一种针对STING靶点的小分子抑制剂及其应用的制作方法

一种针对sting靶点的小分子抑制剂及其应用
技术领域
1.本发明涉及小分子药物领域，具体涉及一种针对sting靶点的小分子抑制剂及其应用。


背景技术：

2.cgas-sting信号通路是i型干扰素反应和nf-κb信号通路的重要上游通路，是一种独特的胞内核酸识别和响应机制。cgas可在特异性识别胞质内积累的病原体或癌细胞来源的dna后，催化由atp和gtp合成2,3-cgamp；后者可与内质网膜上的sting蛋白结合促使其向高尔基体转运，在此处通过磷酸化tbk1激酶激活干扰素调节因子irf3，或通过磷酸化ikk激活nf-κb信号通路，从而启动一系列合成干扰素和炎症细胞因子的免疫应答，在感染和肿瘤免疫中发挥重要作用。
3.然而，因异常dna累积而造成的cgas或sting的过度激活也可能诱发炎症因子风暴，从而对正常的组织细胞造成损伤，甚至引起自身免疫性疾病。通过抑制cgas-sting信号通路及其介导的下游固有免疫反应的过度激活已被证明是治疗自身免疫性疾病的潜在靶点，但目前市场上特异性抑制该通路的药物仍处于空白阶段。因此通过筛选和活性测定实验寻找能够特异性抑制cgas-sting信号通路、从而降低体内il-1β、il-6、mmp-1、mmp-3等促炎调节因子过度表达的小分子化合物，可以为开发针对多种自身免疫性疾病的辅助治疗方法提供新的思路和手段。
4.花生四烯酸(arachidonic acid,ara)是一种二十碳的直链多不饱和脂肪酸。如图1所示，其脂肪烃链上有四个碳碳双键，其中第一个碳碳双键出现在从甲基端数第6号c原子上，故将其称为一种n-6多不饱和脂肪酸。对于人体而言，花生四烯酸是一种常见的必需脂肪酸，也是营养学上常见的膳食补充剂，在血脂代谢调控和婴儿神经发育等生理过程中发挥重要的作用。以花生四烯酸为代表的n-6多不饱和脂肪酸是多种炎性细胞因子的合成前体，因此传统在营养学上将其视为一种能够促进机体炎症反应的物质。但近来有研究表明花生四烯酸分子自身可与某些炎症信号通路中的关键元件结合从而在特定情况下发挥抑制炎症的生物学功能，故具有潜在的抗炎功效，但作为抗炎药物的应用尚未得到有效开发。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种针对sting靶点的小分子抑制剂-花生四烯酸及其在制备抗炎药物和治疗自身免疫性疾病药物中的应用。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明的第一方面是提供一种针对sting靶点的小分子抑制剂，其为花生四烯酸或其衍生物、类似物、药学上可接受的盐中的一种或多种。
8.进一步地，上述小分子抑制剂为花生四烯酸。
9.本发明的第二方面是提供上述小分子抑制剂在制备抗炎药物中的应用，该药物的主要活性成分为花生四烯酸或其衍生物、类似物、药学上可接受的盐中的一种或多种；优选
为花生四烯酸。
10.本发明的第三方面是提供上述小分子抑制剂在制备抑制/阻断cgas-sting通路激活的药物中的应用，该药物的主要活性成分为花生四烯酸或其衍生物、类似物、药学上可接受的盐中的一种或多种；优选为花生四烯酸。
11.进一步地，上述药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
12.进一步地，上述药物的剂型为滴剂、片剂、胶囊剂或粉剂。
13.进一步地，上述药物的给药途径为口服。
14.本发明的第四方面是提供一种治疗自身免疫性疾病的药物，其包括花生四烯酸或其衍生物、类似物、药学上可接受的盐中的一种或多种。
15.进一步地，上述药物被施用后，发挥如下作用：
16.a.cgas-sting信号通路被抑制；
17.b.炎症因子inf-β和趋化因子cxcl10被抑制；和
18.c.炎症反应被抑制。
19.本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
20.本发明验证了花生四烯酸能够特异性识别sting蛋白并通过与之结合抑制其下游信号通路，从而抑制机体炎症和自身免疫反应的过度激活。因此结合先进的药物递送手段，花生四烯酸可在自身免疫病的治疗中发挥重要的潜在临床转化价值，从而降低患者的疾病负担、改善生存状况。
附图说明
21.图1是花生四烯酸分子的结构式(图a)和球棍模型图(图b)；
22.图2是本发明一实施例中与sting蛋白反应前后小分子生物芯片的oi-rd差值图像；
23.图3是本发明一实施例中内源性sting蛋白与花生四烯酸的免疫共沉淀的实验结果图；
24.图4显示了本发明一实施例中spr法测定sting与花生四烯酸的亲和力结果；。
25.图5是本发明一实施例中sting和花生四烯酸结合模式图；
26.图6显示了本发明一实施例中不同浓度花生四烯酸对cgamp刺激mpm细胞后4h inf-β(图a)和cxcl10(图b)表达的影响。
具体实施方式
27.本发明提供了一种针对sting靶点的小分子抑制剂及其应用。具体地，本发明的第一方面是提供一种针对sting靶点的小分子抑制剂，其为花生四烯酸或其衍生物、类似物、药学上可接受的盐中的一种或多种。
28.在本发明一优选的实施方式中，上述小分子抑制剂为花生四烯酸。
29.本发明的第二方面是提供上述小分子抑制剂在制备抗炎药物中的应用，该药物的主要活性成分为花生四烯酸或其衍生物、类似物、药学上可接受的盐中的一种或多种；优选为花生四烯酸。
30.本发明的第三方面是提供上述小分子抑制剂在制备抑制/阻断cgas-sting通路激
活的药物中的应用，该药物的主要活性成分为花生四烯酸或其衍生物、类似物、药学上可接受的盐中的一种或多种；优选为花生四烯酸。
31.在本发明一优选的实施方式中，上述药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
32.在本发明一优选的实施方式中，上述药物的剂型为滴剂、片剂、胶囊剂或粉剂。
33.在本发明一优选的实施方式中，上述药物的给药途径为口服。
34.本发明的第四方面是提供一种治疗自身免疫性疾病的药物，其包括花生四烯酸或其衍生物、类似物、药学上可接受的盐中的一种或多种。
35.在本发明一优选的实施方式中，上述药物被施用后，发挥如下作用：
36.a.cgas-sting信号通路被抑制；
37.b.炎症因子inf-β和趋化因子cxcl10被抑制；和
38.c.炎症反应被抑制。
39.下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
40.实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
41.实施例1
42.本实施例高通量筛选出特异性结合sting的小分子，具体的实验方法和结果如下：
43.使用生物芯片(smm)结合斜入射光反射差(oi-rd)法可对与sting互作的潜在小分子化合物进行高通量筛选，从而为开发以sting为靶点的药物提供依据。向含有8101个fda批准的活性小分子的微阵列上加入1.5ml浓度10μg/ml的sumo-sting蛋白溶液反应1h，并在反应前后分别使用oi-rd技术进行扫描，可得与sting蛋白反应前后的小分子微阵列的oi-rd差值图像，如图2所示。oi-rd差值图像中的相邻双亮点代表加入sting蛋白前后发生变化的小分子物质，其中便包括能够与sting蛋白特异性结合或反应的小分子物质。
44.实施了3次独立的筛选，其中至少2次显示为阳性点的小分子被认为是可信的与sting蛋白结合的化合物，根据上述分析初步发现花生四烯酸具有和sting蛋白特异性结合的能力。
45.实施例2
46.本实施例在实施例1结果的基础上，验证sting蛋白与花生四烯酸能够特异性结合，具体的实验步骤和结果如下：
47.在hek293t细胞中表达sting蛋白，向细胞经ip细胞裂解液裂解后的产物中分别加入生物素(biotin)以作为对照组和不同浓度的带有biotin标签的ara作为实验组，使用连接了链霉亲和素(streptavidin)的beads对孵育后的上述混合物进行免疫沉淀；通过western blot法测定使用beads所沉淀下来的各组混合物中sting蛋白的含量。
48.western blot结果如图3所示，结果表明相对于加入biotin的组，加入biotin-ara的组中含有的sting蛋白的量显著增多，表明花生四烯酸具有与sting蛋白发生特异性结合的能力。
49.实施例3
50.本实施例进一步测定sting蛋白与花生四烯酸的亲和力，具体的实验步骤和结果如下：
51.使用表面等离子共振(surface plasmon resonance,spr)技术对sting蛋白和花生四烯酸小分子间的亲和力进行测定。使用ph4.0的10mm醋酸钠将sting蛋白稀释至浓度为50μg/ml后，通过氨基偶联方式将其固定于cm5芯片上。随后在25℃下，以ph 7.4的pbs-p缓冲液(含5％dmso)为running buffer，使不同浓度(0.2、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100μm)的花生四烯酸溶液以50μl/min的速度流过；其中样品溶液进样到芯片表面90秒，在每个结合反应后自然解离150秒让信号回到基线。平衡和动力学常数使用1:1结合模型(bia evaluation software)global fits计算得出。
52.spr实验结果如图4所示，结果表明sting蛋白和花生四烯酸能够发生结合，亲和力常数约为kd＝21.45μm。
53.实施例4
54.本实施例模拟sting蛋白与花生四烯酸分子的对接，具体的步骤和结果如下：
55.分别从pdb和pubchem数据库中获取sting蛋白和花生四烯酸分子的结构信息，使用autodocktool 1.5.6进行准备后，使用gromacs软件进行两者结合的分子动力学模拟的相关运算。在分子动力学模拟过程中对体系的能量、蛋白结构及小分子结构波动的rmsd进行监测，以研究分子动力学过程中体系相关性质随时间的变化情况。
56.实验结果显示花生四烯酸与sting蛋白的对接结合能为-5.5kcal/mol，其通过与sting蛋白二聚体其中之一的thr267、leu158和ser162三个位点形成氢键发生相互作用，同时与另外一个二聚体之一的ser162可以产生弱氢键相互作用，其结合模式如图5所示。
57.实施例5
58.本实施例从细胞水平验证花生四烯酸的抗炎作用，具体的实验步骤和结果如下：
59.对小鼠腹腔巨噬细胞(mouse peritoneal macrophages,mpm)施加cgamp刺激并加入不同浓度的花生四烯酸(10、50、100、200、500μm)，4h后使用qpcr测定细胞内炎症因子inf-β和趋化因子cxcl10的表达情况。
60.结果如图6所示，花生四烯酸抑制了两者的表达，且抑制程度与花生四烯酸的浓度呈正相关，表明花生四烯酸具有潜在通过抑制cgas-sting信号通路激活而产生的抗炎功能。
61.以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。