维生素B5在制备预防和/或治疗Th17细胞相关疾病的药物或制剂中的应用

维生素b5在制备预防和/或治疗th17细胞相关疾病的药物或制剂中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医学领域，具体涉及维生素b5在制备预防和/或治疗 th17细胞相关疾病的药物或制剂中的应用。


背景技术：

2.自身免疫疾病是由于免疫系统异常活化、进而攻击自身组织引起的慢性炎症反应，包括多发性硬化症(multiple sclerosis,ms)、炎性肠病 (inflammayory bowel disease,ibd)。导致自身免疫疾病产生的因素有很多，包括遗传因素和环境因素。免疫细胞作为介导自身免疫疾病发生的主要因素之一，其致病机理的研究备受关注。与经典的辅助性t细胞1(th1细胞)和辅助性t细胞2(th2细胞)不同，辅助性t细胞17(th17细胞) 发现相对较晚，但其因在调控自身免疫疾病发生发展中起重要作用而被广泛研究。th17细胞分泌il-17a、il-17f和gm-csf等细胞因子发挥其效应功能，但目前对于以il-17/il-17r信号通路作为靶点的治疗在多种自身免疫疾病中以失败告终，表明致病性th17细胞可能通过其他效应分子发挥其致病性功能。
3.为探究th17细胞在自身免疫疾病中的作用机理，国内外科学家相继报道了一些潜在的致病性分子。来自博德研究所的vijay kuchroo研究组通过单细胞转录组测序发现了cd5l作为胞内调控脂质代谢的分子进而调控致病性与非致病性th17细胞的平衡，为cd5l作为潜在治疗靶点提供了理论依据。同时，来自纽约大学的dan littman组研究发现，由肠道微生物诱导的肠上皮细胞分泌saas可作为新的诱导致病性th17细胞的炎症因子而不依赖于tgfβ。同时，dan littman组研究表明，在炎性组织低氧的微环境中致病性th17细胞更多依赖于糖酵解而非氧化磷酸化途径来维持其效应功能，靶向糖酵解通路中的gpi分子能够特异性抑制致病性th17细胞，而不影响非致病性th17细胞功能。在国内众多研究中，th17 细胞发现者之一、来自清华大学的董晨院士在阐明th17细胞分化方面做出了重要的贡献。董晨组研究表明，发烧作为机体抗感染的应答，但发烧条件下能够诱导致病性th17细胞分化进而加重th17相关的自身免疫疾病的发生发展。
4.th17细胞在正常生理条件下，对机体抗胞外菌、真菌感染具有重要作用，维持机体粘膜屏障稳态。但异常的调控会导致致病性th17细胞分化，进而介导自身免疫疾病发生。目前对于调控th17细胞致病性与非致病性的具体机制有待进一步阐明。
5.ms是一种由主要t细胞介导的以慢性炎症、髓鞘脱失、轴突损伤与神经变性为主要病理变化的中枢神经系统(central nervous system,cns) 自身免疫疾病。ms病因不明，发病过程中适应性免疫启动后，招募并活化cd4+t细胞，使其向致病的th17细胞极化，极化后向cns中迁移，攻击血脑屏障，导致血脑屏障损伤，一系列级联反应发生，引起炎症反应。 ibd是一种病因不明的慢性非特异性肠道炎症性疾病。该疾病包括3种主要类型：克罗恩病(cd)、溃疡性结肠炎(uc)和未分型ibd(ibd-u)。 ibd发病过程中主要是肠道在疾病诱导因素刺激下，肠道维持稳态的th17 细胞向致病性th17细胞转变，分泌大量炎性细胞因子，导
致细胞因子风暴，最终导致肠道炎症加重。
6.目前对于自身免疫疾病的治疗主要以免疫抑制剂使用为主，例如糖皮质激素以及其类似物等，普遍的在临床中使用。同时，也有研发大量的抗体来进行治疗。例如抗tnfa类药物在治疗自身炎症性肠病(ibd)中具有较好的临床效果，但仍然存在孕妇不响应的情况。近年来新型生物制剂的出现给自身免疫疾病患者带来了福音，但同时也面临着诸如响应率低、二次不响应及耐药抗体产生等问题。因此寻找新的治疗靶点是目前亟待解决的问题。
7.维生素b5(vitaminb5,pantothenic acid)，分子式c9h
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no5，分子量为： 219.23g/mol。作为一种可溶性微量元素，人体需要额外从食物中摄取以满足日常需要。2019年人类微生物组计划研究表明，维生素b5在活动期克罗恩病(cd)病人的粪便中显著降低。目前尚未有针对维生素b5在调节炎症性肠病(ibd)以及其他th17细胞参与的自身免疫疾病中的作用的研究，本技术通过对维生素b5治疗慢性自身免疫疾病的具体机制的研究，发现了维生素b5能够用于制备预防和/或治疗th17细胞相关疾病的药物或制剂。


技术实现要素：

8.有鉴于此，本发明的目的在于提供维生素b5在制备预防和/或治疗 th17细胞相关疾病的药物或制剂中的应用；所述th17细胞相关疾病包括自身免疫疾病。所述维生素b5为自身免疫疾病的预防和治疗提供了新方法。其中，维生素b5治疗慢性自身免疫疾病的具体机制：通过其下游已知的代谢产物辅酶a(coa)，结合pkm2激酶，抑制pkm2的磷酸化，同时促进pkm2四聚体的形成，抑制pkm2入核作为下游转录因子的 co-activator(共激活子)，从而抑制了th17细胞的葡萄糖代谢，抑制了th17 细胞参与的自身免疫疾病。
9.为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
10.本发明提供了维生素b5在制备预防和/或治疗th17细胞相关疾病的药物或制剂中的用途。
11.优选地，所述th17细胞相关疾病为th17细胞过度激活导致的炎症性疾病。
12.优选地，所述th17细胞相关疾病为自身免疫疾病。
13.优选地，所述自身免疫疾病包括多发性硬化症和炎症性肠病。
14.本发明还提供了维生素b5在制备抑制th17细胞分化的试剂或药物中的用途。
15.优选地，所述抑制th17细胞分化包括抑制th17细胞相关转录因子的水平。
16.优选地，所述th17细胞相关转录因子选自由il17a，csf2，rorc和rora 组成的组。
17.本发明的有益效果：与传统办法(抗-tnfa抗体，经典治疗ibd的药物，存在部分人群不响应的情况)相比较，维生素b5作为一种微量元素，对人体的副作用没有报道，并且仅通过口服的方式就可以得到很好的预防和治疗效果。
附图说明
18.图1示出了维生素b5对小鼠炎症性肠炎的改善的情况。其中，图1a 显示了小鼠肠炎模型诱导的流程，图1b显示了小鼠转输肠炎模型体重变化，图1c显示了小鼠肠炎模型第7周结肠长度分析，图1d显示了小鼠肠系膜淋巴结和脾脏的大小图片，图1e显示了小鼠结肠病理切片染色，可以看出当缺乏维生素b5时，外周肠壁明显增厚，黑色点状是淋巴细胞，浸润明显增多，而额外补充维生素b5，病理情况明显改善。图1f显示了流式分析小鼠固有层淋
巴细胞细胞因子比例和数目分析，图1g显示了流式分析小鼠肠系膜淋巴细胞细胞因子比例和数目分析。
19.图2示出了维生素b5对小鼠多发性硬化症的改善的情况。其中，图 2a显示了小鼠eae模型诱导的流程，图2b显示了小鼠eae发病瘫痪打分情况，图2c上显示了小鼠脊髓病理切片染色，可以看出当缺乏维生素 b5时，黑色点状(箭头所指示)是淋巴细胞，浸润明显增多，脊髓外侧白色斑块(箭头所指示)显示脱髓鞘症状，白色斑块增多，而额外补充维生素b5，病理情况明显改善。图2c下显示了小鼠髓鞘染色，图2d显示了流式分析小鼠大脑淋巴细胞细胞因子比例和数目分析，图2e显示了流式分析小鼠脊髓淋巴细胞细胞因子比例和数目分析。
20.图3示出了维生素b5对小鼠多发性硬化症的治疗的情况，其中，图 3a显示了小鼠eae发病瘫痪打分情况，图3b上显示了小鼠脊髓病理切片染色，额外补充维生素b5，病理情况明显改善。图3b下显示了小鼠髓鞘染色，图3c显示了流式分析小鼠大脑淋巴细胞细胞因子比例和数目分析，图3d显示了流式分析小鼠脊髓淋巴细胞细胞因子比例和数目分析。
21.图4a显示了维生素b5处理小鼠th17细胞体外分化实验。图4b显示了q-pcr检测维生素b5处理小鼠th17细胞后的细胞因子和转录因子水平mrna变化。图4c显示了辅酶a(coa)处理小鼠th17细胞体外分化实验。图4d显示了q-pcr检测辅酶a(coa)处理小鼠th17细胞的细胞因子和转录因子水平mrna变化。
22.图5a显示了维生素b5处理人th17细胞体外分化实验。图5b显示辅酶a处理人th17细胞体外分化实验。
具体实施方式
23.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
24.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
25.下述实施例采用graphpad8.0.2统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值
±
标准偏差表示，数据采用anova检验，两两比较采用t检验，多组采用tukey多重比较检验，p＜0.05(*)表示具有显著性差异，p＜ 0.01(**)表示具有极显著性差异，p＜0.001(***)表示具有极显著性差异。
26.下述实施例中的iceil-17a
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ires
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egfp reporter mice(荧光报告小鼠)由博德研究所的vijay kuchroo研究组提供。c57bl/6小鼠购买自江苏集萃药康生物技术股份有限公司，rag1-/-小鼠购买自江苏集萃药康生物技术股份有限公司购买，实验中小鼠年龄均为6-8周。
27.实施例1口服维生素b5可以有效改善小鼠炎症性肠炎
28.1.实验流程：
29.实验小鼠为rag1-/-(是一种t细胞和b细胞缺失的免疫功能缺陷小鼠) 分为三组(小鼠每组各7只，雄性，8周，体重均一，同窝对照)，第一组，给予小鼠正常食物和饮用水；第二组，给予小鼠维生素b5缺乏的食物(定制的缺乏维生素b5的食物，购自江苏南通特罗菲公
司)和饮用水；第三组，给予小鼠正常食物，同时在饮用水中额外添加维生素b5(50mg/kg/day 进行饲喂。提前两天给予小鼠以上处理(图1a)。接下来，诱导小鼠肠炎模型。每周监测小鼠体重，绘制小鼠体重变化曲线，转输当天记为第0周。在小鼠体重降低至90％以下，安乐死小鼠，通过流式细胞术分析，病理切片染色等，进行相对应临床指标评分。
30.2.cd45rbhi cd4 t细胞转输诱导的肠炎模型
31.cd45rbhi cd4 t细胞转输诱导的肠炎模型(包括溃疡性结肠炎和克罗恩病)是研究cd4 t细胞在肠炎发生过程中的作用的常用手段，也是模拟人炎症性肠病(ibd)的经典模型之一。转输的cd45rbhi cd4 t细胞在t、b细胞缺陷的rag1-/-小鼠中分化为不同的效应细胞亚群进而促进肠炎的发生。特别地，th17细胞在该模型中发挥重要作用。
32.利用流式分选技术，将野生型小鼠(江苏集萃药康生物技术股份有限公司购买)的cd4+cd25-cd45rbhigh t细胞分选出来，转输(腹腔注射) 到上面提到的三组rag1-/-小鼠中，每只小鼠转输细胞量为5x105，诱导小鼠肠炎模型。
33.具体地，取小鼠(c57bl/6小鼠，6-8周)脾脏、淋巴结于无菌钢网中充分研磨制备单细胞悬液；单细胞悬液加入15ml离心管中，500g，5min 离心；弃上清，每只脾脏加入2ml红细胞裂解液，室温裂红5min，每只脾脏加入8ml 1x pbs终止反应，500g，5min离心，1ml macs缓冲液 (1xpbs含有0.5％fbs和2mm edta)重悬沉淀，通过200目滤网过滤后进行细胞计数；mojosorttm小鼠cd4 t细胞分离试剂盒(bd)进行cd4 +t细胞富集(macs)；将富集后的细胞离心，计数及抗体标记；bd ariaiii上机分选cd4+cd25-cd45rbhit细胞；分选纯度检测(》95％即表示分选效果较好)；分选后的细胞于15ml离心管中500g离心5min，弃上清，用预冷的1x pbs重悬计数；取所需转输的细胞数，每只rag1-/-鼠转输5x105细胞(i.p.)，即200ul。注意记录转输前的初始体重。每周监测小鼠体重变化，当小鼠体重降到70～80％时需要取小鼠肠道进行分析。当体重降到90％以下时需要0.5周监测一次体重。
34.3.样品采集与处理方法
35.小鼠先用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，取小鼠结肠0.5mm段固定于甲醛中，用于后续病理染色，其余部分去除脂肪组织，用镊子将肠子内侧翻向外侧，剪成1cm小段，用含edta的1640培养基进行预消化处理， 37度，200rpm，摇床上摇20min，弃去液体，再重复改步骤2次；再用不含edta的培养基摇5min，最后用含有ii胶原酶对肠段进行消化，37℃， 180rpm，摇床上摇30min，最终得到的上清离心，即为肠道固有层淋巴细胞。
36.4.流式细胞术分析检测细胞数量
37.通过肠道固有层淋巴细胞分离技术，用含ii胶原酶的消化液消化预处理后的结肠，得到肠道固有层淋巴细胞，同时取小鼠肠系膜淋巴结，通过 200目滤网进行研磨，制备单细胞悬液。将分离得到的细胞离心后，用完全培养基加入佛波醇酯(phorbolester,pma)、离子霉素(ionomycin,ion)，在37℃二氧化碳培养箱中培养4小时，然后收集细胞pbs洗涤两次流式膜标记抗体cd4 dye染色20分钟后固定20分钟pbs洗涤两次,透膜液中加入流式胞内标记抗体il-17，4℃染色30分钟，1xperm缓冲液洗涤两次后150ul pbs重悬，流式细胞仪(贝克曼cytoflex)检测th17细胞百分比和数量。具体流式抗体详见如下表1。
38.表1 facs抗体
39.抗体克隆来源识别码抗-小鼠cd4 apcgk1.5biolegendcat#100412
抗-小鼠cd45.2apc-cy7104biolegendcat#109842抗-小鼠cd4 percp-cy5.5gk1.5biolegendcat#100434抗-小鼠il-17a petc11-18h10.1biolegendcat#506904抗-小鼠cd45rb pec363-16abiolegendcat#103308抗-小鼠cd25apcpc61biolegendcat#102012
40.5.病理切片染色
41.取项目3的肠道切片进行染色，先依次将切片放入二甲苯ⅰ10min-二甲苯ⅱ10min-无水乙醇ⅰ5min-无水乙醇ⅱ5min-95％酒精5min-90％酒精 5min-80％酒精5min-70％酒精5min-蒸馏水洗；切片入harris苏木素染 3-8min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗；切片入伊红染液中染色1-3min；将切片依次放入95％酒精i 5min
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95％酒精ii 5min-无水乙醇ⅰ5min-无水乙醇ⅱ5min-二甲苯ⅰ5min-二甲苯ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片；显微镜镜检，图像采集分析。
42.6.实验结果:
43.如图1b显示，实验结果表明在转输后第四周，缺乏维生素b5饲喂小鼠相较正常饮食小鼠体重开始降低，每周小鼠体重监测(图1b,**** p《0.0001)。发现在饮用水中额外添加维生素b5进行饲喂时，相较于正常饮食的小鼠，其体重有一定程度的上升趋势，小鼠的结肠长度也较长(备注：当小鼠结肠有炎症时，其长度会缩短)(图1c,**p《0.01,***p《0.001)。对小鼠的脾脏和肠系膜淋巴结进行拍照，发现相较于正常饮食的小鼠，其脾脏和淋巴结均没有明显肿胀(图1d)。通过h&e(对细胞核和细胞质进行染色)病理染色分析，发现相较于正常饮食的小鼠，其肠壁没有增厚，肠道隐窝处浸润的淋巴细胞明显减少(图1e)。发现饮用水中额外添加维生素b5进行饲喂时，肠道炎性th17细胞(表达il-17a+)的比例和数目都有明显的降低(图1f,1g,*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001,****p《0.0001)，和额外维生素b5饲喂具有很好的缓解小鼠肠炎的表型相一致。
44.而当小鼠用维生素缺乏的食物进行饲喂时，相较于正常饮食的小鼠，其体重明显下降(图1b,****p《0.0001)，小鼠的结肠长度也明显缩短(当小鼠结肠有炎症时，其长度会缩短)(图1c,**p《0.01,***p《0.001)。对小鼠的脾脏和肠系膜淋巴结进行拍照，发现相较于正常饮食的小鼠，其脾脏和淋巴结均有非常明显的肿胀(图1d)。通过牺牲小鼠，取小鼠肠道组织，进行h&e(对细胞核和细胞质进行染色)病理染色分析，发现相较于正常饮食的小鼠，其肠壁明显增厚，肠道隐窝处浸润的淋巴细胞明显增多(图 1e)。通过肠道固有层淋巴细胞分离技术，用含ii胶原酶的消化液消化预处理后的结肠，得到肠道固有层淋巴细胞，同时取小鼠肠系膜淋巴结，通过200目滤网进行研磨，制备单细胞悬液。通过流式细胞术检测肠道固有层淋巴细胞和肠系膜淋结中il-17a+细胞因子的表达，发现当用缺乏维生素b5进行饲喂时，肠道炎性th17细胞的比例和数目都有明显的上升(图 1f,g*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001,****p《0.0001)，和用缺乏维生素b5 的食物饲喂后加重肠炎的表型相一致。以上数据表明，在小鼠肠炎过程中给予额外添加维生素b5进行饲喂时，主要通过抑制th17细胞的分化减轻肠道炎症导致的体重降低并保护肠道淋巴细胞浸润，而当用缺乏维生素 b5的饮食进行饲喂时，小鼠肠炎明显加重，主要通过促进致病性th17细胞的分化加重炎症反应，加剧小鼠体重的减轻并加剧肠道淋巴细胞浸润。
42％percoll buffer 重悬，2000rpm，20℃，20min，升6降2离心。所得细胞沉淀用macs缓冲液重悬，即为小鼠大脑、脊髓淋巴单细胞悬液。
58.4.流式细胞术分析检测细胞数量
59.将上述3中分离得到的细胞离心后，用完全培养基加入佛波醇酯 (phorbolester，pma)、离子霉素(ionomycin，ion)，在37℃二氧化碳培养箱中培养4小时，然后收集细胞pbs洗涤两次流式膜标记抗体cd3 cd4 dye染色20分钟后固定20分钟pbs洗涤两次，透膜液中加入流式胞内标记抗体il-17，4℃染色30分钟，1xperm缓冲液洗涤两次后150ul pbs重悬，流式细胞仪(贝克曼cytoflex)检测th17细胞百分比和数量。具体流式抗体详见实施例1中的表1。
60.5.病理切片染色
61.脊髓切片进行he染色，先依次将切片放入二甲苯ⅰ10min-二甲苯ⅱ62.10min-无水乙醇ⅰ5min-无水乙醇ⅱ5min-95％酒精5min-90％酒精5min-80％酒精5min-70％酒精5min-蒸馏水洗；切片入harris苏木素染3-8min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗；切片入伊红染液中染色1-3min；将切片依次放入95％酒精i 5min-95％酒精ii 5min-无水乙醇ⅰ5min-无水乙醇ⅱ5min-二甲苯ⅰ5min-二甲苯ⅱ63.5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片；显微镜镜检，图像采集分析。lfb染色，切片经蒸馏水清洗后，放入0.1％lfb 溶液，于60℃密封浸染8-16h经蒸馏水清洗后，放入95％酒以0.05％碳酸锂水溶液分色经70％酒精继续分色，直至显微镜下观察灰、白质区分清晰为止。蒸馏水洗片后，用0.25％焦油紫溶液加数滴冰醋酸染液复染10min；70％酒精将复染颜色分至细胞核及尼氏体呈红色；滤纸沾尽多余液体，入正丁醇2次漂洗脱水，每次脱水时间3-5min；二甲苯透明，中性树胶封片。髓鞘呈鲜蓝色，核呈深蓝色。
64.6.实验结果
65.如图2b所示，通过每天对小鼠发病情况进行打分监测，发现在饮用水中额外添加维生素b5进行饲喂时，相较于正常饮食的小鼠，其eae发病情况具有明显减轻(图2b,***p《0.001,****p《0.0001)。通过h&e(对细胞核和细胞质进行染色)和lfb(髓鞘)病理染色分析，发现相较于正常饮食的小鼠，水中额外添加维生素b5进行饲喂时，其脊髓浸润的淋巴细胞明显减少，脱髓鞘的症状也明显减轻(图2c)。通过对脊髓和大脑的组织进行分离，用研磨棒将取出的小鼠组织研磨成单细胞悬液，配置42％的 percoll液，进行密度梯度离心，所得细胞沉淀即为脊髓和大脑的淋巴细胞，接下来，通过流式细胞术检测大脑和脊髓的细胞因子表达，检测发现饮用水中额外添加维生素b5进行饲喂时，大脑和脊髓th17细胞的比例和数目都有明显的降低，和额外维生素b5具有很好的缓解小鼠多发性硬化症的表型相一致(图2d，2e,*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001,****p《0.0001)。
66.而当小鼠用维生素缺乏的食物进行饲喂时，相较于正常饮食的小鼠，其eae发病情况具有明显加重(图2b,***p《0.001,****p《0.0001)。通过牺牲小鼠，取小鼠脊髓，进行h&e(对细胞核和细胞质进行染色)和lfb (髓鞘)病理染色分析，发现相较于正常饮食的小鼠，其脊髓浸润的淋巴细胞明显增加，脱髓鞘的症状也明显加重(图2c)。通过对脊髓和大脑的组织进行分离，检测大脑和脊髓的细胞因子表达，检测发现当用缺乏维生素b5的食物进行饲喂时，大脑和脊髓th17细胞的比例和数目都有明显的增加，和缺乏维生素b5的具有加重
小鼠多发性硬化症的表型相一致。(图 2d，图2e，*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001,****p《0.0001)。以上实验结果表明，提前两周给予小鼠额外维生素b5的处理可以显著缓解小鼠eae 的临床症状并保护髓鞘，抑制th17细胞介导的自身免疫反应。
67.结果讨论：
68.实施例2中我们证明了当我们提前两周进行维生素b5饲喂时，其在 th17细胞所参与的小鼠eae模型中发挥重要保护作用。为了更好的模拟真实人类疾病发病情况，我们接下来在小鼠eae发病之后再给予额外维生素b5处理，探究其是否也具有很好的保护作用。
69.实施例3口服维生素b5可以有效治疗多发性硬化症
70.1.实验流程：
71.实验小鼠为野生型小鼠(江苏集萃药康生物技术股份有限公司购买)，分为两组，均先对小鼠疾病进行诱导(诱导方式参见实施例2中实验模型部分)，饲喂相同的正常食物。在小鼠发病初期，第7天时，给予其中一组小鼠额外添加维生素b5的饮用水饲喂。接下来，对小鼠的发病进行打分监测。打分标准同实施例2中表2。当小鼠发病达到峰值后，对小鼠进行安乐死，通过流式细胞术分析其大脑、脊髓，引流淋巴结等炎症部位的淋巴细胞浸润和细胞因子分泌情况。同时，进行病理切片染色等，进行相对应临床指标评分。其中，实验模型的构建、样品采集和处理、流式细胞术分析检测细胞数量和病理切片染色等部分的内容与实施例2中相关部分的内容相同。
72.2.实验结果：
73.如图3a中，两种不同的饮食饲喂条件，对照组为正常饮食；实验组为在eae病理打分(》0)时，给予小鼠额外维生素b5饮用水的处理 (50mg/kg/day)，通过每天对小鼠发病情况进行打分监测，发现当小鼠发病后，在饮用水中额外添加维生素b5进行饲喂时，相较于正常饮食的小鼠，其eae发病情况具有明显减轻(图3a)。通过牺牲小鼠取小鼠脊髓，进行h&e(对细胞核和细胞质进行染色)和lfb(髓鞘)病理染色分析，发现相较于正常饮食的小鼠，其脊髓浸润的淋巴细胞明显减少，脱髓鞘的症状也明显减轻(图3b)。通过对脊髓和大脑的组织进行分离(用研磨棒将取出的小鼠组织研磨成单细胞悬液，配置42％的percoll液，进行密度梯度离心，所得细胞沉淀即为脊髓和大脑的淋巴细胞，接下来，流式细胞术检测大脑和脊髓细胞因子il-17a表达，发现饮用水中额外添加维生素 b5进行饲喂时，大脑和脊髓th17细胞的比例和数目都有明显的降低，和额外维生素b5具有很好的缓解小鼠多发性硬化症的表型相一致(图3c， d,*p《0.05,**p《0.01)。实验结果表明，在小鼠eae发病后给予维生素b5 的干预可以缓解eae小鼠的临床症状并保护髓鞘，具有很好的临床治疗意义。
74.结果讨论：
75.通过实施例1至3，我们发现了维生素b5在th17所参与的自身免疫疾病中发挥重要的作用，机制是通过抑制炎症情况下th17细胞的分化。那么，维生素b5在体外是否也具有抑制th17细胞分化的作用，我们接下来进行探究。
76.实施例4体外实验研究维生素b5对小鼠th17细胞的体外分化抑制
77.1.细胞体外培养
78.取小鼠(正常c57bl/6品系(il-17a
–
ires
–
egfp reporter mice(荧光报告小鼠)由博德研究所的vijay kuchroo研究组提供))脾脏、淋巴结于无菌钢网中充分研磨制备单细胞悬液；单细胞悬液加入15ml离心管中，500g， 5min离心；弃上清，每只脾脏加入2ml红细胞
裂解液，室温裂红5min，每只脾脏加入8ml 1x pbs终止反应，500g，5min离心；1ml macs缓冲液(1xpbs含有0.5％fbs和2mm edta)重悬沉淀，通过200目滤网过滤后进行细胞计数；mojosorttm小鼠cd4 t cell isolation kit(bd)进行cd4+t 细胞富集(macs)；将富集后的细胞离心，计数及抗体标记；bd aria iii 上机分选cd4+cd25-cd45rbhit细胞；分选纯度检测(》95％即表示分选效果较好)；分选后的细胞于15ml离心管中500g离心5min，弃上清，用预冷的1x pbs重悬计数；接种于96孔板中，用th17细胞培养基培养，维生素b5处理组需要在培养基中加入2mm维生素b5，辅酶a(coa) 处理组需要在培养基中加入0.3mm coa细胞在37℃二氧化碳培养箱中培养4天，诱导th17细胞分化。即为th17细胞体外诱导模型。
79.其中，th17细胞培养基是在t细胞培养基(gibco 1640培养基+10％ fbs)中加入a-cd3(biolegend 100253)，a-cd28(biolegend 102121)，il-6， il-23，tgf-b、抗-小鼠il-4和抗-小鼠ifn-y得到的培养基th17诱导培养基。其中a-cd3的含量为2ug/ml、a-cd28的含量为1ug/ml、il-6的含量为25ng/ml、il-23的含量为20ng/ml、tgf-b的含量为2ng/ml，抗
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小鼠il-4的含量为5ug/ml和抗-小鼠ifn-y的含量为5ug/ml。
80.2.荧光定量pcr测定：
81.1)细胞rna提取：96孔细胞样品转移至1.5ml ep管中，离心后，加500ul trizol(tiangen dp424)吹打混匀。对于悬浮的细胞，离心后弃掉上清，加trizol混匀后，转移至1.5ml ep管中(可以不是rnase free)。按照1ml trizol加入0.2ml三氯甲烷(1/5trizol量的三氯甲烷)，然后剧烈震荡15s，室温放置5min。4℃12000g离心15min，将200ul左右上清转移到新的rnase free的ep管内，加入等量的异丙醇沉淀；充分混匀溶液，4℃放置10min沉淀rna(如果rna量多，不需放置10min)；4℃12000g 离心15-30min，弃掉上清，加入1ml的75％乙醇(depc水配制)洗涤 rna沉淀，4℃7500g离心3min；干燥rna。小心弃掉离心后的上清，再短时间离心5s，将管壁上的液体收集到管底，用rnase free枪头吸除，打开离心管管盖干燥rna 15min(小心rnase污染)，等rna沉淀变透明后，加入适量的depc水，充分溶解，混匀后离心，-80℃长期保存。
82.2)反转录(rna-逆转录)：使用反转录试剂盒(诺唯赞，r323)
83.反转录：去除基因组gdna
84.按照如下成分配制反应混合液(4ul体系)
85.gdna eraser mix1ulrna500ngrnase free h2o补至4ul
86.42℃2min/37℃5min
87.4℃∞
88.反转录(5ul体系)
[0089][0090]
反转录的程序：
[0091]
37℃15min
[0092]
85℃5s
[0093]
4℃5min
[0094]
用ddh2o 10倍稀释cdna产物，短期4℃储存，长期-20℃储存。
[0095]
3)rt-pcr(实时pcr)：
[0096]
使用试剂盒sybr green(诺唯赞，q311)；cfx384(bio-rad，c1000 touch)
[0097]
qpcr引物；384qpcr板；封板膜
[0098]
配体系(5ul体系)：
[0099]
sybr master mix2.5ul正向引物0.125ul反向引物0.125ul稀释后的cdna2.25ul
[0100]
每孔5ul，点入384板中，整个过程需要避免强光直射，点样时间过长会导致挥发。
[0101]
用膜封板，离心，上机。实时pcr(反应在冰上进行)，小鼠qpcr引物如表3所示。
[0102]
表3小鼠qpcr引物
[0103]
引物名称引物序列(5
’‑3’
)ii17a-ftttaactcccttggcgcaaaaii17a-rctttccctccgcattgacacrorc-fagtgtaatgtggcctactcctrorc-rgctgctgttgcagttgtttctil17f-ftgctactgttgatgttgggacil17f-raatgccctggttttggttgaail23r-facactgggaagcctacctacail23r-ragcttggacccataccaaatactrora-ftgtggagacaaatcgtcaggarora-raggagtaggtggcattgctccsf2-fggccttggaagcatgtagaggcsf2-rggagaactcgttagagacgactt
[0104]
3.流式细胞术检测细胞数量：
[0105]
由il-17a
–
ires
–
egfp reporter mice体外分化的th17细胞，直接用 cd4 dapi染色即可，fitc通道gfp即为il-17a的表达。具体流式抗体详见如下表4。
[0106]
表4 facs抗体
[0107]
抗体克隆来源识别码抗小鼠cd4 apcgk1.5biolegendcat#100412
[0108]
4.实验结果：
[0109]
培养4天后，取一半细胞用流式检测th17表达的il-17a(图4a，c， ****p《0.0001)。收集另一半细胞，用trizol抽提细胞中rna，检测细胞中th17相关细胞因子和转录因子(il17a，csf2，rorc，rora)的表达(图 4b，d，*p《0.05**p《0.01***p《0.001)。维生素b5处理后，可以显著抑制 th17细胞的体外分化，抑制其il-17a的表达，转录水平，如转录因子il17a， csf2，rorc，rora也明显下调。维生素b5下游代谢产物coa处理后，也显著抑制th17
细胞的体外分化，抑制其il-17a的表达，其转录水平，如转录因子il17a，csf2，rorc，ii23r也明显下调。
[0110]
结果讨论：
[0111]
该体外实验表明维生素b5可以显著抑制小鼠th17细胞的体外分化，并且该过程是依赖维生素b5下游辅酶a(coa)。接下来，我们想进一步验证其在人cd4 t细胞中具体发挥怎样的功能，更好的探究其在人相关自身免疫疾病中cd4 t细胞的功能。
[0112]
实施例5体外实验研究维生素b5对人th17细胞的体外分化抑制
[0113]
1.细胞体外培养
[0114]
实验对象为人外周血单个核细胞(上海赛笠生物科技有限公司，是商购公司)，将人外周血单个核细胞悬液，使用人cd4
+
t细胞macs试剂盒，分选cd4
+
t细胞。加入a-cd3，a-cd28，a-il-4，a-ifnγ以及il-6， il-1β和tgfb1等细胞因子体外诱导人th17细胞分化。在t细胞培养基中加入维生素b5(2mm)和代谢产物coa(0.3mm)，细胞培养4天后，取细胞用流式检测th17表达的il-17a的量。
[0115]
2.流式细胞术检测细胞数量：
[0116]
将上述中分离得到的细胞离心后，用完全培养基加入佛波醇酯 (phorbolester,pma)、离子霉素(ionomycin,ion)，在37℃二氧化碳培养箱中培养4小时，然后收集细胞pbs洗涤两次流式膜标记抗体cd4 dye染色20分钟后固定20分钟pbs洗涤两次，透膜液中加入流式胞内标记抗体 il-17，4℃染色30min，1xperm缓冲液洗涤两次后150ul pbs重悬，流式细胞仪(贝克曼cytoflex)检测th17细胞百分比和数量。具体流式抗体详见如下表5。
[0117]
表5 facs抗体
[0118][0119][0120]
3.实验结果：
[0121]
维生素b5处理后，可以显著抑制人th17细胞的体外分化，抑制其 il-17a的表达(图5a**p《0.01)。维生素b5下游代谢产物coa处理后，也显著抑制人th17细胞的体外分化，抑制其il-17a的表达(图5b ***p《0.001)。
[0122]
我们实验研究发现通过其下游已知的代谢产物辅酶a(coa)，结合 pkm2激酶，抑制pkm2的磷酸化，同时促进pkm2四聚体的形成，抑制 pkm2入核作为下游转录因子的co-activator(共激活子)，从而抑制了th17 细胞的葡萄糖代谢，抑制了th17细胞参与的自身免疫疾病。该体外实验表明维生素b5可以显著抑制人th17细胞的体外分化，并且该过程是依赖维生素b5下游辅酶a(coa)。
[0123]
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。