一种脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法与流程

1.本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法。


背景技术：

2.间充质干细胞是具有高度自我更新能力和多项分化潜能的多能干细胞，广泛存在于骨髓、脂肪、羊膜液、胎盘、脐带血及脐带组织中。脐带间充质干细胞是存在于新生儿脐带华通氏胶和血管周围组织中的一种间充质干细胞。来源于脐带的间充质干细胞取材方便，无道德伦理争议，增殖能力强、免疫调节作用大，分泌细胞生长因子的总量也非常高，不仅可以应用到临床治疗中，而且其细胞培养过程中产生的培养上清液也具有非常好的美容护肤作用。
3.脐带间充质干细胞培养上清液含有大量的细胞生长因子等营养物质，能够有效的促进皮肤细胞的新陈代谢，促进表皮细胞的生长、分化和修复，同时能够加速角质层修复，加速基底新老细胞更替，在美容修复领域具有极其广阔的应用前景。
4.现有技术中已有很多利用脐带间充质干细胞因子溶液作为生物美容原料的研究，但目前市面上对该类因子的应用较为简单，由于干细胞因子在溶液中稳定性不佳，活性极易下降而失效，不利于作为生物美容原料应用。为了便于细胞因子的有效保存，可以采用冻干的方式得到细胞因子冻干粉。但是冻干过程会损伤细胞因子的活性，导致冻干后的细胞因子含量低，不稳定，无法长时间保存等，影响应用效果。因此有必要研究一种脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，提高冻干粉中细胞因子的稳定性，延长保存时间。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，能有效保证冻干粉中细胞因子的稳定性，延长保存时间，操作简便，易于实现。
6.本发明的目的采用如下技术方案实现：一种脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，包括以下步骤：（1）制备脐带间充质干细胞因子浓缩液；（2）向脐带间充质干细胞因子浓缩液中加入保护剂混合均匀；所述保护剂包括以下重量份的原料：小球藻粉3.5-5.5份、银杏内酯b1.7-3.2份、生育酚乙酸酯0.4-0.8份、木糖醇5-8份；（3）冷冻干燥得到脐带间充质干细胞因子冻干粉。
7.进一步地，所述保护剂包括以下重量份的原料：小球藻粉4.5份、银杏内酯b2.4份、生育酚乙酸酯0.5份、木糖醇6份。
8.进一步地，每10ml脐带间充质干细胞因子浓缩液中加入保护剂0.8-1.4g。
9.进一步地，每10ml脐带间充质干细胞因子浓缩液中加入保护剂1.1g。
10.进一步地，所述脐带间充质干细胞因子浓缩液采用以下方法制备得到：a：取传代培养收获的脐带间充质干细胞接种至培养基中，在低氧条件下进行培养，当细胞融合度达到75-85%后收集培养上清液；b：将收集的培养上清液过滤后采用超滤膜进行透析，收集截留液即为脐带间充质干细胞因子浓缩液。
11.进一步地，所述培养基包括dmem/f12培养基和添加在培养基中的以下成分：l-谷氨酰胺5-10μg/ml、胰岛素10-15μg/ml、右旋糖苷7.5-12μg/ml、l-抗坏血酸20-30ng/ml。
12.进一步地，所述低氧培养条件为：5-8%o2，5%co2，37℃。
13.进一步地，步骤b中先用0.22μm滤膜过滤，然后再用40-50kd的超滤膜进行透析，透析液再过50-80d的超滤膜，收集截留液即得脐带间充质干细胞因子浓缩液。
14.进一步地，所述传代培养收获的脐带间充质干细胞为p1-p5代细胞。
15.相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，在脐带间充质干细胞因子的浓缩液中加入保护剂：小球藻粉、银杏内酯b、生育酚乙酸酯、木糖醇，提高冻干粉中细胞因子的含量和稳定性，延长细胞因子产品的保存时间，为脐带间充质干细胞因子的各种应用提供保障。
具体实施方式
16.下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
17.实施例1一种脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，包括以下步骤：（1）制备脐带间充质干细胞因子浓缩液；a：取传代培养收获的p3代脐带间充质干细胞接种至培养基中，培养基包括dmem/f12培养基和添加在培养基中的以下成分：l-谷氨酰胺8μg/ml、胰岛素12μg/ml、右旋糖苷9.5μg/ml、l-抗坏血酸25ng/ml，在7%o2，5%co2，37℃条件下进行培养，当细胞融合度达到80%后收集培养上清液；b：将收集的培养上清液先用0.22μm滤膜过滤，然后再用45kd的超滤膜进行透析，透析液再过60d的超滤膜，收集截留液即得脐带间充质干细胞因子浓缩液。
18.（2）向脐带间充质干细胞因子浓缩液中加入保护剂混合均匀，每10ml脐带间充质干细胞因子浓缩液中加入保护剂1.1g；保护剂由以下重量份的原料组成：小球藻粉4.5份、银杏内酯b2.4份、生育酚乙酸酯0.5份、木糖醇6份；（3）冷冻干燥得到脐带间充质干细胞因子冻干粉。
19.实施例2一种脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，包括以下步骤：（1）制备脐带间充质干细胞因子浓缩液；a：取传代培养收获的p2代脐带间充质干细胞接种至培养基中，培养基包括dmem/f12培养基和添加在培养基中的以下成分：l-谷氨酰胺5μg/ml、胰岛素10μg/ml、右旋糖苷7.5μg/ml、l-抗坏血酸20ng/ml，在5%o2，5%co2，37℃条件下进行培养，当细胞融合度达到75%后收集培养上清液；
b：将收集的培养上清液先用0.22μm滤膜过滤，然后再用40kd的超滤膜进行透析，透析液再过50d的超滤膜，收集截留液即得脐带间充质干细胞因子浓缩液。
20.（2）向脐带间充质干细胞因子浓缩液中加入保护剂混合均匀，每10ml脐带间充质干细胞因子浓缩液中加入保护剂0.8g；保护剂由以下重量份的原料组成：小球藻粉3.5份、银杏内酯b1.7份、生育酚乙酸酯0.4份、木糖醇5份；（3）冷冻干燥得到脐带间充质干细胞因子冻干粉。
21.实施例3一种脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，包括以下步骤：（1）制备脐带间充质干细胞因子浓缩液；a：取传代培养收获的p5代脐带间充质干细胞接种至培养基中，培养基包括dmem/f12培养基和添加在培养基中的以下成分：l-谷氨酰胺10μg/ml、胰岛素15μg/ml、右旋糖苷12μg/ml、l-抗坏血酸30ng/ml，在8%o2，5%co2，37℃条件下进行培养，当细胞融合度达到85%后收集培养上清液；b：将收集的培养上清液先用0.22μm滤膜过滤，然后再用50kd的超滤膜进行透析，透析液再过80d的超滤膜，收集截留液即得脐带间充质干细胞因子浓缩液。
22.（2）向脐带间充质干细胞因子浓缩液中加入保护剂混合均匀，每10ml脐带间充质干细胞因子浓缩液中加入保护剂1.4g；保护剂由以下重量份的原料组成：小球藻粉5.5份、银杏内酯b3.2份、生育酚乙酸酯0.8份、木糖醇8份；（3）冷冻干燥得到脐带间充质干细胞因子冻干粉。
23.对比例1对比例1提供一种脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，和实施例1的区别为：省去保护剂中的小球藻粉，其余均和实施例1相同。
24.对比例2对比例2提供一种脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，和实施例1的区别为：省去保护剂中的小球藻粉，将银杏内酯b的用量调整为6.9份，其余均和实施例1相同。
25.对比例3对比例3提供一种脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，和实施例1的区别为：省去保护剂中的银杏内酯b，其余均和实施例1相同。
26.对比例4对比例4提供一种脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，和实施例1的区别为：省去保护剂中的银杏内酯b，将小球藻粉的用量调整为6.9份，其余均和实施例1相同。
27.对比例5对比例5提供一种脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，和实施例1的区别为：省去保护剂中的银杏内酯b和小球藻粉，其余均和实施例1相同。
28.对比例6对比例6提供一种脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，和实施例1的区别为：省去保护剂，其余均和实施例1相同。
29.将上述冻干粉在4℃条件下保存，选取成纤维细胞生长因子（fgf）、表皮生长因子（egf）作为代表，采用elisa试剂盒分别检测上述细胞因子在实施例1，对比例1至6的冻干粉
保存0月（即完成冻干后立即检测）、6个月、12个月后的含量，检测冻干粉中的水分含量，结果如表1至3所示。
30.表1表2表3
由表1和表2可以看出，实施例1冻干粉中的fgf、egf含量高于对比例1至6，并且随着保存时间的延长，实施例1冻干粉中的fgf、egf含量下降趋势较为缓慢。对比例1至6中分别调整了保护剂的成分，省去了小球藻粉、银杏内酯b中的一种或者多种，或者不添加保护剂，随着保存时间的延长，fgf、egf含量下降显著，说明本发明的制备方法通过添加上述保护剂有效提高冻干粉中细胞因子的含量，并且提高冻干粉的稳定性，延长了冻干粉的保存时间。
31.由表3可以看出实施例1的冻干粉中水分含量较低，并且随着保存时间的延长，水分含量增加不显著。对比例1至6中调整了保护剂的组成，省去了小球藻粉、银杏内酯b中的一种或者多种，或者不添加保护剂，随着保存时间的延长，冻干粉中水分含量增加较多，影响冻干粉的品质。由此可知本发明添加的保护剂能有效提高细胞因子冻干粉的稳定性，延长保存时间。
32.上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。