一种用于诱导神经细胞的导电反蛋白石薄膜及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物材料领域，涉及一种薄膜材料，尤其涉及一种用于诱导神经细胞的导电反蛋白石薄膜及其制备方法和应用。


背景技术：

2.神经系统在人类生活中扮演着潜在的中心角色，它可以根据环境的变化适当地调节机体的生理功能，从而实现机体与环境的统一。神经元损伤和退化可导致永久性组织损伤和严重的功能损伤，这是人类无法避免的。然而，神经组织固有的自我再生能力有限，因此受损神经组织的修复与再生受到了人们的广泛关注。已经有许多研究致力于解决这些问题，其中神经定向诱导被认为是一种有效的方法。在这方面，具有表面形貌的基底材料在神经定向方面具有巨大的潜力。尽管通过使用具有表面形貌的生物材料取得了许多进展，但由于这些生物材料的柔软性，在实现神经元诱导方面仍然存在挑战。相比之下，图案化的硬质底物虽然表现出定向诱导潜力，但是由于基底与体内生物体之间的不一致通常会阻碍神经细胞的存活和增殖。此外，单方向诱导方案大多不利于神经网络的快速形成。因此，仍然可以期待具有可设计神经诱导的新方法来构建复杂的神经系统。


技术实现要素：

3.本发明提供一种用于诱导神经细胞的导电反蛋白石薄膜及其制备方法和应用，以克服现有技术的缺陷。
4.为实现上述目的，本发明提供一种用于诱导神经细胞的导电反蛋白石薄膜的制备方法，具有这样的特征：包括以下步骤：
5.步骤一、制备反蛋白石基底：利用垂直沉积法得到高度有序的自组装纳米颗粒胶体晶体阵列模板，用水凝胶前体溶液填充纳米颗粒胶体晶体阵列模板空隙，固化后去除纳米颗粒胶体晶体阵列模板，得到反蛋白石基底；
6.步骤二、制备具有各向异性椭圆多孔图案的反蛋白石薄膜：将得到的反蛋白石基底沿着与其单排孔洞直线方向的不同角度拉伸，得到具有各向异性椭圆多孔图案的反蛋白石薄膜；
7.步骤三、制备具有各向异性椭圆多孔图案的导电反蛋白石薄膜：配制导电水凝胶前聚体溶液，并用其填充具有各向异性椭圆多孔图案的反蛋白石薄膜，然后用紫外光固化，得到具有各向异性椭圆多孔图案的导电反蛋白石薄膜。
8.进一步，本发明提供一种用于诱导神经细胞的导电反蛋白石薄膜的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤一中，所述垂直沉积法的具体步骤为：将洗净的玻片垂直插入单分散纳米颗粒的乙醇溶液中；单分散纳米颗粒的乙醇溶液的浓度为1-2wt％；在恒温恒湿的环境下，待溶剂挥发后即可得到高度有序的自组装纳米颗粒胶体晶体阵列模板；恒温恒湿条件为温度30-40℃，湿度50-60％。
9.进一步，本发明提供一种用于诱导神经细胞的导电反蛋白石薄膜的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤一中，所述纳米颗粒胶体晶体阵列模板中的纳米颗粒是二氧化硅。
10.进一步，本发明提供一种用于诱导神经细胞的导电反蛋白石薄膜的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤一中，所述水凝胶前体溶液选自聚苯乙烯(ps)/甲苯溶液或聚偏氟乙烯(pvdf)/二甲基甲酰胺(dmf)溶液中的一种。水凝胶前体溶液的浓度为10-20wt％。
11.进一步，本发明提供一种用于诱导神经细胞的导电反蛋白石薄膜的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤二中，拉伸倍数为3-6倍。
12.进一步，本发明提供一种用于诱导神经细胞的导电反蛋白石薄膜的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤二中，拉伸角度为与其单排孔洞直线方向的夹角成15
°
、30
°
、45
°
或60
°
。
13.进一步，本发明提供一种用于诱导神经细胞的导电反蛋白石薄膜的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤二中，拉伸反蛋白石基底的条件为70-80℃水浴加热。
14.进一步，本发明提供一种用于诱导神经细胞的导电反蛋白石薄膜的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤三中，所述导电水凝胶前聚体溶液包括聚3,4-乙撑二氧噻吩：聚苯乙烯磺酸盐(pedot:pss)溶液、聚丙烯酰胺(paam)前聚体溶液和2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮(hmpp)；聚3,4-乙撑二氧噻吩：聚苯乙烯磺酸盐溶液的固含量为1.2％；聚丙烯酰胺前聚体溶液包括丙烯酰胺(aam)、n-n’亚甲基双丙烯酰胺(mba)和去离子水，丙烯酰胺的浓度为0.2g ml-1，n-n’亚甲基双丙烯酰胺相对于丙烯酰胺的质量分数为3.45wt％；聚3,4-乙撑二氧噻吩：聚苯乙烯磺酸盐溶液与聚丙烯酰胺前聚体溶液的体积比为3:2；2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮的用量为聚3,4-乙撑二氧噻吩：聚苯乙烯磺酸盐溶液和聚丙烯酰胺前聚体溶液总量的1v/v％。
15.本发明还保护制备方法制得的具有各向异性椭圆多孔图案的导电反蛋白石薄膜。
16.所述具有各向异性椭圆多孔图案的导电反蛋白石薄膜用于诱导神经细胞。具体的，用于诱导神经细胞方面定向生长、促进神经细胞生长分化。
17.本发明的有益效果在于：本发明提供一种具有各向异性椭圆多孔图案的导电反蛋白石薄膜及其制备方法和在诱导神经细胞方面定向生长、促进神经细胞生长分化的应用，包括各向异性反蛋白石基底以及其上覆盖的导电水凝胶。该导电反蛋白石薄膜兼具各向异性、优异的导电性能和生物相容性，可很好地促进神经细胞增殖分化及沿不同方向定向生长，从而有助于形成神经网络，促进神经损伤修复及再生。具体具有以下优点：
18.一、本发明基于反蛋白石基底制备，方法简便，成本较低，操作简易，可大批量制备，技术要求不高。
19.二、本发明设计了一种具有各向异性椭圆多孔图案的导电反蛋白石薄膜，其表面形貌可以简单地通过拉伸角度的改变而改变，从而促进神经细胞的定向生长。而灌注的导电水凝胶则赋予其优异的导电性能，从而对神经细胞的生长和分化起到了积极的作用。
20.三、本发明制备的薄膜可以诱导神经细胞定向排列，从而形成神经网络，有助于神经损伤的修复及再生，在生物医学应用中，特别是在组织工程中具有广阔的应用前景。
附图说明
21.图1是具有各向异性椭圆多孔图案的反蛋白石薄膜的制备流程图；
22.图2是灌注导电水凝胶前后的具有各向异性椭圆多孔图案的反蛋白石薄膜上细胞培养情况的示意图；
23.图3是pc12细胞在不同角度拉伸后的各向异性反蛋白石薄膜上培养后的免疫荧光图和扫描电子显微镜(sem)图像；其中，a-e分别为pc12细胞在普通载玻片、0
°
、15
°
、30
°
和45
°
拉伸的反蛋白石薄膜上培养的免疫荧光图片，f-j为相对应的sem图像；所有薄膜均为6倍拉伸，标尺为50μm；
24.图4是pc12细胞在灌注导电水凝胶前后反蛋白石薄膜上培养后的免疫荧光图和sem图像；其中，a-b分别为pc12细胞在以30
°
拉伸的反蛋白石薄膜和灌注了导电水凝胶的30
°
拉伸的反蛋白石薄膜上培养的免疫荧光图片，c-d为相对应的sem图像；所有薄膜均为6倍拉伸，标尺为50μm。
具体实施方式
25.下面结合附图对本发明的较佳实例进行更进一步的详细说明，以使本发明的优点和特征能够更易于被本领域技术人员理解。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。实施例中未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
26.本实施例提供一种用于诱导神经细胞的具有各向异性椭圆多孔图案的导电反蛋白石薄膜，其制备流程如图1所示，制备方法包括以下步骤：
27.步骤一、制备反蛋白石基底：
28.将洗净的玻片垂直插入装有1.5wt％的单分散二氧化硅纳米颗粒的乙醇溶液的沉积瓶中。在温度为45℃、湿度为50％的恒温室中，待溶剂挥发后即得到高度有序的自组装二氧化硅纳米颗粒胶体晶体阵列模板。
29.选用10wt％的ps/甲苯溶液填充胶体纳米颗粒胶体晶体阵列模板空隙，常温下待溶剂挥发固化后即得到光子晶体—水凝胶杂交体系。用4wt％的氢氟酸腐蚀光子晶体—水凝胶杂交体系中的二氧化硅粒子，得到ps反蛋白石基底。
30.本实施例中，水凝胶前体溶液也可以为pvdf/dmf溶液。
31.步骤二、制备具有各向异性椭圆多孔图案的反蛋白石薄膜：
32.在70℃水浴中使用游标卡尺将ps反蛋白石基底缓慢拉伸至原始长度的6倍，拉伸方向分别为与单排孔洞直线方向的夹角成0
°
、15
°
、30
°
和45
°
，从而得到四种不同表面形貌的各向异性椭圆多孔图案的反蛋白石薄膜。
33.步骤三、制备具有各向异性椭圆多孔图案的导电反蛋白石薄膜：
34.配制paam前聚体溶液，paam前聚体溶液包括aam、mba和去离子水，aam的浓度为0.2g ml-1
，mba相对于aam的质量分数为3.45wt％。而后按3:2的体积比混合pedot:pss溶液(固含量为1.2％)和paam前聚体溶液，并加入1v/v％的hmpp，得到导电水凝胶前聚体溶液。
35.将导电水凝胶前聚体溶液灌注到具有各向异性椭圆多孔图案的反蛋白石薄膜上，并用紫外光照射120s固化，得到具有各向异性椭圆多孔图案的导电反蛋白石薄膜。
36.本实施例提供的具有各向异性椭圆多孔图案的导电反蛋白石薄膜应用于诱导神
经细胞。
37.一、具有各向异性椭圆多孔图案的反蛋白石薄膜用于神经细胞培养：
38.材料准备：设置对照组和实验组：对照组为玻片，实验组分别为拉伸倍数为6倍，拉伸角度分别为0
°
、15
°
、30
°
和45
°
的反蛋白石薄膜(步骤二得到的反蛋白石薄膜)。每组材料均为同样的3个。将上述材料放入24孔板的15个孔中，紫外灯照射，过夜灭菌。
39.细胞接种：实验中所用细胞为源自鼠肾上腺嗜铬细胞瘤的pc12细胞，将已经消化好的细胞接种于24孔板的15个孔中，每孔细胞数量为5
×
104个/ml，在含有1％青霉素-链霉素和10％胎牛血清的rpmi1640培养基中培养24h。
40.细胞诱导培养：接种后培养24h后，更换培养基为由1％马血清、1％青霉素-链霉素和神经生长因子(ngf)(50μg ml-1
)组成的rpmi1640培养基，培养7d。
41.免疫荧光染色：弃掉培养基，使用4％多聚甲醛将这些底物与细胞在室温下固定30分钟。然后，使用磷酸盐缓冲液(pbs)和0.1％triton-x100的溶液在室温下透化细胞膜和固定蛋白质1小时。接下来，固定的样品在4℃下用小鼠抗βiii-微管蛋白一抗(1:800稀释)染色过夜。然后，用pbs和0.1％triton-x100的溶液洗涤3次，并用二抗(1:400稀释)和dapi(1:800稀释)的混合物在室温下复染1小时以标记目标蛋白质。最终，在盖玻片覆盖之前，使用dako荧光封固剂保护样品免于淬灭。使用激光扫描显微镜拍摄共聚焦显微镜照片。如图3a-e所示，与在显示无序微丝的普通载玻片上生长的细胞相比(图3a)，pc12细胞在拉伸薄膜上以特定方向排列。具体来说，当薄膜以0
°
拉伸时，细胞倾向于沿拉伸方向生长(图3b)，而神经元的延伸在15
°
、30
°
和45
°
拉伸的薄膜上有两个生长方向。除了一个沿拉伸方向外，另一个方向几乎与脊的方向一致，因而在15
°
、30
°
和45
°
拉伸的薄膜上形成了相互交叉的神经网络。
42.扫描电子显微镜(sem)拍摄前处理：首先将带有细胞的底物在pbs中洗涤3次，并在4℃下固定在2.5wt％戊二醛溶液中过夜。然后用去离子水洗涤3次以洗去残留的戊二醛溶液。接下来，将它们分别通过浓度梯度为30％、50％、70％和90％的乙醇脱水10分钟。最后，在拍摄sem图像之前，将它们用100％酒精脱水3次，以确保样品可以完全脱水。使用扫描电子显微镜拍摄图像。与免疫荧光照片结果相似，sem图像(图3f-j)更清楚地显示了拉伸薄膜的表面形貌与神经元生长方向之间的关系。这些特征表明，具有各向异性椭圆多孔图案的拉伸反蛋白石薄膜可以有效地诱导pc12细胞向特定方向生长。
43.二、具有各向异性椭圆多孔图案的导电反蛋白石薄膜用于神经细胞培养：
44.材料准备：设置对照组和实验组：对照组为玻片，实验组分别为拉伸倍数为6倍，拉伸角度为30
°
的反蛋白石薄膜(步骤二得到的反蛋白石薄膜)以及导电反蛋白石薄膜(步骤三得到的导电反蛋白石薄膜)。每组材料均为同样的3个。将上述材料放入24孔板的9个孔中，紫外灯照射，过夜灭菌。
45.细胞培养：步骤同上，观察灌注导电水凝胶前后反蛋白石薄膜上pc12细胞的培养情况，结果如图4所示。根据免疫荧光图像显示(图4a-b)，与裸露的拉伸反蛋白石薄膜相比，灌注了导电水凝胶的拉伸反蛋白石薄膜上的pc12细胞表现出更好的分布，并且具有更长的神经突，这表明了细胞和膜之间的连接紧密。sem图像则揭示了基底类型与pc12细胞生长之间的关系(图4c-d)。可以看出，通过导电水凝胶的引入，垂直神经网络相对更完整，且在复合薄膜上具有更充分的互锁性，这有利于神经信号的连接和传导。
46.上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。