抗衰老活性肽与骨髓间充质干细胞在制备抗衰老的药物或者美容产品中的用途的制作方法

1.本发明涉及生物领域，更具体的涉及预防干细胞衰老提高干细胞活性的领域，可以用于制备抗衰老药物或者美容产品。


背景技术：

2.干细胞具有自我更新、多向分化和旁分泌因子分泌能力，是实现细胞再生的“种子”，机体可通过自体干细胞的增殖和分化实现细胞更新，但随着年龄的增长，各个组织器官的干细胞数量会逐渐减少，增殖分化能力下降，受损的组织器官无法得到及时修复，在皮肤上则会表现为皱纹、色斑、皮肤暗沉等。随着干细胞研究的成熟，干细胞技术在皮肤抗衰领域中的应用潜力巨大。
3.干细胞抗衰老是利用干细胞自身分化或源自干细胞的分泌因子来修复损伤。干细胞能分泌大量的细胞因子，可提升机体抗自由基能力，促进血管生成及细胞增殖分化、抑制炎症反应及趋化性，刺激组织细胞的再生、修复等，因此干细胞分泌产物具有抗衰老和美容护肤作用，目前干细胞皮肤抗衰老机制主要有以下几种形式：细胞分化延缓衰老：干细胞因其固有的分化能力，可分化成多种类型的细胞，皮肤中的干细胞分为表皮干细胞、真皮干细胞等，都可进行增殖和分化，延缓皮肤衰老；另外，其他类型干细胞也可向皮肤细胞分化，如间充质干细胞可以分化为表皮细胞、成纤维细胞、黑素细胞等。旁分泌作用：大量研究证实干细胞还可通过分泌细胞因子，如超氧化物歧化酶(sod)、血管内皮生长因子(vegf)等，促进细胞增殖，促进再生、修复组织损伤。dna损伤修复：dna完整性的维持对于预防衰老起到重要作用，干细胞具有双链dna损伤修复机制。其中端粒损伤是一种特殊形式的dna损伤，通常不能轻易被修复，而干细胞能产生端粒酶，改善端粒缩短功能，延缓衰老进程。促进胶原蛋白的合成：干细胞可参与刺激成纤维细胞胶原蛋白的合成。有研究表明干细胞能改善和增加衰老小鼠皮肤的厚度和密度及胶原纤维，减少皮肤皱纹。抗炎作用：促炎介质如白细胞介素-6、肿瘤坏死因子等会诱发皮肤衰老，一些动物研究表明，静脉注射mscs可以减少促炎反应。
4.骨髓间充质干细胞具有独特的优势，可以分化为多种间质组织细胞，这一多向分化潜能为许多疾病提供了细胞再生修复的新治疗手段。皮肤抗衰老方面，研究发现hplgf-2基因修饰的bmscs能分化为成纤维细胞参与到皮肤创面修复中,并分化为血管内皮细胞参与血管的再生。另有研究表明，mscs在体内外实验中均可参与真皮组织的重建，mscs在真皮成纤维细胞诱导体系作用下,超微结构观察到细胞外胶原微纤维的沉积。mscs能在体内外被诱导分化为表皮及真皮细胞，且诱导分化的真皮成纤维细胞具有分泌i型胶原的功能。另外，骨髓间充质干细胞能够分泌多种生长因子和细胞因子，从多个角度发挥抗衰老作用。骨髓间充质干细胞分泌的生长因子可能是加速皮肤创伤愈合的重要原因，研究表明骨髓间充质干细胞表达转化生长因子，表皮生长因子，血管内皮生长因子，表皮生长因子，成纤维细胞生长因子等，这些因子在调节细胞表型和创面改建中起着重要的作用。
5.但是目前，骨髓间充质干细胞自身在培养过程中生长缓慢，如何获得高质量、高产量的骨髓间充质干细胞是目前研究的重点方向。虽然研究中提高骨髓间充质干细胞的方法很多，比如利用脂质体转染法，将真核重组表达质粒(bfgf-pcdna3)转染至体外培养的bmscs，筛选出稳定表达bfgf的bmscs细胞株，并发现自身表达的bfgf可促进bmscs增殖。利用转基因技术将生长因子neuroglobin植入实验兔的bmscs，结果发现兔的损伤组织重塑和纤维束生长显著增快。目前，利用转基因技术已将人端粒逆转录酶(htert)基因成功转入中国贵州小猪的bmscs内，发现转染后的bmscs与正常培养的bmscs具有相同的增殖活性，同时转染后的bmscs寿命得到延长。但是，这项技术也面临一些难题需要解决，如基因转染效率低、体内表达时间短、是否会导致恶变及转基因后能否保持原来的生物学特性等。目前，转基因技术还处于初步研究阶段，技术条件的不完善决定了其在短时间内难以全面推广应用。


技术实现要素：

6.本发明研究人员发现，caspase-3抑制剂本身可以促进骨髓间充质干细胞的增殖，但是本身效果还有待进一步的提高。
7.本发明克服现有技术的缺陷，提供一种新的筛选caspase-3抑制剂的方法，以及根据所述方法筛选获得的新的caspase-3抑制剂。
8.具体的，所述筛选方法为根据ncbi的人源caspase-3序列，设计引物，以人外周血dna为模板pcr扩增目的片段，随后以限制性内切酶ndei、xhoi切割目的片段及载体，表达并纯化的caspase-3蛋白。构建筛选体系：反应体系中含有caspase-3蛋白、适量反应缓冲液(25mmol/l hepes，0.1％chaps，100mmol/lnacl，10mmol/ldtt，10％蔗糖，1mmol/l edta，ph 7.5)、样品、空白孔为反应缓冲液及ac－devd－amc(20μg/ml)，振荡混匀后以355nm为激发波长测定460nm下的荧光强度值(f1)，每分钟测一次。在线性范围内将最后一次读数设为f2。样品对caspase-3酶抑制率的计算公式为：酶的相对活性＝【(f2－f1)样品孔－(f2－f1)空白孔】/【(f2－f1)对照孔－(f2－f1)空白孔】，即(1-酶的相对活性)
×
100％＝样品的抑制率。其中样品为计算机模拟构建的多肽库。通过高通量筛选，即可获得目标多肽。
9.进一步的，所述筛选的caspase-3蛋白抑制肽序列如seq id no：1所示。
10.进一步的，本发明提供一种促进骨髓间充质干细胞活性抑制凋亡的方法，所述方法包括将骨髓间充质干细胞在含有caspase-3蛋白抑制肽的培养基中进行培养的步骤。
11.进一步的，本发明还提供一种骨髓间充质干细胞在制备用于促进皮肤损伤修复的药物组合物中的应用。
12.进一步的，本公开的药物组合物还可以包括通常用于制备药物组合物的药学上可接受的载体，赋形剂或稀释剂，并且所述载体可以包括非天然存在的载体。载体，赋形剂和稀释剂的例子包括乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，木糖醇，赤藓糖醇，麦芽糖醇，淀粉，阿拉伯树胶，藻酸盐，明胶，磷酸钙，硅酸钙，纤维素，甲基纤维素，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，水，尼泊金乙酯，尼泊金丙酯，滑石，硬脂酸镁和矿物油。
13.另外，该药物组合物可以制成片剂，根据常用方法的丸剂，散剂，颗粒剂，胶囊剂，混悬剂，溶液剂，乳剂，糖浆剂，灭菌水溶液，非水溶剂，混悬剂，乳剂，冻干制剂，透皮吸收剂，凝胶剂，洗剂，软膏剂，霜剂，贴剂，巴布剂，糊剂，喷雾剂，皮肤乳剂，皮肤混悬剂，透皮传
递贴剂，含药绷带或栓剂。具体地，当配制时，药物组合物可使用稀释剂或赋形剂制备，所述稀释剂或赋形剂例如常用的填料，重量剂，粘合剂，润湿剂，崩解剂和表面活性剂。口服给药的固体材料包括片剂，丸剂，散剂，颗粒剂，胶囊，但不限于此。这样的固体材料可以通过混合至少一种或多种赋形剂，例如淀粉，碳酸钙，蔗糖，乳糖，明胶等来制备。
14.进一步的，药物组合物中还含有抗氧化剂。本公开的抗氧化剂可包括但不限于可用于细胞培养物中的抗氧化剂。它们可以包括选自谷胱甘肽，半胱氨酸，半胱胺，泛醌醇，-巯基乙醇和抗坏血酸(aa)中的一种或多种。当用抗氧化剂补充培养基时，抗氧化剂可以以10-50g/ml，优选10-30g/ml，更优选25g/ml的浓度加入。
15.根据本公开的药物组合物的剂量可以是例如每天1mg/kg至1000mg/kg，但是该剂量不以任何方式限制本公开的范围。
16.进一步的，本发明还提供一种caspase-3蛋白抑制肽在制备用于预防皮肤遭受紫外线伤害的药物组合物中的应用，其中所述抑制肽的序列如seq id no：1所示。
17.进一步的，本发明还提供一种caspase-3蛋白抑制肽和骨髓间充质干细胞在制备用于皮肤损伤治疗以及紫外线辐射治疗地药物组合物中的应用，其中所述抑制肽的序列如seq id no：1所示，所述骨髓间充质干细胞是采用含有caspase-3蛋白抑制肽的培养基培养获得的。
18.进一步的，本发明还提供一种caspase-3蛋白抑制肽和骨髓间充质干细胞在制备用于预防紫外线辐射的美容产品中的应用，其中所述抑制肽的序列如seq id no：1所示，所述骨髓间充质干细胞是采用含有caspase-3蛋白抑制肽的培养基培养获得的。
19.当本公开的组合物包含在用于预防或改善皮肤抗紫外线损伤的准药物中时，该组合物可以原样使用，或者可以与其它准药物成分一起使用，并且可以根据一般方法适当地使用。可以根据使用目的适当地确定活性成分的混合量。本公开的准药物并不特别局限于此，而是可以制备并以例如乳膏，洗剂，气雾剂，洗发剂，凝胶或包装的形式使用。在乳膏，洗剂，气雾剂，洗发剂，凝胶或包装的情况下，基材如白凡士林，黄凡士林，羊毛脂，漂白蜂蜡，十六醇，硬脂醇，硬脂酸，氢化油，胶凝烃，聚乙二醇，液体石蜡和角鲨烷；溶剂和溶解助剂如油酸，肉豆蔻酸异丙酯，三异辛酸甘油，色胺酮，癸二酸二乙酯，己二酸二异丙酯，月桂酸己酯，脂肪酸，脂肪酸酯，脂肪醇和植物油；抗氧化剂如生育酚衍生物，l-抗坏血酸，二丁基羟基甲苯和丁基羟基茴香醚；防腐剂如对羟基苯甲酸酯；保湿剂如甘油，丙二醇和透明质酸钠；表面活性剂如聚氧乙烯衍生物，甘油脂肪酸酯，蔗糖脂肪酸酯，脱水山梨糖醇脂肪酸酯，丙二醇脂肪酸酯和卵磷脂；包括增稠剂如羧乙烯基聚合物，黄原胶，羧甲基纤维素，羧甲基纤维素钠盐，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素等。
20.该药物组合物可以口服或胃肠外给药的方式给药。胃肠外给药包括，例如，静脉内给药，腹膜内给药，肌肉内给药，透皮给药或皮下给药，并包括将药物组合物施用，喷雾或吸入目标部位，但不限于此。
21.本发明药物组合物的剂量是允许给予该药物组合物的患者或受试者获得治疗效果的细胞量，与未给予该药物组合物的患者或受试者相比较。具体剂量可以根据给药形式，给药方法，预期用途，患者或受试者的年龄，体重和症状等适当地确定。对人的单剂量间充质干细胞没有特别的限制，例如是104细胞/kg体重或更多，105细胞/kg体重或更多或106细胞/kg体重或更多。而且，对人的单剂量间充质干细胞没有特别的限制，例如是109细胞/kg
体重或更小，108细胞/kg体重或更小或107细胞/kg体重或更少。
22.本发明还涉及包含上述caspase-3抑制剂以及采用所述caspase-3抑制剂培养的骨髓间充质干细胞的美容品，如护肤品、化妆品。所述美容品还可以包括本领域技术人员熟知的其他添加剂，如赋形剂、缓冲剂等。所述赋形剂是蔗糖，所述缓冲剂是浓度为0.05mol/l，ph为6.8-7.5，且包含0.9％nacl和0.0015mol/lcacl2的磷酸缓冲液。其中，蔗糖作为赋形剂。
23.本发明的骨髓间充质干细胞还可以通过将干细胞裂解制备成为相应的裂解液，本发明还提供的含所述干细胞裂解液的培养液冻干粉，可以作为生物美容原料，添加到面霜、润肤露和爽肤水等化妆品中生产成相关产品，冻干粉加入溶媒或生理盐水溶解后，加入到面霜、润肤露和爽肤水等中混匀即可。
24.本发明提供了通过获取的人干细胞培养液、含人干细胞裂解液的培养液及其浓缩液富含细胞生长因子，可以制备成面霜、润肤露、爽肤水、面膜和精华液等产品，能够对皮肤具有抗紫外损伤和抗细胞凋亡导致的衰老等美容作用。
25.有益效果
26.本发明通过构建的caspase-3抑制剂筛选模型筛选得到特异性抑制caspase-3的活性肽，所述多肽通过抑制caspase-3的活性进而有效的促进了骨髓间充质干细胞的增殖，同时，所述多肽具有较好的抑制成纤维细胞遭受紫外线的损伤，同时用所述抑制剂培养的骨髓间充质干细胞具有较好的治疗皮肤损伤修复的效果。
附图说明
27.图1高通量筛选结果图
28.图2多肽对骨髓间充质干细胞的增殖影响结果图
29.图3caspase-3的蛋白表达情况结果图
30.图4细胞活力结果图
31.图5骨髓间充质干细胞促进创面愈合结果图
具体实施方式
32.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：下述实施例中所用材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径获得。
33.实施例1 caspase-3抑制剂的筛选
34.根据ncbi的人源caspase-3序列，设计引物f：5
’‑
ggcgggtcatatgtataaaatggattatcctgag-3’，r：5
’‑
gcgctcgagaaaatagagttcttttgtgagcat-3’，以人外周血dna为模板pcr扩增目的片段，随后以限制性内切酶ndei、xhoi切割目的片段及载体，回收后连接并转化至dh5-α，涂布lb/amp(100mg/l)平板，筛选阳性克隆，经测序后转化bl21(de3).以终浓度0.4mmol/l iptg 16℃振荡过夜，诱导表达，收集菌体，pbs洗涤后，超声破碎，收集上清液，采用ni柱进行纯化，获得纯化的caspase-3蛋白，通过sds-page分析显示观察到明显条带，与预测的分子量相符。酶活力测定，酶活力定义为：当底物饱和时，在37℃下，每分钟内催化底物ac－devd－amc分解产生1pmol amc所需的酶量定义为一个酶活力单位(u)。经测定，纯化的caspase-3蛋白的酶活接近9800u/g，活性较好。
35.构建筛选体系：反应体系中含有caspase-3蛋白、适量反应缓冲液(25mmol/lhepes，0.1％chaps，100mmol/l nacl，10mmol/ldtt，10％蔗糖，1mmol/l edta，ph 7.5)、样品、空白孔为反应缓冲液及ac－devd－amc(20μg/ml)，振荡混匀后以355nm为激发波长测定460nm下的荧光强度值(f1)，每分钟测一次。在线性范围内将最后一次读数设为f2。
36.样品对caspase-3酶抑制率的计算公式为：酶的相对活性＝【(f2－f1)样品孔－(f2－f1)空白孔】/【(f2－f1)对照孔－(f2－f1)空白孔】，即(1-酶的相对活性)
×
100％＝样品的抑制率。以caspase-3的阳性抑制剂ac－devd－cho对筛选体系进行验证，证明了阳性抑制剂浓度与抑制效果具有剂量依赖性，模型可以用于后续的筛选。
37.在筛选过程中，其中样品为计算机模拟构建的多肽库。通过高通量筛选，其中典型的筛选结果如图1所示。
38.从图1可以看出，cpy-201和cpy-423这二个多肽对caspase-3蛋白活性抑制效果最好，可抑制caspase-3的99％以上的活性，具有较好的抑制效果。其中，cpy-201的氨基酸序列通过鉴定其序列如seq id no：1所示。
39.实施例2骨髓间充质干细胞的分离与鉴定
40.将骨髓血放入采用密度梯度离心法与贴壁筛选法相结合分离骨髓间充质干ml无菌离心管中，将骨髓血与等量pbs混匀，室温1000min离心5min，弃上清及脂肪层，等量dmem/f12重悬细胞。将细胞悬液紧贴管壁缓慢加入到预先装有等体积密度为1.077g/ml的人淋巴细胞分离液(ficoll的离心管)中，避免晃动，使细胞悬液缓慢叠加于ficoll液面上。2000r/min离心25min，小心取出离心管，共分4层，可见中间层为乳白色云雾状的单个核细胞层。吸取单个核细胞层于另一离心管中，加入pbs混匀。1000r/min离心3min，弃上清，以细胞完全培养液(含体积分数10％fbs的dmem/f12)悬浮细胞，吹打均匀。按5xl05cm2度接种于25cm2胞培养瓶，置37℃、体积分数5％co2、饱和湿度的培养箱中培养。72h后首次换液，弃取悬浮的非贴壁细胞，以后每两三天换液1次。倒置相差显微镜下观察细胞生长状态，约80％贴壁细胞爬满培养瓶底时，可以传代，以0.25％胰蛋白酶消化，按照1：3比例传代扩增。
41.hmscs细胞表面标志的检测培养生长良好的第3代细胞用磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤3次，用胰酶消化成单细胞，1500r/min离心15min，收集细胞沉淀，pbs洗涤3次，分别取l
×
105个细胞悬液100μl加入荧光标记的抗体10μl；室温反应孵育30min，pbs洗去未标记抗体，用流式细胞仪检测细胞cd44、cd34，cd90、cd45表面抗原表达。结果显示：cd44阳性表达大于95％，cd90阳性表达也大于94％，而cd34和cd45几乎不表达，这说明本实验分离培养得到了纯度较高的骨髓间充质干细胞。
42.实施例3 cpy-201多肽对骨髓间充质干细胞的影响
43.将实施例2鉴定的骨髓间充质干细胞培养在含有10％胎牛血清的f12-dmem培养基，取处于对数生长期且生长状况良好的骨髓间充质干细胞，常规消化，制成单细胞悬液。接种于96孔板，调节细胞个数为每孔1
×
104个细胞。培养24h。分别加入不同浓度的cpy-201多肽及f12-dmem培养基。用0、20、100、500μg/ml浓度的多肽揭示其促增殖作用与浓度之间的关系。加入不同浓度的多肽后继续培养48h。酶标仪检测490nm处各孔od值，以时间为横轴，以od值为纵轴绘图。结果显示于图2。其中0浓度的多肽作为阴性对照，设置阳性对照组为ac-devd-cho，其浓度为20、100、500μg/ml，结果如图2所示。
44.根据图2的结果可以看出，采用mtt法检测不同浓度多肽48h对细胞增殖的效果显
示，cpy-201多肽浓度为20、l00和500μg/m l时，在48h时均可以比阳性对照组具有更好的促进增殖的效果，在100μg/m l时od490达到了1.13
±
0.07，而同样浓度下阳性对照只有0.88
±
0.06。
45.实施例4 caspase-3的蛋白表达情况检测
46.免疫组织化学检测caspase-3的蛋白表达：收集实施例3培养48h时的各组细胞。固定细胞，pbs洗5min 3次，体积分数3％h2o2室温湿盒孵育10min，pbs洗5min 3次，体积分数1o％正常山羊血清室温封闭30min，加兔抗大鼠多克隆一抗(1：50)4℃过夜，pbs洗2min 3次，二抗室温湿盒30min，pbs洗5min 3次，dab显色，苏木精复染2min，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，光学显微镜下观察。image pro plus图像分析软件计算平均吸光度。200倍视野下，caspase-3表达平均吸光度＝累积吸光度/面积。结果如图3所示。
47.从图3的结果可以看出，cpy-201多肽随着浓度的增加与对照组相比，caspase-3表达下降显著(p《0.05)。在浓度为500μg/ml时，caspase-3平均吸光度只有0.022
±
0.003。
48.实施例5 cpy-201多肽抑制剂对人皮肤成纤维细胞uvb紫外线照射的影响
49.将皮肤成纤维细胞以每孔5
×
103个细胞接种于96孔板，当细胞生长至70％～80％融合时，将每孔中细胞的上清弃去，加入80μl pbs，然后以150mj/cm
2 uvb照射，照射后立即将各孔中的pbs换成150μl培养基，置37摄氏度5％c02孵箱中分别培养12h，24h，36h和48h。在实验结束前4h，每孔中分别加入20μl 5mg/ml mtt溶液，孵育4h后吸除上清，各孔中加入100μldmso，室温震荡15min，使各孔底部颗粒状物质溶解，之后再490nm酶标仪上比色，记录，并比较od值。其中实验组中在照射之前添加终浓度为10mm的多肽或同浓度的前述阳性对照预处理30min，空白对照组不添加多肽。结果如图4所示。
50.从图4的结果可以看出，人皮肤成纤维细胞接受150mj/cm
2 uvb照射后，在12h、24h、36h和48h4个不同时间点，细胞活性逐渐降低，在照光后48h细胞活力最低。但是添加了阳性对照或本发明的多肽预处理之后，能够显著的抑制uvb照射对细胞的损伤，特别是本发明的多肽，能够以更快的速度逆转和提高细胞活力，在48h时，细胞活力达到了(95.1
±
2.0)％，效果提升显著。
51.实施例6骨髓间充质干细胞促进创面愈合实验
52.将实施例2鉴定的骨髓间充质干细胞培养在含有10％胎牛血清的f12-dmem培养基，取处于对数生长期且生长状况良好的骨髓间充质干细胞，常规消化，制成单细胞悬液。接种于96孔板，调节细胞个数为每孔1
×
104个细胞，在含有10％胎牛血清、20μg/ml的cpy-201多肽的f12-dmem培养基培养，收集骨髓间充质干细胞作为实验组。以未添加多肽的培养基培养的干细胞作为对照组，阳性对照组为20μg/ml的ac-devd-cho。
53.实验分组和细胞模型的制备实验共分2组：(1)实验组：hmscs+heka直接共培养。无血清培养基垂悬hmscs，然后接种到平皿中已融合成片的heka表面，共培养12h。其中骨髓间充质干细胞分别采用多肽处理、ac-devd-cho处理以及不处理三种形式；(2)对照组：单纯heka培养组。各组均用含脱氧胸腺嘧啶苷无血清培养基培养。各组均在倒置显微镜下用移液管尖端沿预先在平皿底部描绘的标记线刮擦生长融合成片的单层细胞，制备100μm宽度的表皮创面。
[0054]“表皮创面”愈合速度检测：各组细胞培养72h后，在倒置相差显微镜下观察“表皮创面”愈合情况，并用sigma scan pro软件计算创面愈合率，创面愈合率＝迁移到表皮创面
细胞所占面积/表皮创面总面积
×
100％。结果如图5所示。
[0055]
从图5可以看出，表皮创伤后72h，用sigma scan pro软件计算创面愈合率，cpy-201多肽培养的骨髓间充质干细胞共培养组以及阳性对照组都明显高于未用多肽处理的骨髓间充质干细胞共培养组和单纯heka培养组，前三者与后者之间差异具有显著性(p《0.05)。其中，cpy-201多肽培养的骨髓间充质干细胞共培养组的创面愈合率达到了0.73
±
0.05，具有较好的愈合效果。
[0056]
应当理解，以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。