一种过表达LRRC15基因的质粒载体及其制备方法和应用

一种过表达lrrc15基因的质粒载体及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物技术和基因工程领域，具体而言，涉及一种过表达lrrc15基因的质粒载体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.细胞凋亡(apoptosis)指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。
3.纤维化(fibrosis)是一个医学概念，纤维化可发生于多种器官，主要病理改变为器官组织内纤维结缔组织增多，实质细胞减少，持续进展可致器官结构破坏和功能减退，乃至衰竭，严重威胁人类健康和生命。
4.如何对细胞凋亡或纤维化进行调控或丰富调控手段对于多种疾病的治疗和新药开发具有重要意义。
5.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种过表达lrrc15基因的质粒载体及其制备方法和应用。
7.本发明是这样实现的：
8.第一方面，本发明实施例提供了过表达lrrc15基因的质粒载体在制备调控纤维化和/或纤维化相关基因的表达的药物中的应用。
9.第二方面，本发明实施例提供了过表达lrrc15基因的质粒载体在制备调控细胞凋亡和/或细胞凋亡相关基因的表达的药物中的应用。
10.第三方面，本发明实施例提供了一种过表达lrrc15基因的质粒载体，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
11.第四方面，本发明实施例提供了一种宿主细胞，其含有如前述实施例所述的过表达lrrc15基因的质粒载体。
12.第五方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的宿主细胞的制备方法，其包括：将如前述实施例所述的宿主细胞导入宿主细胞中。
13.第六方面，本发明实施例提供了一种过表达lrrc15基因的质粒载体的制备方法，其包括：培养如前述实施例所述的宿主细胞。
14.第七方面，本发明实施例提供了一种药物，其包括有如前述实施例所述的过表达lrrc15基因的质粒载体或如前述实施例所述的宿主细胞。
15.本发明具有以下有益效果：
16.本发明提供了一种过表达lrrc15基因的质粒载体，通过在宿主细胞中转染该质粒载体，能够稳定有效地实现lrrc15基因的过表达，进一步影响细胞凋亡以及纤维化，能够应
用于制备调空细胞凋亡和纤维化的药物中，为相关基应的预防和治疗提供了途径。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
18.图1为本发明实验例提供的过表达lrrc15基因的质粒载体的酶切结果图；
19.图2为本发明实验例提供的质粒载体过表达lrrc15基因后，蛋白水平表达变化；
20.图3为本发明实验例提供质粒载体过表达lrrc15基因后，基因水平表达变化；
21.图4为本发明实验例提供质粒载体过表达lrrc15基因后对凋亡及其相关蛋白和基因水平的影响；
22.图5为本发明实验例提供质粒载体过表达lrrc15基因后对纤维化过程中emt相关指标基因水平的影响。
具体实施方式
23.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
24.lrrc15基因全长为14495bp，含3个外显子，其外显子分别位于该基因的1-83,6332-6388,8698-14495bp处，其mrna全长为5938bp，共编码587个氨基酸。lrrc15(leucine rich repeat containing 15)，富含15个亮氨酸的重复序列，是lrrc超家族的成员之一。lrrc15蛋白是由六个结构域组成，主要包括：信号肽、特征性的富含亮氨酸重复序列(lrr)n端结构域、15个lrr、c端结构域、一个跨膜结构域和一个短细胞质结构域。
25.本发明实施例提供了过表达lrrc15基因的质粒载体在制备调控纤维化和/或纤维化相关基因的表达的药物中的应用。
26.在没有限定的情况下，只要将能够过表达lrrc15基因的质粒载体应用于制备调控纤维化和/或纤维化相关基因的表达的药物均属于本技术的保护范围中。
27.优选地，所述过表达lrrc15基因的质粒载体的核苷酸序列如seq id no.1所示，该质粒载体包括pegfp-n1(xhoi/bamhi)荧光标签和酶切位点，相对于采用现有其他的过表达基因载体而言，seq id no.1所示的质粒载体能够更加稳定有效地实现目的基因的过表达。
28.优选地，所述相关基因选自e-cadherin和vimentin中的任意一种。
29.优选地，调控纤维化相关基因的表达是指：降低e-cadherin的表达水平和促进vimentin基因的表达水平中的至少一种。
30.优选地，所述纤维化选自肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、脾纤维化、眼肌纤维化和骨髓纤维化中的至少一种，优选为肺纤维化。
31.本文中“基因的表达”可以指mrna水平和/或蛋白的水平。
32.本发明实施例提供了过表达lrrc15基因的质粒载体在制备调控细胞凋亡和/或细
胞凋亡相关基因的表达的药物中的应用。
33.在没有限定的情况下，只要将能够过表达lrrc15基因的质粒载体应用于制备调控细胞凋亡和/或细胞凋亡相关基因的表达的药物均属于本技术的保护范围中。优选地，所述过表达lrrc15基因的质粒载体的核苷酸序列如seq id no.1所示。
34.优选地，所述细胞凋亡相关基因选自bax、bcl2和caspase3中的至少一种。
35.优选地，调控细胞凋亡相关基因地表达是指：增强caspase3基因的表达、增强bax基因的表达水平和降低bcl2基因的表达水平中的任意一种。
36.caspase3基因(casp 3)最初在人类jurkat-t淋巴细胞中被克隆出的，该基因编码一个32kda的半胱氨酸蛋白酶cpp32，cpp32及其p20和p11重组体可以诱导sf9昆虫细胞发生凋亡。caspase3又被称为细胞凋亡的执行者,以其具有剪切管家蛋白和dna片段的功能，被认为是参与凋亡途径的关键效应分子。
37.bax基因是人体最主要的凋亡基因，属于bcl-2基因家族，编码的bax蛋白可与bcl-2形成异二聚体，对bcl-2产生阻抑作用。研究发现bax/bcl-2两蛋白之间的比例关系是决定对细胞凋亡(apoptosis)抑制作用强弱的关键因素，因此认为，bax是极重要的促细胞凋亡(apoptosis)基因之一。
38.在细胞凋亡过程中，bcl-2家族成员起着至关重要的作用。它们具有较高的同源性；它们主要定位在核膜的胞质面、内质网及线粒体外膜上，与膜的结合对于其发挥功能是极其重要的。实验表明，失去膜定位能力的bcl-2蛋白抗凋亡能力减弱了许多。在细胞凋亡中，线粒体的巯基可能组成了胞内氧化还原电位的传感器，bcl-2可能是通过抑制谷胱甘肽(gsh)的外泄，降低胞内的氧化还原电位，来抑制细胞凋亡。
39.优选地，所述调控细胞凋亡是指促进细胞凋亡。
40.可以理解的是，所述细胞可以来源于哺乳动物的细胞或现有公开的哺乳动物的细胞系。优选地，所述细胞包括a549细胞及mrc-5细胞中的任意一种。
41.本发明实施例提供了一种过表达lrrc15基因的质粒载体，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
42.将上述过表达lrrc15基因的质粒载体应用到过表达lrrc15基因中，能起到过表达lrrc15基因的作用，进而应用于研究lrrc15基因功能的作用和目的。
43.本发明实施例提供了一种宿主细胞，其含有如前述实施例所述的过表达lrrc15基因的质粒载体。
44.本发明实施例提供了如前述实施例所述的宿主细胞的制备方法，其包括：将如前述实施例所述的宿主细胞导入宿主细胞中。
45.优选地，所述导入的步骤包括：将质粒载体溶液与转染试剂溶液混合，将混合后的产物导入宿主细胞中。
46.优选地，所述质粒载体溶液的浓度为10-100μg/μl，具体可以为10μg/μl、20μg/μl、40μg/μl、60μg/μl、80μg/μl、100μg/μl中的任意一种或任意两种之间的范围，优选为100μg/μl。在一些实施例中，所述质粒载体溶液由稀释剂和质粒载体混合获得，稀释液可以采用0.01m的pbs进行。
47.优选地，所述转染试剂溶液的浓度为20-500μg/ml，具体可以为20μg/μl、100μg/μl、200μg/μl、300μg/μl、400μg/μl和500μg/μl中的任意一种或任意两种之间的范围，优选为
500μg/μl。
48.优选地，质粒载体溶液与转染试剂溶液的混合体积比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)，更优选为1：1。
49.优选地，所述制备方法还包括将导入有所述质粒载体的宿主细胞于室温静置5～15min，通过5-15min的静置，有利于质粒载体和靶基因结合，静置时间具体可以为5min、7min、9min、11min、13min和15min中的任意一种或任意两种之间的范围。
50.本发明实施例提供了一种过表达lrrc15基因的质粒载体的制备方法，其包括：培养如前述实施例所述的宿主细胞。
51.宿主细胞的培养步骤可以基于现有公开的宿主细胞的培养步骤进行，培养的条件为适于宿主细胞表达lrrc15基因的条件。
52.可选地，培养的步骤可以如下：
53.在6孔细胞培养板的培养孔中按照2ml/孔添加量加入的完全培养基，培养a549细胞，每个培养孔中细胞的浓度为6
×
105个/ml；控制细胞的接种量，能提高培养的效率并且保证细胞的活力，保证转染试剂的转化比例和转化效率。
54.在37℃，5％co2，饱和湿度的条件下进行细胞培养，至培养的细胞覆盖70％-80％的板面积；
55.吸弃培养孔中的培养基，用0.01m的pbs清洗细胞1-2次；
56.清洗后加入转染试剂与质粒载体复合物溶液在37℃，5％co2饱和湿度条件下，进行48h的细胞转染和培养。
57.本发明实施例提供了一种药物，其包括有如前述实施例所述的过表达lrrc15基因的质粒载体或如前述实施例所述的宿主细胞。
58.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
59.实施例1
60.本实施例提供了一种过表达lrrc15基因的质粒载体，所述过表达lrrc15基因的质粒载体包括pegfp-n1(xhoi/bamhi)荧光标签和酶切位点；质粒载体的碱基序列如seq id no.1所示，序列具体如下(5
’‑3’
)：
61.ctcgaggccaccatggccatgcagaaaatctttgcccgggaaatcttggactccaggggcaaccccacggtggaggtggacctgcacacggccaagggccgattccgagcagctgtgcccagtggggcttccacgggtatctatgaggctctggaactaagagacggagacaaaggccgctacctggggaaagccaagtttggggccaatgccatcctgggcgtgtccttggccgtgtgtaaggcgggagcagctgagaagggggtccccctgtaccgccacatcgcagatctcgctgggaaccctgacctcatactcccagtgccagccttcaatgtgatcaacgggggctcccatgctggaaacaagctggccatgcaggagttcatgattctgcctgtgggagccagctccttcaaggaagccatgcgcattggcgccgaggtctaccaccacctcaagggggtcatcaaggccaagtatgggaaggatgccaccaatgtgggtgatgaaggtggcttcgcacccaacatcctggagaacaatgaggccctggagctgctgaagacggccatccaggcggctggttacccagacaaggtggtgatcggcatggatgtggcagcatctgagttctatcgcaatgggaagtacgatcttgacttcaagtcgcctgatgatcccgcacggcacatcactggggagaagctcggagagctgtataagagctttatcaagaactatcctgtggtctccatcgaagacccctttgaccaggatgactgggccacttggacctccttcctctcgggggtgaacatccagattgtgggggatgacttgacagtcaccaaccccaagaggattgcccaggccgttgagaagaaggcctgcaactgtctgctgctgaaggtcaaccagatcggctcggtgaccgaatcgatccaggcgtgcaaactggctcagtctaatggctgggg
ggtgatggtgagccaccgctctggggagactgaggacacattcattgctgaccttgtggtggggctctgcacaggacagatcaagactggcgccccctgccgctcggagcgtctggccaaatacaaccaactcatgaggatcgaggaggctcttggggacaaggcaatctttgctggacgcaagttccgtaacccgaaggccaagcgggatcc。
62.实施例2
63.a549细胞的培养，培养基为dmem-f12培养基，于37℃、5％co2、饱和湿度条件下进行细胞培养。
64.细胞转染：将处于对数生长期的a549细胞，用浓度为0.25％胰蛋白酶进行消化处理，并按3
×
103个cell/孔的浓度将细胞接种于96孔培养板的培养孔中，37℃、5％co2继续培养至培养板板底70％-80％，按转染试剂(北京博迈德)说明书上的操作步骤进行细胞转染。分别将50nm的质粒载体和0.2μl转染试剂加入0.01m的pbs，混匀，得到稀释后的质粒载体溶液和转染试剂溶液，室温静置5-15min。然后将前述两种溶液混匀(体积比为1：1)，形成转染试剂-质粒载体转染复合物，室温静置5-15min，加入到完全培养基的细胞中，37℃5％co2、饱和湿度条件下孵育48h。每个实验组设置3个复孔，实验重复3次。同时设置空白对照和阴性对照。
65.转染后48h收集细胞，按照trizol试剂说明书操作提取总rna，其中total rna的28s:18s的条带为2:1，提取rna的od260:280为1.9-2.1的范围。用qrt-pcr检测lrrc15基因的正常表达情况，并通过western blot法检测lrrc15蛋白的表达量。
66.提取总rna的实验方法如下：
67.第一步，弃培养基，加入1ml的trizol试剂室温消化5min；
68.第二步，12000rpm离心5min，取上清；
69.第三步，加入200μl的氯仿，振荡混匀后室温放置15min；
70.第四步，在4℃，12000rpm离心5min，取上清至另外一个rnase free的ep管中；
71.第五步，加入500μl的异丙醇加入到ep管中混匀，室温放置5-10min；
72.第六步，在4℃，12000rpm离心10min，弃上清；
73.第七步，加入1ml的75％的乙醇，振荡离心管，悬浮沉淀；
74.第八步，在4℃，12000rpm离心10min，弃上清，室温晾干；
75.第九步，加入50μl ddh2o溶解，得到总rna。
76.进行荧光定量pcr的反应采用abi prism7500 real-time system(applied biosystem)和transstart qpcr super mix进行检测。选用actin基因作为内参基因，反应体系如表1所示，反应条件如表2所示。
77.表1反应体系
78.组分体积cdna template1μlprimer(10μm)0.4μl each2
×
mix10μldye(50
×
)0.4μlddh2o7.8μl
79.表2反应条件
80.温度反应时间
94℃30s94℃5s60℃34s 40个循环
81.western blot的实验方法如下：
82.按照表3所示的配方配置10％的分离胶。
83.表3 10％的分离胶(10ml)
[0084][0085][0086]
加入temed之后立即将分离胶倒入两块玻璃板之间，并在胶面上覆盖一层ddh2o，保持胶面水平，静置至胶完全凝固。将ddh2o倒掉，用滤纸吸干，制备得到浓缩胶。
[0087]
按照表4所示的配方配置5％的浓缩胶。
[0088]
表4 5％浓缩胶(4ml)
[0089]
ddh2o2.7ml30％acrylamide0.67ml1m tris-hcl(ph6.8)0.5ml10％sds0.04ml10％aps0.04mltemed0.004ml
[0090]
加入temed后立即将浓缩胶倒入两块玻璃板之间，插上样品梳,静置至胶凝固即可。
[0091]
电泳检测：
[0092]
1.1蛋白样品的处理：取适量蛋白样品加入5
×
loading buffer(样品:loading buffer＝4:1)，混匀，95℃变性5min，4℃保存备用；
[0093]
1.2安装好电泳装置，样品上样，80v电泳至溴酚蓝进入分离胶，加大电压至120v，电泳至溴酚蓝刚好跑出分离胶；
[0094]
1.3pvdf膜剪成与胶等大，甲醇浸泡30sec后转移至转膜缓冲液中平衡20min；同时海绵片，滤纸片，page胶也放入转膜缓冲液中平衡；
[0095]
1.4黑色夹板，海绵、滤纸、胶、膜、滤纸、海绵、白色夹板依次排好，确保胶与膜之间没有气泡，夹紧装置，夹板按电极方向放入转移槽中，加入转膜缓冲液；
[0096]
1.5插好电极，稳流350ma转膜1h(转膜过程中装置会发热，将其置于冰盒中冷却)；
[0097]
1.6卸下装置；pvdf膜用转膜缓冲液漂洗一下，加入封闭液室温封闭2h；
[0098]
1.7弃封闭液，加入封闭液10ml+1μl一抗(1:10,000)室温结合1h；
[0099]
1.8用tbst缓冲液洗膜3次，每次15min；
[0100]
1.9加入tbst缓冲液+11μl二抗(1:10,000)室温轻轻摇动1h；
[0101]
1.10用tbst缓冲液洗膜3次，每次15min；
[0102]
1.11加入显色液晃动显色10min；倒掉显色液加入ddh2o终止反应，并观察照相记录。
[0103]
基因表达量的结果请参阅图1，从图1中可以知晓，质粒载体酶切在1781bp处出现条带，说明过表达片段成功导入载体。
[0104]
蛋白质与基因的表达量结果请参阅图2，从图中可以知晓，与对照组比较，转染质粒载体的人肺癌上皮a549细胞的实验组的lrrc15蛋白pegfp标签结合成功，蛋白表达量上升。且蛋白的实验结果与基因表达量的实验结果一致。
[0105]
实施例3
[0106]
本实施例提供了一种过表达lrrc15基因的质粒载体的制备方法，包括以下步骤：
[0107]
s1将实施例1提供的过表达lrrc15基因的质粒载体采用0.01m的pbs进行稀释，制备得到浓度为100μg/μl的质粒载体溶液；
[0108]
s2将转染试剂采用0.01m的pbs进行稀释，制备得到浓度为500μg/μl的转染试剂溶液；
[0109]
s3将质粒载体溶液与转染试剂溶液进行混合，混合的时间为5-15min，制备得到转染试剂与质粒载体复合物溶液；
[0110]
s4在6孔细胞培养板的培养孔中按照2ml/孔添加量加入的完全培养基，培养a549细胞，每个培养孔中细胞的浓度为6
×
105个/ml；
[0111]
s5在37℃，5％co2，饱和湿度的条件下进行细胞培养，至培养的细胞覆盖70％-80％的板面积；
[0112]
s6吸弃培养孔中的培养基，用0.01m的pbs清洗细胞1-2次；
[0113]
s7清洗后加入转染试剂与质粒载体复合物溶液在37℃，5％co2饱和湿度条件下，进行48h的细胞转染和培养；
[0114]
s8收集细胞并进行lrrc15基因表达检测。
[0115]
检测结果见图3。
[0116]
实施例4
[0117]
本实施例验证了转染过表达lrrc15基因的质粒载体后对a549细胞凋亡的影响，包括以下步骤：
[0118]
使用质粒载体转染a549细胞。将a549细胞接种于6孔板中，待细胞长到70％-80％时，将质粒载体转染a549细胞中，转染48h后的细胞取材并使用7-aad凋亡检测试剂盒染色并用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
[0119]
结果请参阅图4，通过质粒载体转染a549中过表达lrrc15基因的正常表达后48h，流式细胞仪检测细胞凋亡发现转染过表达lrrc15基因的质粒载体后，细胞凋亡增多，说明过表达lrrc15基因后对细胞凋亡具有调控作用。
[0120]
实施例5
[0121]
本实施例验证了转染质粒载体后对细胞凋亡相关基因bcl2、和bax基因水平检测。
[0122]
将质粒载体转染a549细胞，在37℃，5％co2条件下培养，48h后细胞总rna抽提按trizol试剂操作说明书进行(invitrogen corporation,carlsbad,california,usa)，分光光度计检测其纯度(a260/280吸光值)。然后，以2μg rna为模板，按照amv反转录试剂盒(promega，usa)操作说明进行反转录，得到第一链cdna。取1μl的单链cdna，按qrt-pcr试剂盒(promega，usa)说明书加入各项试剂，扩增基因，检测基因的扩增产物荧光信号值，并以β-actin(nm_031144)为内参计算基因的相对表达量(ratio值)。每个样品做3个复孔，实验重复3次。检测引物如表5所示。
[0123]
表5 qrt-pcr检测的引物
[0124][0125]
结果见图4。
[0126]
实施例6
[0127]
本实施例验证了转染质粒载体后验证过表达lrrc15后对纤维化相关基因表达的影响。
[0128]
实验方法采用同上所述的实时荧光定量pcr技术检测基因表达量。结果如图5所示，过表达lrrc15后，纤维化相关基因e-cadherin的表达下降，vimentin的表达上升。说明过表达lrrc15后可能参与了纤维化中emt(上皮-间充质转换)过程，来诱导纤维化进程。
[0129]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。