一种胃癌代谢基因预后预测方法和装置

1.本发明涉及基因检测技术领域，尤其是涉及一种胃癌代谢基因预后预测方法和装置。


背景技术：

2.胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一。近几十年来，由于采取了有效的预防措施和早期诊断策略，部分地区胃癌的发病率逐渐下降。然而，在晚期诊断出的不能手术的胃癌病例仍然具有较差的预后。根据globocan 2018的数据，胃癌在全球癌症死亡率中排名第三，仅次于肺癌和结直肠癌。因此，为了更加个体化的管理，仍然迫切需要准确预测胃癌患者的临床结果。
3.长期以来，重新编程的代谢模式被认为是癌症的标志。与正常细胞相比，肿瘤细胞可以有不同的营养获取和消耗方式来获得和维持恶性特征。癌症代谢最著名的特征是即使在富氧微环境中也会增加糖酵解和乳酸的产生，这被称为“warburg效应”。迄今为止，普遍认为葡萄糖是癌细胞的主要能量来源。然而，人们越来越意识到癌细胞的代谢表型在很大程度上是异质的。一些肿瘤细胞主要利用糖酵解，而其他一些肿瘤具有氧化磷酸化的代谢特性。越来越多的证据表明肿瘤细胞中糖酵解与oxphos通路之间存在代谢共生。例如，糖酵解产生的乳酸和丙酮酸可以作为三羧酸循环中间体的底物(tca)帮助在邻近细胞中生成三磷酸腺苷(atp)。同样，其他一些非葡萄糖营养素(即游离脂肪酸、氨基酸)也可以作为替代燃料来满足肿瘤细胞的能量负担。由于肿瘤细胞复杂的代谢特征可以极大地影响患者的临床结局，更深入地了解癌症代谢特征可能对于开发新疗法和确定预后预测因素至关重要。
4.授权公告号为cn107586852b的发明公开了一种基于22个基因的胃癌腹膜转移预测模型及其应用，提供了胃癌腹膜转移预测基因模型及其应用，包括pclo、uggt1、znf714、kiaa0825、col23a1、med1、npas2、ttc14、rps27a、asph、arhgef12、sik1、pappa、hhipl1、myo9b、itpkb、znf862、mknk1、muc6、trrap、duox1和krtap52；选定分类器svm及阳性判断阈值0.5，据此有效特异地对腹膜转移风险进行预测。
5.该方案通过计算存在snv的基因在腹膜转移和非腹膜转移组中的样品个数，得到两组针对每个基因的阳性率占比，用假设检验统计筛选出两组间阳性率存在显著差异(即p《0.05)的基因，得到22个预测胃癌腹膜转移的基因，但该方案选取的基因个数仍太多，没有更深入地探索胃癌代谢特征。


技术实现要素：

6.本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种效能优良、检测基因数少的胃癌代谢基因预后预测方法和装置。
7.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
8.一种胃癌代谢基因预后预测方法，包括以下步骤：
9.获取待测样本多个基因的rna表达水平进行检测，所述多个基因包括dync1i1基
因、gper1基因、mfap2基因、arrb1基因、c3基因和gli1基因；
10.根据检测出的多个基因的表达水平，计算胃癌预后风险评分。
11.进一步地，所述胃癌预后风险评分的计算表达式为：
12.riskscore6＝0.38585*exp
dync1i1
+0.10411*exp
gper1
+0.04476*exp
mfap2-0.70386*exp
arrb1
+0.09187*exp
c3
+0.21797*exp
gli1
13.式中，riskscore6为胃癌预后风险评分，exp
dync1i1
为以自然常数e为底的dync1i1基因的表达水平结果，exp
gper1
为以自然常数e为底的gper1基因的表达水平结果，exp
mfap2
为以自然常数e为底的mfap2基因的表达水平结果，exp
arrb1
为以自然常数e为底的arrb1基因的表达水平结果，exp
c3
为以自然常数e为底的c3基因的表达水平结果，exp
gli1
为以自然常数e为底的gli1基因的表达水平结果。
14.进一步地，所述方法还包括：将检测出的多个基因的rna表达水平载入预先建立并训练好的分类器中，计算胃癌预后风险评分，将胃癌预后风险评分大于预设的风险阈值的待测样本划分为高风险组，否则划分为低风险组。
15.本发明还提供一种胃癌代谢基因预后预测装置，包括：
16.数据获取模块，被配置为：获取待测样本中多个基因的rna表达水平，所述多个基因包括dync1i1基因、gper1基因、mfap2基因、arrb1基因、c3基因和gli1基因；
17.胃癌预后风险评分计算模块，被配置为：根据检测出的多个基因的表达水平，计算胃癌预后风险评分。
18.进一步地，所述胃癌预后风险评分的计算表达式为：
19.riskscore6＝0.38585*exp
dync1i1
+0.10411*exp
gper1
+0.04476*exp
mfap2-0.70386*exp
arrb1
+0.09187*exp
c3
+0.21797*exp
gli1
20.式中，riskscore6为胃癌预后风险评分，exp
dync1i1
为以自然常数e为底的dync1i1基因的表达水平结果，exp
gper1
为以自然常数e为底的gper1基因的表达水平结果，exp
mfap2
为以自然常数e为底的mfap2基因的表达水平结果，exp
arrb1
为以自然常数e为底的arrb1基因的表达水平结果，exp
c3
为以自然常数e为底的c3基因的表达水平结果，exp
gli1
为以自然常数e为底的gli1基因的表达水平结果。
21.进一步地，所述装置还包括：
22.风险分类模块，被配置为：将检测出的多个基因的表达水平载入预先建立并训练好的分类器中，通过所述胃癌预后风险评分计算模块计算胃癌预后风险评分，将胃癌预后风险评分大于预设的风险阈值的待测样本划分为高风险组，否则划分为低风险组。
23.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
24.(1)本发明第一次通过代谢相关基因dync1i1，gper1，mfap2，arrb1，c3，gli1预测胃癌患者的临床预后状态；
25.该6基因模型具有较强的鲁棒性，能够在不同平台的数据集中发挥稳定的预测效能；在训练集和验证集中都具有较好的auc，并且是具有独立于临床特征的模型，建议使用该模型作为分子诊断测试来评估胃癌患者的预后风险。
26.(2)本发明从587个能量代谢基因中选择胃癌的关键预后因素，并创新地构建了一个稳健的6基因的代谢相关模型以用于胃癌患者的生存预测。该模型在来自癌症基因组图谱(tcga)数据集中被诊断为胃腺癌的339个样本中进行了训练和验证，并用来自geo数据库
的gse62254数据集的300个肿瘤样本进行了外部验证。最后，将本模型与目前已发表的基于其他研究背景的胃癌转录组预后预测模型进行了对比，本模型表现了最好的预后效果。
附图说明
27.图1为本发明实施例中提供的一种胃癌代谢基因预后预测方法的流程示意图；
28.图2为本发明实施例中提供的一种使用nmf算法鉴定分子亚型的过程结果示意图；
29.图3为本发明实施例中提供的一种wgcna共表达分析的过程结果示意图；
30.图4为图3中e区域的局部放大图；
31.图5为本发明实施例中提供的一种训练集风险模型构建和风险模型的roc分析的过程结果示意图；
32.图6为本发明实施例中提供的一种内部数据集验证6-gene signature的鲁棒性的过程结果示意图；
33.图7为本发明实施例中提供的一种外部数据集验证6-gene signature的鲁棒性的过程结果示意图；
34.图8为本发明实施例中提供的一种风险模型与其他模型的比较结果示意图。
具体实施方式
35.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
36.因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
37.应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
38.在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，或者是该发明产品使用时惯常摆放的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
39.需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本技术的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
40.此外，术语“水平”、“竖直”等术语并不表示要求部件绝对水平或悬垂，而是可以稍微倾斜。如“水平”仅仅是指其方向相对“竖直”而言更加水平，并不是表示该结构一定要完全水平，而是可以稍微倾斜。
41.实施例1
42.如图1所示，本实施例提供一种胃癌代谢基因预后预测方法，包括以下步骤：
43.s1：获取待测样本，对多个基因的rna表达水平进行检测，多个基因包括dync1i1基因、gper1基因、mfap2基因、arrb1基因、c3基因和gli1基因；
44.s2：根据检测出的多个基因的表达水平，计算胃癌预后风险评分。
45.最优选地，胃癌预后风险评分的计算表达式为：
46.riskscore6＝0.38585*exp
dync1i1
+0.10411*exp
gper1
+0.04476*exp
mfap2-0.70386*exp
arrb1
+0.09187*exp
c3
+0.21797*exp
gli1
47.式中，riskscore6为胃癌预后风险评分，exp
dync1i1
为以自然常数e为底的dync1i1基因的表达水平结果，exp
gper1
为以自然常数e为底的gper1基因的表达水平结果，exp
mfap2
为以自然常数e为底的mfap2基因的表达水平结果，exp
arrb1
为以自然常数e为底的arrb1基因的表达水平结果，exp
c3
为以自然常数e为底的c3基因的表达水平结果，exp
gli1
为以自然常数e为底的gli1基因的表达水平结果。
48.作为一种可选的实施方式，方法还包括：将检测出的多个基因的表达水平载入预先建立并训练好的分类器中，计算胃癌预后风险评分，将胃癌预后风险评分大于预设的风险阈值的待测样本划分为高风险组，否则划分为低风险组。
49.作为一种优选的实施方式，方法还包括：
50.本实施例中，计算出riskscore6后，将riskscore6进行z-score变换为risk score(数据标准化)，将risk score大于零的样本划分为高风险组，小于零的样本为低风险组。
51.本实施例还提供一种胃癌代谢基因预后预测装置，包括：
52.数据获取模块，被配置为：获取待测样本基因组dna中多个基因的表达水平，多个基因包括dync1i1基因、gper1基因、mfap2基因、arrb1基因、c3基因和gli1基因；
53.胃癌预后风险评分计算模块，被配置为：根据检测出的多个基因的表达水平，计算胃癌预后风险评分。
54.最优选地，胃癌预后风险评分的计算表达式为：
55.riskscore6＝0.38585*exp
dync1i1
+0.10411*exp
gper1
+0.04476*exp
mfap2-0.70386*exp
arrb1
+0.09187*exp
c3
+0.21797*exp
gli1
56.式中，riskscore6为胃癌预后风险评分，exp
dync1i1
为以自然常数e为底的dync1i1基因的表达水平结果，exp
gper1
为以自然常数e为底的gper1基因的表达水平结果，exp
mfap2
为以自然常数e为底的mfap2基因的表达水平结果，exp
arrb1
为以自然常数e为底的arrb1基因的表达水平结果，exp
c3
为以自然常数e为底的c3基因的表达水平结果，exp
gli1
为以自然常数e为底的gli1基因的表达水平结果。
57.作为一种可选的实施方式，装置还包括：
58.风险分类模块，被配置为：将检测出的多个基因的表达水平载入预先建立并训练好的分类器中，通过胃癌预后风险评分计算模块计算胃癌预后风险评分，将胃癌预后风险评分大于预设的风险阈值的待测样本划分为高风险组，否则划分为低风险组。
59.本实施例中，对上述六个基因的筛选过程如下：
60.1、数据下载
61.使用tcga gdc api下载最新的临床随访信息，从ncbi下载miniml格式的gse62254
芯片表达数据。gse62254包含300个具有临床特征的样本。
62.表达谱数据来源：tcga的rna-seq数据、临床随访信息数据。geo验证数据：gse62254。
63.能量代谢相关基因来源：从reactome(https://reactome.org/)下载11个人类代谢相关通路，整理出总共有587个与能量代谢有关的基因。
64.2、数据预处理
65.2.1、tcga数据预处理
66.对tcga的rna-seq数据做以下几步预处理：
67.1)去掉没有临床数据和pfs《30天的样本；
68.2)去掉正常组织样本数据；
69.3)去掉在30％样本中fpkm为0的基因；
70.4)保留能量代谢相关基因的表达谱。
71.2.2、geo数据预处理
72.对gse62254数据做以下几步预处理：
73.1)去掉正常组织样本数据；
74.2)将pfs数据为year或month的转成days；
75.3)去掉pfs《30天的样本；
76.4)利用bioconductor包将芯片探针map到人类基因symbol。
77.3、基于能量代谢基因的分子分型
78.3.1、使用nmf算法鉴定分子亚型
79.本实施例首先从tcga表达谱数据中提取这587个能量代谢基因的表达量，结果有1个基因未找到，进一步本实施例保留30％以上样本具有表达不为0的基因，最终有584个基因用于后续分析；接下来，通过r中coxph函数进行单因素cox分析，得到与胃pfs相关(p《0.05)的86个基因通过非负矩阵聚类算法(nmf)对stad样本进行聚类，nmf方法选择标准“brunet”，进行50次迭代。将聚类数量k设定为2至10，通过r包“nmf”确定共有成员矩阵的平均轮廓宽度，每个子类最少成员设置为10。根据cophenetic和rrs等指标确定最优聚类数量，选择最优聚类数量为2(图2a)。
80.进一步分析两组聚类间的预后关系，结果显示cluster1组的样本预后差并且与cluster2存在显著差异(图2b，log rank p＝0.025)，两个子类中预后相关的能量代谢相关基因表达情况见图2c，从图中可以看出大部分cluster2中能量代谢基因的表达高于cluster1中的基因。
81.4、亚型之间共表达基因分析
82.4.1、wgcna共表达分析
83.根据这584个编码基因的表达谱使用wgcna共表达算法挖掘共表达的编码基因与共表达模块，首先本实施例根据tcga数据库中的tpm数据，从中提取出蛋白编码基因的表达谱，并使用层次聚类对样本进行聚类分析去除离群的1个样本(图3a)；进一步使用皮尔森相关系数计算每一个gene之间的距离，使用r软件包wgcna进行构建权重共表达网络，选择软阈值为8，筛选共表达模块。研究表明共表达网络符合无尺度网络，即出现连接度为k的节点的对数log(k)与该节点出现的概率的对数log(p(k))要负相关，且相关系数要大于0.8。为
了确保网络为无尺度网络，本实施例选择β＝8(图3b-c)。下一步将表达矩阵转换成邻接矩阵，然后再将邻接矩阵转换成拓扑矩阵，基于tom，本实施例使用average-linkage层次聚类法对基因进行聚类，按照混合动态剪切树的标准，并设置每个基因网络模块最少的基因数目：30。在使用动态剪切法在确定基因模块后，本实施例依次计算每个模块的特征向量值(eigengenes)，然后对模块进行聚类分析，将距离较近的模块合并成新的模块，设置height＝0.25、deepsplit＝2、minmodulesize＝30。共得到了29个模块(图3d)，需要指出的是grey模块是无法聚集到其它模块的基因集合。
84.本实施例进一步分析了每个模块与病人性别、年龄、t、n、m、stage及cluster1和cluster2的相关性如图3b所示，从中可以看出与cluster1和cluster2显著相关的模块分别为yellow和brown，其中yellow模块包含667个基因，brown模块包含1046个基因。最后本实施例整合模块与表型的相关性结果和模块中基因与表型的相关性结果进一步分析两者之间的相关性如，从而推测基因与表型的关系，其中相关性越高则说明该表型与该模块越相关，分析发现yellow模块与cluster1和brown模块与cluster2的相关性很好(图3e和图4)。
85.4.3、模块基因ppi网络构建及网络拓扑性质分析
86.考虑到研究蛋白之间的相互作用网络有助于挖掘核心的关键基因，因此为了识别胃癌的潜在调控基因，本实施例将筛选得到的亚型相关模块的基因集映射到了人类ppi网络中，进而提取其互作关系。string数据库包含到目前为止较为全面的蛋白互作网络(https://string-db.org/)，为了观察这些基因之间的联系，本实施例将这些基因分别映射到了string数据库中使用score大于0.9获取这些基因的互作关系，并使用cytoscope进行可视化。这1713个共表达基因共映射到了3585个互作关系，进一步本实施例通过cytoscope中的cytohubba模块进行hub节点识别，这里本实施例分析根据degree、closeness和betweenness三种方法计算前15个节点，hub节点网络，从中可以看出三种分析方法得到的hub基因基本一致。
87.进一步本实施例深入研究网络拓扑性质。首先本实施例网络中度的分布，呈现幂律分布，大多数基因degree小于5；接下来同样本实施例计算了网络的closeness，发现多数节点closeness整体较高，基本上都在100以上，最后本实施例计算网络的betweenness分布，大部分节点epc在0。高的degree、clsoenessor或者高的betweenness都被认为是网络中重要的节点，本实施例选择同时满足degree、closeness、betweenness大于各自中值以上的节点作为通路网络的hub gene，其中包含的基因共220个，这些基因认为是与胃癌发生发展密切相关，这些基因可以作为stad的预后标志物。
88.5、构建基于hub genes的预后风险模型
89.5.1、训练集风险模型构建和风险模型的roc分析
90.首先从预处理后的339个tcga样本中随机抽取50％的样本作为模型构建的训练集。针对每一个hub genes以及生存数据进行单变量cox比例风险回归模型。利用r包survival coxph function，选择log rank p《0.05作为阈值，最终显著预后差异基因共有8个。为在保持较高准确率的条件下进一步的缩小基因范围并构建预后模型，本实施例使用r软件包glmnet进行lasso cox回归分析，首先分析每个自变量的变化轨迹如图5a所示，从中可以看出随着lambda的逐渐增大，自变量系数趋于0的个数也逐渐增多，本实施例使用10-fold交叉验证进行模型构建，分析每个lambda下的置信区间，从图5b中可以看出当lambda
＝0.01876213时模型达到最优。本实施例选择lambda＝0.01876213时的6个基因作为最终模型。最终6-mrna signature公式如下：
91.riskscore6＝0.38585*exp
dync1i1
+0.10411*exp
gper1
+0.04476*exp
mfap2-0.70386*exp
arrb1
+0.09187*exp
c3
+0.21797*exp
gli1
92.根据样本的表达水平分别计算每个样本的风险得分，并绘制样本的riskscore分布(图5c)，从图中可以看出风险得分高的样本的pfs明显小于得分低的，这提示了高的riskscore样本具有更差的预后，6个不同的signature基因随着风险值的增加表达的变化情况，鉴定了dync1i1、gper1、mfap2、c3、gli1的高表达和高风险相关，为危险因素，arrb1的高表达和低风险相关，为保护因素。进一步的本实施例使用r软件包timeroc对riskscore进行预后分类的roc分析，本实施例分别分析了一年、三年、五年的预后预测分类效率，结果显示模型具有很高的auc线下面积，auc在0.70以上(图5d)；最后本实施例对riskscore进行zscore，将zscore化后riskscore大于零的样本划分为高风险组，小于零的样本低风险组，并绘制km曲线(图5e)，从中可以看出他们存在极显著的差异logrank p＝2e-04，hr＝2.663(1.558-4.551)，其中79个样本被划分为高风险组，91个样本为低风险组。
93.5.2、内部数据集验证6-gene signature的鲁棒性
94.为了确定模型的鲁棒性，本实施例在内部测试集中采用与训练集相同的模型和相同的系数。本实施例同样根据样本的表达水平分别计算每个样本的风险得分(图6a)，本实施例分别在内部测试集使用r软件包timeroc对riskscore进行预后分类的roc分析，本实施例分别分析了一年、二年、三年的预后预测分类效率(图6b)，可以看出模型具有很高的auc线下面积，内部测试集1年auc在0.71，所有tcga数据集5年auc在0.72；最后本实施例同样对该数据集的riskscore进行zscore，将zscore化后riskscore大于零的样本划分为高风险组，小于零的样本低风险组，并绘制km曲线(图6c)结果显示内部测试集中logrank p＝0.01，hr＝2.04(1.169-3.561)，其中82个样本被划分为高风险组，87个样本为低风险组。
95.5.3、外部数据集验证6-gene signature的鲁棒性
96.在geo外部验证集中采用与训练集相同的模型和相同的系数。本实施例同样根据样本的表达水平分别计算每个样本的风险得分(图7a)，并绘制样本的riskscore分布，从图中可以看出风险得分高的样本的pfs明显小于得分低的，这提示了高的riskscore样本具有更差的预后，6个不同的模型基因随着风险值的增加表达的变化情况，鉴定了dync1i1、gper1、mfap2、c3、gli1的高表达和高风险相关，为危险因素，arrb1的高表达和低风险相关，为保护因素。进一步的本实施例使用r软件包timeroc对riskscore进行预后分类的roc分析，本实施例分别分析了一年、三年、五年的预后预测分类效率，从中可以看出模型具有很高的auc线下面积，五年auc在0.70(图7b)；最后本实施例同样对riskscore进行zscore，将zscore化后riskscore大于零的样本划分为高风险组，小于零的样本低风险组，并绘制km曲线，从中可以看出他们存在极显著的差异logrank p《0.0001，hr＝2.358(1.693-3.283)，其中152个样本被划分为高风险组，148个样本为低风险组(图7c)。
97.6、风险模型与其他模型的比较
98.通过查阅查考文献，本实施例最终选择了三个预后相关风险模型：wang等人的5基因模型[pmid:23912700doi:10.1007/s12032-013-0678-5]，lee等人的6基因模型[pmid:21447720doi:10.1158/1078-0432.ccr-10-2180]和yang等人的10基因模型[pmid:
31354215doi:10.21147/j.issn.1000-9604.2019.03.08]用于与本实施例的6-genes模型进行比较。为了使模型具有一定可比性，本实施例根据这3个模型中对应的基因，使用相同的方法计算了tcga中每个stad样本风险得分，评估每个模型的roc，并根据中位风险得分将样本分成risk-h和risk-l组，计算两组样本pfs预后差异。3个模型的roc和pfs-km曲线图，可以看出这三个模型的结果均差于本实施例6-genes模型，如图8a-c，进一步的比较了这些模型的restricted mean survival曲线如图8d，从中可以看出4个模型中本实施例模型的具有最高的c-index，在长期的生存预测中更有优势，同时本实施例通过dca曲线比较了6基因模型和3个模型的预测效果，结果显示本实施例模型的性能优于其他3个如图8e。
[0099]
总结：
[0100]
1、基于584个能量代谢相关基因对tcga的339个stad样本进行分型，可以将这些样本分成2个亚型，亚型之间在预后上表现出显著差异。
[0101]
2、通过wgcna分析发现yellow和brown两个模块分别与cluster1和cluster1两个分型相关性最高；基于共表达基因构建ppi互作网络并分析网络的拓扑性质，寻找hub基因。
[0102]
3、基于hub基因构建6-gene signature预后pfs模型；
[0103]
4、6-gene signature具有较强的鲁棒性，能够在不同平台的数据集中发挥稳定的预测效能。
[0104]
5、总之，在本研究中，本实施例开发了一个6-genes signature预后分层系统，在训练集和验证集中都具有较好的auc，并且是具有独立于临床特征的模型，因此，本实施例建议使用该分类器作为分子诊断测试来评估胃癌患者的预后风险。
[0105]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。