毛裂蜂斗菜总内酯及蜂斗菜内酯类化合物在制备提高运动能力药物中的应用

1.本发明涉及医药技术领域，具体地说，是毛裂蜂斗菜总内酯及其所含蜂斗菜内酯类化合物用于制备提高运动能力药物中的新用途。


背景技术：

2.菊科蜂斗菜属植物petasites species(asteraceae)广泛分布于欧洲、亚洲和北美洲。我国共有6个种，产于东北、华东和西南地区，分别为：蜂斗菜p.japonicus(seib.et zucc)maxim、毛裂蜂斗菜p.tricholobusfanch、掌叶蜂斗菜p.tatewakianuskitam、盐源蜂斗菜p.versipilishandmazz、长白蜂斗菜p.rubellus(j.f.gmel.)toman、台湾蜂斗菜p.formasanuskitam。其根茎具有清热解毒、散瘀消肿的功效，主要用于咽喉肿痛、痈肿疔毒、毒蛇咬伤、跌打损伤等。
3.为开发利用该植物，本发明人对该植物进行了较系统的化学成分及药理研究，曾对毛裂蜂斗菜中的蜂斗菜内酯新化合物以及蜂斗菜内酯类化合物用于治疗可能与组胺和/或白三烯有关疾病的用途申请并获得了中国发明专利zl200610026133.1(授权公告号为cn100554260c)；对毛裂蜂斗菜根茎提取物及其制备方法以及该提取物用于制备治疗和预防肿瘤疾病药物的用途、在制备防治心脑血管疾病药物中的用途也分别申请并获得了中国发明专利zl200710038961.1(授权公告号为cn101028322b)和zl200810039033.1(授权公告号为cn101297828b)；对毛裂蜂斗菜提取物在制备防治缺氧疾病药物或保健食品中的应用申请并获得了中国发明专利zl201611141619.x(授权公告号cn106581113b)。
4.但是，到目前为止，尚未见有关毛裂蜂斗菜总内酯及其所含的活性物质蜂斗菜内酯类化合物针对运动能力的研究。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供毛裂蜂斗菜总内酯及其所含的活性物质蜂斗菜内酯类化合物的新用途，尤其是在制备提高运动能力药物中的应用。
6.本发明的第一方面，提供毛裂蜂斗菜总内酯在制备提高运动能力药物中的应用。
7.进一步的，所述的运动能力包括但不限于肌肉运动以及与运动相关的各类评价指标(例如运动耐力时间延长、抓握力提高、肝糖原含量提高、血乳酸含量下降、乳酸脱氢酶活性提高、肌酸激酶和超氧化物歧化酶活性降低等)。
8.更进一步的，所述的提高运动能力是指运动耐力时间延长、抓握力提高、肝糖原含量提高、血乳酸含量下降、乳酸脱氢酶活性提高、肌酸激酶和超氧化物歧化酶活性降低等。
9.进一步的，所述的毛裂蜂斗菜总内酯的制备方法包括以下步骤：毛裂蜂斗菜根茎粉碎后，用乙醇提取得提取液，提取液减压浓缩后离心或过滤，弃沉淀，上清液或过滤液备用；将上述上清液或过滤液进行聚苯乙烯型多孔性吸附树脂吸附、水-50％的含水低级醇淋洗除去杂质后，用上样生药质量的4-12倍量体积的60-95％的含水的c1～c5低级醇洗脱后将
洗脱液减压浓缩，干燥，得毛裂蜂斗菜总内酯。
10.本发明的第二方面，提供毛裂蜂斗菜总内酯所含的活性物质蜂斗菜内酯类化合物在制备提高运动能力药物中的应用。
11.本发明所述的毛裂蜂斗菜总内酯所含的活性物质蜂斗菜内酯类化合物包括但不限于中国发明专利zl200610026133.1、zl200710038961.1、zl200810039033.1、zl201611141619.x中公开的所有蜂斗菜内酯类化合物。
12.所述的蜂斗菜内酯类化合物，化学结构如式(i)所示：
[0013][0014]
其中r1、r2分别代表：
[0015]
r1：-h，-ococ(ch3)＝chch3，-ococh＝c(ch3)2，-ococh＝chsch3，cis-ococh＝chsch3，-ococh3，-ococ(ch3)＝chch3，cis-ococh＝chsoch3，(r)-cis-ococh＝chsoch3，(s)-cis-ococh＝chsoch3，(s)-trans-ococh＝chsoch3，-oh，-ococh2ch(ch3)2，-ococh(ch3)2，-ococh(ch3)ch2ch3或-ococ(＝ch2)ch(oh)(ch3)；
[0016]
r2：-h，-ococh＝c(ch3)2，-ococh＝chsch3，cis-ococh＝chsch3，-ococ(ch3)＝chch3，-ococh3，cis-ococh＝chsoch3，(r)-cis-ococh＝chsoch3，(s)-cis-ococh＝chsoch3，-oh，(s)-trans-ococh＝chsoch3，-ococh2ch(ch3)2，-ococ(ch3)chch3或-ococh(ch3)2；取代基团中：(r)表示右旋，(s)表示左旋，trans表示顺式，cis表示反式。
[0017]
本发明的部分蜂斗菜内酯类化合物的化学名及其r
1 r2组合如表1所示。
[0018]
表1本发明优选蜂斗菜内酯类化合物
[0019]
[0020][0021]
进一步的，所述的毛裂蜂斗菜提取物所含的活性物质蜂斗菜内酯类化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0022]
(a)提取
[0023]
毛裂蜂斗菜根茎粉碎后，用20-95％的含水乙醇按常规热提、冷浸或渗漉提取，得提取液，提取液减压浓缩，浓缩后离心或过滤，取上清液或过滤液；
[0024]
(b)纯化
[0025]
将上述上清液或过滤液通过聚苯乙烯型多孔性吸附树脂吸附，用水-50％的含水低级醇淋洗除去杂质，再用上样生药质量的4-12倍量体积的60-95％的含水低级醇洗脱，收集洗脱液，所说的低级醇选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或戊醇；
[0026]
(c)浓缩、干燥
[0027]
按常规将洗脱液减压浓缩、干燥，即得毛裂蜂斗菜总内酯。
[0028]
(d)毛裂蜂斗菜总内酯中所含蜂斗菜内酯类化合物的分离纯化：
[0029]
将上述制得的毛裂蜂斗菜总内酯溶于水制成混悬液，用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取部分，经减压浓缩，得到乙酸乙酯萃取物。将乙酸乙酯萃取物进行反复硅胶柱层析，最终获得各类蜂斗菜内酯类化合物。
[0030]
经药效学动物实验表明，本发明的毛裂蜂斗菜总内酯及其所含蜂斗菜内酯类化合
物能够显著延长小鼠跑步力竭时间，并能增强小鼠四肢抓握力，同时毛裂蜂斗菜总内酯能够升高小鼠肝糖原含量、降低血乳酸含量、增强乳酸脱氢酶活力，证明其对运动能力有明显提升作用。因而可以用于制备提高运动能力的药物。
[0031]
进一步的，所述的药物是由药物活性成分毛裂蜂斗菜总内酯、蜂斗菜内酯类化合物，和药学上可接受的辅料组成的药物组合物。
[0032]
进一步的，所述的药物组合物可采用医学领域常规的方法，将毛裂蜂斗菜总内酯、蜂斗菜内酯类化合物作为活性成分与药学上可接受的辅料制成药物制剂。所述的药物制剂中，活性成分的重量含量为0.1％～99.9％。
[0033]
更进一步的，所述的药学上可接受的辅料，包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
[0034]
进一步的，所述的药物可以制成注射液、悬浮剂、粉剂、片剂、颗粒剂等多种形式，上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
[0035]
本发明优点在于：
[0036]
药效学试验结果表明，毛裂蜂斗菜总内酯及其所含的活性物质蜂斗菜内酯类化合物不仅能明显延长小鼠跑步力竭时间，而且还能明显增强小鼠四肢抓握力，同时毛裂蜂斗菜总内酯能够升高小鼠肝糖原含量、降低血乳酸含量、增强乳酸脱氢酶活力，证明其对运动能力有明显提升作用，因而可以适用制备提高运动能力的药物。本发明为全面开发毛裂蜂斗菜植物在提升运动能力方面的应用提供了新的手段。
具体实施方式
[0037]
下面结合实施例和生物活性试验，对本发明作详细描述。此仅作为说明本发明之用，不能用作对本发明保护范围的限制。
[0038]
实验用毛裂蜂斗菜petasites tricholobus franch.采集于四川成都郊区。
[0039]
实施例1：制备毛裂蜂斗菜总内酯
[0040]
本发明毛裂蜂斗菜总内酯的制备方法和步骤如下：
[0041]
(1)提取
[0042]
毛裂蜂斗菜根茎8kg粉碎后，用90％的含水乙醇65l按常规方法渗漉得提取液，提取液减压浓缩后离心，取上清液备用；
[0043]
(2)纯化
[0044]
将上述上清液反复两次进行聚苯乙烯型多孔性吸附树脂吸附，用水和50％的含水乙醇淋洗除去杂质后，用90l 80％的含水醇洗脱，收集洗脱液。
[0045]
(3)浓缩、干燥
[0046]
将洗脱液按常规减压浓缩，干燥，即得毛裂蜂斗菜总内酯。
[0047]
实施例2：制备毛裂蜂斗菜总内酯所含的部分蜂斗菜内酯类化合物
[0048]
取实施例1制备的毛裂蜂斗菜总内酯15g，溶于石油醚，按常规进行硅胶柱层析，以石油醚-丙酮60-5：1层析，依次得homofukinolide(5.8mg)、蜂斗菜内酯
‑ⅰ
a(23mg)、蜂斗菜内酯
‑ⅱ
a(57mg)、蜂斗菜内酯-b(1.1g)、蜂斗菜内酯
‑ⅲ
a(2.3g)、蜂斗菜内酯
‑ⅳ
a(2.5g)、蜂斗菜内酯
‑ⅴ
a(45mg)、蜂斗菜内酯-d(1.9g)。
[0049]
实施例3：用毛裂蜂斗菜制备蜂斗菜内酯类化合物
[0050]
毛裂蜂斗菜的干燥叶20kg，用乙醇回流提取三次，乙醇用量分别为150l、50l、25l，提取时间分别为2小时、1小时、半小时。提取液减压浓缩后加水溶解，制成混悬液，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，分别得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物。将乙酸乙酯萃取物利用硅胶柱层析(silica gel,ar,200-300mesh,for column chromatography,cas 63231-67-4,shanghai titan scientific co.,ltd)，以正己烷-乙酸乙酯(8:1-1:1)梯度洗脱，根据薄层层析监测结果，将洗脱液合并为十三份。将第四份进行硅胶柱层析，以正己烷：乙酸乙酯为20：1洗脱，洗脱液浓缩后继续进行硅胶层析，用正己烷-乙酸乙酯之比为50：1洗脱，依次得homofukinolide(22.7mg)，蜂斗菜内酯
‑ⅰ
a(54mg)，蜂斗菜内酯
‑ⅱ
a(159.8mg)，蜂斗菜内酯-fa(88.4mg)，蜂斗菜内酯-fb(32.1mg)，蜂斗菜内酯-i(15.4mg)，蜂斗菜内酯-j(12.6mg)，蜂斗菜内酯-k(20.4mg)，蜂斗菜内酯-m(19.9mg)，蜂斗菜内酯-na(11.2mg)，蜂斗菜内酯-nb(31.6mg)，蜂斗菜内酯-o(20.6mg)，蜂斗菜内酯-p(28.4mg)和蜂斗菜内酯-q(9.2mg)。将第五份经硅胶层析，正己烷-乙酸乙酯之比为10：1洗脱，得蜂斗菜内酯-de(2.5mg)，蜂斗菜内酯-df(1.3mg)，蜂斗菜内酯-dg(23.7mg)，蜂斗菜内酯-dh(3.7mg)，蜂斗菜内酯-g(527.9mg)，蜂斗菜内酯-h(796.3mg)，蜂斗菜内酯-b(2.3g)，蜂斗菜内酯
‑ⅲ
a(5.4g)，蜂斗菜内酯-r(31.1mg)，蜂斗菜内酯-s(19.6mg)，蜂斗菜内酯-t(10.9mg)，蜂斗菜内酯-ua(11.1mg)，蜂斗菜内酯-ub(13.7mg)，蜂斗菜内酯-v(12.2mg)，蜂斗菜内酯
‑ⅲ
(43.3mg)，蜂斗菜内酯-w(26.1mg)，蜂斗菜内酯-x(32.4mg)，蜂斗菜内酯-ya(8.6mg)，蜂斗菜内酯-yb(10.2mg)，蜂斗菜内酯-za(9.8mg)，蜂斗菜内酯-zb(9.4mg)。将第八部份经反复结晶过滤得蜂斗菜内酯
‑ⅳ
a(4.1g)，蜂斗菜内酯
‑ⅴ
a(40mg)。将第九部分经硅胶层析分离，得到蜂斗菜内酯-uc(0.9g)。将第十三份进行硅胶层析分离，以正己烷-乙酸乙酯之比为5：1洗脱，得蜂斗菜内酯-d(5.2g)，蜂斗菜内酯-db(55.0mg)，蜂斗菜内酯-dc(21.4mg)，蜂斗菜内酯-dd(13.2mg)，蜂斗菜内酯-l(8.8mg)。
[0051]
实施例4：药理活性试验一
[0052]
毛裂蜂斗菜总内酯及各内酯类化合物对小鼠跑步力竭时间的影响
[0053]
1.仪器与设备
[0054]
动物跑步机(型号sa101b，江苏赛昂斯)
[0055]
2.材料和方法
[0056]
2.1实验动物
[0057]
spf级6周龄c57bl/6小鼠，雄性，体重(18
±
2)g，由上海市计划生育科学研究所实验动物经营部提供，许可证号码：scxk(沪)2018-0006。
[0058]
动物饲养于清洁级动物房，自由进食与饮水，温度：(25
±
2)℃，湿度：40％～60％，人工照明模拟昼夜变化。本实验方案遵守动物保护、动物福利和伦理原则及相关规定。
[0059]
2.2实验分组
[0060]
取健康c57bl/6小鼠共108只，雄性，适应性饲养1周后随机分为9组：阴性对照组、红景天苷组、毛裂蜂斗菜总内酯低、中、高剂量组、蜂斗菜内酯-d组、蜂斗菜内酯-b组、蜂斗菜内酯
‑ⅳ
a组和蜂斗菜内酯
‑ⅲ
a组，每组12只。各组给药剂量分别为红景天苷组100mg/kg、毛裂蜂斗菜总内酯低剂量组20mg/kg、中剂量组40mg/kg、高剂量组和各蜂斗菜内酯化合物组均为80mg/kg，阴性对照组给予对应体积的0.5％cmc-na溶液，给药方式为灌胃给药，每日给药1次，连续给药21天。
[0061]
2.3检测指标与方法
[0062]
将各组小鼠置于动物跑步机上进行跑步，记录各组小鼠跑步力竭时间。力竭标志为小鼠停留在电刺激区域不理会人为驱赶，将其置于水平台面后可见四肢颤抖、呼吸急促、毛发潮湿无光泽、腹部贴地不能支撑。
[0063]
2.4统计学分析
[0064]
采用graphpad prism9.0统计学软件进行数据分析。有效数据以mean
±
sd表示，各组间均数比较采用anova、dunnett-t test。
[0065]
3.实验结果
[0066]
3.1毛裂蜂斗菜总内酯及各内酯类化合物对小鼠跑步力竭时间的影响，实验结果如表1所示。
[0067]
表1毛裂蜂斗菜总内酯及各内酯类化合物对小鼠跑步力竭时间的影响
[0068][0069]
注：与阴性对照组比，
**
p＜0.01，
***
p＜0.001，
****
p＜0.0001。
[0070]
由表1可以看出，毛裂蜂斗菜总内酯可剂量依赖性地延长小鼠跑步力竭时间，中、高剂量组与阴性对照组相比，差异有显著性(p＜0.01或p＜0.001)。低剂量组的力竭时间与红景天苷组相近。同时，各个蜂斗菜内酯类化合物也均能够显著延长小鼠跑步力竭时间(p＜0.0001)。
[0071]
力竭时间增加率(％)＝(给药组平均力竭时间-阴性对照组平均力竭时间)/阴性对照组平均力竭时间
×
100％
[0072]
实施例5：药理活性试验二
[0073]
毛裂蜂斗菜总内酯及各内酯类化合物对小鼠四肢抓握力的影响
[0074]
1.仪器与设备
[0075]
大小鼠抓力测试仪(型号zs-zl，北京众实迪创)。
[0076]
2.材料和方法
[0077]
2.1实验动物
[0078]
spf级6周龄c57bl/6小鼠，雄性，体重(18
±
2)g，由上海市计划生育科学研究所实验动物经营部提供，许可证号码：scxk(沪)2018-0006。
[0079]
动物饲养于清洁级动物房，自由进食与饮水，温度：(25
±
2)℃，湿度：40％～60％，人工照明模拟昼夜变化。本实验方案遵守动物保护、动物福利和伦理原则及相关规定。
[0080]
2.2实验分组
[0081]
取健康c57bl/6小鼠共108只，雄性，适应性饲养1周后随机分为9组：阴性对照组、红景天苷组、毛裂蜂斗菜总内酯低、中、高剂量组、蜂斗菜内酯-d组、蜂斗菜内酯-b组、蜂斗菜内酯
‑ⅳ
a组和蜂斗菜内酯
‑ⅲ
a组，每组12只。各组给药剂量分别为红景天苷组100mg/kg、毛裂蜂斗菜总内酯低剂量组20mg/kg、中剂量组40mg/kg、高剂量组和各蜂斗菜内酯化合物组均为80mg/kg，阴性对照组给予相应体积的0.5％cmc-na溶液，给药方式为灌胃给药，每日给药1次，连续给药21天。
[0082]
2.3检测指标与方法
[0083]
将小鼠四肢全部置于抓力测定仪上，记录其抓力最大值。
[0084]
2.4统计学分析
[0085]
采用graphpad prism9.0统计学软件进行数据分析。有效数据以mean
±
sd表示，各组间均数比较采用anova、dunnett-t test。
[0086]
3.实验结果
[0087]
3.1毛裂蜂斗菜总内酯及各内酯类化合物对小鼠四肢抓握力的影响，实验结果如表2所示。
[0088]
表2毛裂蜂斗菜总内酯及各内酯类化合物对小鼠四肢抓握力的影响
[0089]
[0090]
注：与阴性对照组比，
*
p＜0.05，
**
p＜0.01，
***
p＜0.001。
[0091]
由表2可以看出，毛裂蜂斗菜总内酯各剂量组均可明显提升小鼠四肢抓握力，与阴性对照组相比，差异具有显著性，并呈剂量依赖性。同时，各个蜂斗菜内酯类化合物也均能够显著提升小鼠四肢抓握力(p＜0.001)。
[0092]
抓握力提升率(％)＝(给药组平均抓握力-阴性对照组平均抓握力)/阴性对照组平均抓握力
×
100％
[0093]
实施例6：药理活性试验三
[0094]
毛裂蜂斗菜总内酯对运动性疲劳小鼠肝糖原、血清乳酸及乳酸脱氢酶的影响
[0095]
1.仪器与设备
[0096]
动物跑步机(型号sa101b，江苏赛昂斯)
[0097]
2.材料和方法
[0098]
2.1实验动物
[0099]
spf级6周龄c57bl/6小鼠，雄性，体重(18
±
2)g，由上海市计划生育科学研究所实验动物经营部提供，许可证号码：scxk(沪)2018-0006。
[0100]
动物饲养于清洁级动物房，自由进食与饮水，温度：(25
±
2)℃，湿度：40％～60％，人工照明模拟昼夜变化。本实验方案遵守动物保护、动物福利和伦理原则及相关规定。
[0101]
2.2实验分组
[0102]
取健康c57bl/6小鼠共27只，雄性，适应性饲养1周后随机分为3组：阴性对照组、红景天苷组、毛裂蜂斗菜总内酯高剂量组(ptb组)，每组9只。各组给药剂量分别为红景天苷组100mg/kg、毛裂蜂斗菜总内酯高剂量组80mg/kg，阴性对照组给予对应体积的0.5％cmc-na溶液，给药方式为灌胃给药，每日给药1次，连续给药21天。
[0103]
2.3检测指标与方法
[0104]
各组动物连续给药14天后，将其置于动物跑步机上以10-17.5m/min的速度进行跑步，30min/天，连续7天(即第14-20天)。第21天给药后，将各组小鼠置于动物跑步机上，初速度为10m/min，终速度为17.5m/min，跑步时间为120min。运动结束后，各组小鼠取血、组织，采用试剂盒测定相应指标。
[0105]
2.4统计学分析
[0106]
采用graphpad prism9.0统计学软件进行数据分析。有效数据以mean
±
sd表示，各组间均数比较采用anova、dunnett-t test。
[0107]
3.实验结果
[0108]
3.1毛裂蜂斗菜总内酯对运动性疲劳小鼠肝糖原、血清乳酸及乳酸脱氢酶的影响，实验结果如表3所示。
[0109]
表3毛裂蜂斗菜总内酯对运动性疲劳小鼠肝脏糖原、血清乳酸及乳酸脱氢酶的影响
[0110][0111]
注：与阴性对照组比，*p＜0.05，**p＜0.01，****p＜0.0001。
[0112]
上述实验结果表明，毛裂蜂斗菜总内酯及各个内酯类化合物均能明显延长小鼠跑步力竭时间，并增强小鼠四肢抓握能力。同时，毛裂蜂斗菜总内酯能够升高小鼠肝糖原含量、降低血乳酸含量、增强乳酸脱氢酶活力，证明其对运动能力有明显提升作用。
[0113]
鉴于毛裂蜂斗菜总内酯及其所含的蜂斗菜内酯类化合物在提高运动能力方面具有良好的效果，因而可以用于制备提高运动能力的药物。
[0114]
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。