一种用于骨髓间充质干细胞成骨分化的促进剂的制作方法

一种用于骨髓间充质干细胞成骨分化的促进剂
1.本案为分案申请，原申请的发明名称为长链非编码rna在干细胞成骨分化和成脂分化中的作用，原申请的申请日为：2020-06-22，原申请的申请号为：cn202010575929.2。
技术领域
2.本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种用于骨髓间充质干细胞成骨分化的促进剂。


背景技术：

3.骨质疏松是一种全身性，机体代谢性的骨骼病变。骨质疏松的主要病理特征为骨量下降，骨微结构受损和骨脆性上升，其主要临床表现为病理性骨折和腰背痛。随着老龄化水平的不断加剧，骨质疏松开始受到越来越多的人的关注。
4.骨髓间充质干细胞是一类具有多分化和自我更新能力的干细胞类型，其可以在不同的条件下分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、成肌细胞等。骨髓间充质干细胞具有易于获取，免疫排斥小，来源途径丰富等优势，因此已被用于临床治疗。人体中，骨髓间充质干细胞的成骨分化和成脂分化之间是一种相互制约的平衡关系，也就是说，成脂分化的发生会抑制骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，同样成骨分化的发生会抑制骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化。在骨质疏松的发生发展过程中，骨量减少和骨髓中脂肪含量增加与骨髓间充质干细胞成脂分化和成骨分化的失调是相吻合的。因此，通过抑制骨髓间充质干细胞的成脂分化来治疗骨质疏松是切实可行的。
5.长链非编码rna是一类长度大于200bp的非编码rna，起初，研究人员认为其是基因组转录中的“噪音”，但是随着对其研究的不断深入，研究人员发现长链非编码rna参与细胞周期调控，胚胎发育以及细胞分化等多种生命活动。现有的研究表明，长链非编码rna的表达水平异常或者是功能异常与肿瘤、阿兹海默症等多种疾病紧密相关。同时，最近的研究表明，长链非编码rna与干细胞多潜能的维持与分化紧密相关。目前，关于linc02075在骨髓间充质干细胞中成脂分化和成骨分化中的相关作用研究尚未见报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供长链非编码rna linc02075在抑制骨髓间充质干细胞成脂分化和促进骨髓间充质干细胞成骨分化中的应用。
7.为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种抑制骨髓间充质干细胞成脂分化的分子干预靶点，所述分子干预靶点为linc02075。
8.优选地，所述linc02075的转录本序列如seq id no.1所示。
9.此外，本发明提供了linc02075基因抑制剂在制备骨髓间充质干细胞成脂分化抑制剂中的应用。
10.优选地，所述基因抑制剂为sirna，化学修饰sirna，shrna中的一种。
11.优选地，所述基因抑制剂为shrna。
12.优选地，所述shrna的正义链为：5'-caccgctcctgaagaaacagcttagcgaactaagctgtttcttcaggagc
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3'，所述shrna的反义链为：5'-aaaagctcctgaagaaacagcttagttcgctaagctgtttcttcaggagc
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3'。
13.此外，本发明提供了linc02075基因抑制剂在制备骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂中的应用。
14.优选地，所述基因抑制剂为shrna，所述shrna的正义链为：5'-caccgctcctgaagaaacagcttagcgaactaagctgtttcttcaggagc
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3'，所述shrna的反义链为：5'-aaaagctcctgaagaaacagcttagttcgctaagctgtttcttcaggagc
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3'。
15.除此之外，本发明提供了linc02075基因抑制剂在制备治疗骨质疏松药物中的应用。
16.本发明的有益效果在于：本发明首次证明长链非编码rna linc02075能够显著的抑制骨髓间充质干细胞成脂分化相关基因pparγ、c/ebpα和ap2来抑制骨髓间充质干细胞成脂分化，同时，抑制linc02075能够显著的促进成骨分化相关基因ocn、alp和runx2来促进骨髓间充质干细胞成骨分化，从而为进一步开发治疗骨髓疏松药物提供可能。
附图说明
17.图1 成脂分化7天和14天时linc02075的表达水平变化图2 sh-linc02075对于linc02075 mrna表达水平的抑制效果图3 抑制linc02075对于成脂分化相关基因pparγ、c/ebpα和ap2 mrna水平的影响图4 抑制linc02075对于成脂分化相关基因pparγ、c/ebpα和ap2 蛋白水平的影响图5 油红o染色检测抑制linc02075对于骨髓间充质干细胞成脂分化的影响图6 抑制linc02075对于成骨分化相关基因ocn、alp和runx2 mrna水平的影响图7 抑制linc02075对于成骨分化相关基因ocn、alp和runx2蛋白水平的影响。
具体实施方式
18.实施例1荧光定量pcr检测成脂诱导过程中的linc02075的表达水平1.成脂诱导（1）选取处于对数生长期的第三代人骨髓间充质干细胞（购于sciencell公司）接种到培养瓶中，加入完全培养基进行培养；（2）当细胞融合度达到70%时，将培养基更换为成脂诱导培养基，每3天进行一次更
换，成脂诱导14天后，提取rna。
19.2.rna提取分别在第0天，7天和14天提取rna，每组设置3个对照。
20.（1）去除培养基，每孔加入500μl trizol，反复的吹打细胞，直到形成清亮不粘稠的液体；（2）将混合液转移至1.5ml ep管中，加入100μl氯仿,在振荡器上剧烈震荡充分混匀15s，室温静置5分钟；（3）4℃，低温高速离心机，12000r/min离心15min，小心将上层透明rna水相转移至新的无rna酶ep管中；（4）加入等体积的异丙醇混匀，冰上放置10min，13000r/min，4℃离心10min，弃去上清，可见管底白色沉淀；（5）加入400μl 70%酒精温和震荡，12000rpm/min 4℃ 5min，弃去上清液体，管口向下，紧贴滤纸，吸尽管口的液体，室温下干燥5-10min，检测rna浓度和质量。
21.3.rna反转录为cdna（1）反转录体系（2）反转录反应条件37℃ 15min；85℃ 5s；4℃4.荧光定量pcr反应反应体系:反应条件：95℃ 10min；95℃ 20s，60℃ 40s，40个循环；72℃ 5min。
22.引物序列
实验结果实验结果如图1所示，从图中可以看出，成脂诱导7天后，linc02075的相对表达量为3.13
±
0.13（p 《 0.0001），成脂诱导14天后，linc02075的相对表达量为3.95
±
0.22（p《 0.0001），上述结果说明，在成脂诱导的过程中，linc02075的表达量显著上调。
23.实施例2荧光定量pcr检测sh-linc02075的抑制效果（1）sh-linc02075序列如下：正义链：5'-caccgctcctgaagaaacagcttagcgaactaagctgtttcttcaggagc
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3'（seq id no.6）反义链：5'-aaaagctcctgaagaaacagcttagttcgctaagctgtttcttcaggagc
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3'（seq id no.7）（2）慢病毒载体由吉凯基因公司构建，按照转染说明书转染骨髓间充质干细胞，48h后提取rna，进行荧光定量检测，步骤同实施例1。
24.实验结果实验结果如图2所示，从图中可以看出，sh-linc02075的抑制率为70.4%。
25.实施例3抑制linc02075对于骨髓间充质干细胞成脂分化相关基因pparγ、c/ebpα和ap2 mrna水平的影响1. pparγ、c/ebpα和ap2的引物序列如下：基因名称引物序列pparγgcccaggtttgctgaatgtg（seqidno.8） ttggcaaacagctgtgagga（seqidno.9）c/ebpαagaacagcaacgagtaccgg（seqidno.10） gcggtcattgtcactggtca（seqidno.11）ap2tgggccaggaatttgacgaa（seqidno.12） ccatcccatttctgcacatgt（seqidno.13）2.将转染sh-nc和sh-linc02075的骨髓间充质干细胞接种于培养板上，进行成脂诱导，成脂诱导14天后，提取rna，使用荧光定量pcr检测sh-nc组和sh-linc02075组之间pparγ、c/ebpα和ap2的表达差异。
26.实验结果实验结果如图3所示，从图中可以看出抑制linc02075之后，可以显著的抑制成脂分化相关基因pparγ、c/ebpα和ap2的表达，其中，pparγ的相对表达量为0.52
±
0.02（p 《 0.0001），c/ebpα的相对表达量为0.22
±
0.05（p 《 0.0001），ap2的相对表达量为0.41
±
0.04（p 《 0.0001）。
27.实施例4抑制linc02075对于骨髓间充质干细胞成脂分化相关基因pparγ、c/ebpα和ap2蛋白水平的影响。
28.1.蛋白提取（1）将转染sh-nc和sh-linc02075的骨髓间充质干细胞接种于培养板上，进行成脂诱导，成脂诱导14天后，将100μl ripa裂解液加入到培养板中，用细胞刮刀将细胞刮下，将细胞裂解液收集至ep管中；（2）用细胞超声破碎仪将细胞破碎，4℃，12000r/min，离心15min；（3）将上清转移至新的ep管中，使用bca法测量蛋白浓度；（4）使用5
×
上样缓冲液调整蛋白浓度为2μg/μl，沸水煮5min，得到蛋白样品。
29.2.western blot实验（1）配置12%分离胶，5%浓缩胶，每孔加入10μl蛋白样品；（2）电泳条件：浓缩胶为恒压90v，时间约20分钟；分离胶为130v，时间约1h；（3）电转条件：恒流280ma，0.45nm孔径nc膜；转膜时间1.5h；（4）用镊子轻轻将膜取出，置于5%脱脂奶粉中，室温封闭1h；（5）按照蛋白大小裁剪条带，孵育相应的c/ebpα、pparγ、ap2和β-actin一抗，4℃孵育过夜；（6）第二天将膜取出，在室温下孵育30min，用tbst洗膜，每次3分钟，重复3次；（7）孵育二抗，室温，摇床孵育1h；（8）用tbst洗膜，每次3分钟，重复3次，进行显影曝光。
30.实验结果实验结果如图4所示，从图中可以看出，相较于sh-nc组，sh-linc02075组的c/ebpα、pparγ、ap2的蛋白表达量显著低于si-nc组，说明抑制linc02075能够显著的抑制成脂分化相关基因c/ebpα，pparγ、ap2的蛋白表达。
31.实施例5油红o染色检测（1）将转染sh-nc和sh-linc02075的骨髓间充质干细胞接种于培养板上，进行成脂诱导；（3）成脂诱导14天后，弃掉培养基，用pbs轻轻的清洗细胞3次，每次3分钟，加入10%甲醛固定40分钟；（4）弃掉甲醛，加入500μl油红o染色液，染色30分钟；（5）将油红o去除，用pbs轻轻的清洗细胞3次，每次3分钟，倒置显微镜下观察并进行拍照。
32.实验结果实验结果如图5所示，从图中可以看出，转染sh-linc02075组的油红o染色的细胞数量显著低于转染sh-nc组，说明抑制linc02075能够有效的抑制骨髓间充质干细胞发生成脂分化，抑制骨髓间充质干细胞变为脂肪细胞。
33.实施例6
1.成骨诱导（1）选取处于对数生长期的第三代人骨髓间充质干细胞（购于sciencell公司）接种到培养瓶中，加入完全培养基进行培养；（2）当细胞融合度达到70%时，将培养基更换为成骨诱导培养基，每3天进行一次更换。
34.2.荧光定量pcr检测抑制linc02035对于成骨分化相关基因ocn、alp和runx2 mrna水平的影响（1）ocn、alp和runx2的引物序列如下：分子名称序列runx2ttctccaacccacgaatgca（seqidno.14） ggtgtggtagtgagtggtgg（seqidno.15）alptcgttgacacctggaagagc（seqidno.16） cctgttcagctcgtactgca（seqidno.17）ocngtgcagcctttgtgtccaag（seqidno.18） cggattgagctcacacacct（seqidno.19）2.将转染sh-nc和sh-linc02075的骨髓间充质干细胞接种于培养板上，进行成骨诱导，成骨诱导7天后，提取rna，使用荧光定量pcr检测sh-nc组和sh-linc02075组之间runx2、alp和ocn的表达差异，实验步骤同实施例1。
35.实验结果实验结果如图6所示，从图中可以看出，sh-linc02075组的runx2、alp和ocn的mrna表达量显著高于sh-nc组，其中，runx2的相对表达量为2.38
±
0.26（p 《 0.01），ocn的相对表达量为3.82
±
0.16（p 《 0.0001），alp的相对表达量为3.04
±
0.25（p 《 0.01），从上述结果可以看出，抑制linc02075能够显著促进成骨分化相关基因的mrna水平表达。
36.实施例7实施例4抑制linc02075对于骨髓间充质干细胞成脂分化相关基因pparγ、c/ebpα和ap2蛋白水平的影响。
37.1.蛋白提取（1）将转染sh-nc和sh-linc02075的骨髓间充质干细胞接种于培养板上，进行成脂诱导，成骨诱导7天后，将100μl ripa裂解液加入到培养板中，用细胞刮刀将细胞刮下，将细胞裂解液收集至ep管中；（2）用细胞超声破碎仪将细胞破碎，4℃，12000r/min，离心15min；（3）将上清转移至新的ep管中，使用bca法测量蛋白浓度；（4）使用5
×
上样缓冲液调整蛋白浓度为2μg/μl，沸水煮5min，得到蛋白样品。
38.2.western blot实验（1）配置12%分离胶，5%浓缩胶，每孔加入10μl蛋白样品；（2）电泳条件：浓缩胶为恒压90v，时间约20分钟；分离胶为130v，时间约1h；（3）电转条件：恒流280ma，0.45nm孔径nc膜；转膜时间1.5h；（4）用镊子轻轻将膜取出，置于5%脱脂奶粉中，室温封闭1h；
（5）按照蛋白大小裁剪条带，孵育相应的ocn、alp、runx2和β-actin一抗，4℃孵育过夜；（6）第二天将膜取出，在室温下孵育30min，用tbst洗膜，每次3分钟，重复3次；（7）孵育二抗，室温，摇床孵育1h；（8）用tbst洗膜，每次3分钟，重复3次，进行显影曝光。
39.实验结果实验结果如图7所示，从图中可以看出，抑制linc02075后，成骨培养相关基因ocn、alp和runx2的蛋白表达量明显高于对照组，说明抑制linc02075可以显著促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。