizumab后的产物ra-peg2k-ate的合成
[0047][0048]
将pdl-1抗体atezolizumab(14.4mg,0.1μmol)与三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep)(0.28mg,1μmol)在2ml pbs中孵育半小时，再将实施例1方法制备的中间体ra-peg2k-mal(2.4mg,1μmol)加入上述溶液中，室温反应3小时，反应结束后用超滤离心管(mwco 50kd)离心去除未反应的原料。冻干后，得到式(i)所示lytac药物(记为ra-peg2k-ate)10.1mg。质谱见图2,atezolizumab(ate)的分子量为144590.5，产物ra-peg2k-ctx测得的分子量为148797.335，因此每个抗体分子接了2分子视黄酸。
[0049]
实施例4、ra-peg2k-ctx对两种肿瘤细胞(孵育24小时后)的egfr蛋白的降解效果评价
[0050]
分别将egfr抗体cetuximab(10nm)与ra-peg2k-ctx(10nm)加入到肺癌细胞h1975和pc9细胞中，孵育24小时后，收集蛋白，通过westernblot检测egfr的表达，结果如图3所示，空白组和ctx处理组egfr蛋白都有表达。而ra-peg-ctx处理组，相对于空白组，egfr蛋白降解了50％以上。因此结果表明ra-peg2k-ctx对两种细胞的egfr蛋白都有很好的降解效果。
[0051]
实施例5、ra-peg2k-ctx对两种肿瘤细胞(孵育48小时后)的egfr蛋白的降解效果评价
[0052]
分别将egfr抗体cetuximab(10nm)与ra-peg2k-ctx(10nm)加入到肺癌细胞h1975和pc9细胞中，孵育48小时后，收集蛋白，通过westernblot检测egfr的表达，结果如图4所示，空白组和ctx处理组egfr蛋白都有表达。而ra-peg-ctx处理组，相对于空白组，egfr蛋白降解了80％以上。结果表明ra-peg2k-ctx对两种细胞的egfr蛋白都有很好的降解效果。
[0053]
实施例6、ra-peg2k-ate对肿瘤细胞mda-mb-231(孵育24小时后)的pdl-1蛋白的降解效果评价
[0054]
分别将pdl-1抗体atezolizumab(ate)(25nm)与ra-peg2k-ate(25nm)加入到乳腺癌细胞mda-mb-231细胞中，孵育24小时后，收集蛋白，通过westernblot检测pdl-1的表达，结果如图5所示，空白组和ate处理组pdl-1蛋白表达基本一致。而ra-peg-ate处理组，相对于空白组，pdl-1蛋白降解了50％以上。结果表明ra-peg2k-ate对pdl-1蛋白有很好的降解效果。
[0055]
以上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。