铁皮石斛提取物及其应用的制作方法

1.本发明属于化妆品领域，具体涉及具有良好的皮肤保湿和/或皮肤屏障作用的铁皮石斛提取物及其在皮肤外用剂中的应用。


背景技术：

2.皮肤是人体最大的器官，像一道屏障被覆于人体的体表。作为人体的第一道防线，皮肤的屏障保护作用至关重要。皮肤的屏障作用，广义上讲，有两层作用：即具有保护作用，可抵御外界有害刺激物、日光的进入，保护肌肤免受伤害；又具有保湿作用，防止过多水分的流失，保持角质层的含水量，调节肌肤的水分含量等。正常的皮肤含水量为20％～35％，当皮肤含水量降低至10％以下时，皮肤的屏障功能即受损，皮肤出现很多疾病或亚健康状态。因此，保湿是健康皮肤和疾病皮肤的重中之重，皮肤保湿屏障在皮肤屏障作用中尤为重要。
3.皮肤由表皮、真皮和皮下组织三部分组成。而表皮的最外层——角质层，是皮肤的第一道屏障门，对皮肤屏障起着至关重要的作用。研究学者生动地将皮肤的屏障作用，演绎成“砖墙学说”，形象地将角质层细胞比喻为墙的砖块，是由占角质层80％的丝聚蛋白(filaggrin，flg)、兜甲蛋白(loricrin，lor)等相关交联而成，形成不溶性致密结构。
4.flg是一种重要的结构蛋白，其最重要的功能是表皮物理屏障，起到交叉连接角蛋白纤维的作用。flg也是皮肤天然保湿因子的一个重要来源，能有效调节肌肤水分流失。lor是角质包膜的重要组成成分之一。角质包膜的形成标志着角质形成细胞分化的终末产物——角质形成细胞的产生，是表皮作为一种防御屏障的基础。
5.在皮肤结构中，虽然角质层被认为是最重要的生理屏障，但表皮基底层对于屏障功能同样重要。表皮基底层的角质形成细胞表达得到水通道蛋白(aquaporin 3，aqp3)，它是一个完整的跨膜蛋白通道。体内循环中的水分和甘油可以通过aqp3到达表皮，促进角质层的水合作用，与皮肤保湿屏障功能密切相关。
6.紧密连接蛋白(claudin-1)是连接蛋白的一种，在皮肤中主要在颗粒层中的角质细胞内表达。紧密连接蛋白(claudin-1)、闭锁小带蛋白(zonula occludens 1，zo-1)、闭锁蛋白(occludin)都属于紧密连接蛋白。紧密连接蛋白相互缠绕组成蛋白颗粒，在细胞表面重复排列，形成连续的纤维，将相邻细胞间连接起来，使大分子物质难以通透，而水分子也只能从纤维衔接处的小孔中缓慢透过。紧密连接相关蛋白在维护皮肤屏障、表皮含水量中起到重要作用。2021年发布的《化妆品分类规则和分类目录》中对保湿的释义说明和宣称指引是用于补充或增强施用部位水分、油脂等成分含量，有助于保持施用部位水分含量或减少水分流失，所以当物质作用于皮肤后，能够增加皮肤中的含水量，同样也说明该物质具有保湿作用。
7.铁皮石斛是我国传统滋阴名贵中药材之一，被列为“中华九大仙草”之首。喜温暖、湿润，附生于海拔达1600m的疏林中的树干或沟谷半阴湿岩石上。主要分布于安徽西南部、浙江东部等。2020版《中华人民共和国药典》记载：铁皮石斛为兰科植物铁皮石斛
dendrobium officinale kimura et migo的干燥茎。甘，微寒。归胃、肾经。益胃生津，滋阴清热。现代研究表明，铁皮石斛含有丰富的多糖、多酚、黄酮类等美容成分，具有抗氧化、抗炎、抗衰老等美容作用。
8.铁皮石斛多糖含量丰富，按干燥品计算，铁皮石斛含多糖以无水葡萄糖(c6h
12
o6)计，不得少于25.0％。多糖是一类成分较为复杂的混合物，常用的含量测定方法是比色法，利用多糖在水中溶解性好，在乙醇等有机溶剂中溶解性差的特点，将多糖与小分子糖类分离后显色测定。多糖类成分大多容易吸湿，因此若直接鲜铁皮石斛提取液制备成冻干粉，容易吸潮，不易运输、储存及使用。所以需要加入大量麦芽糊精，来解决冻干粉吸潮等问题，同时麦芽糊精在冻干工艺中还是一种较好的赋形剂。但麦芽糊精也是一类易溶于水不易溶于乙醇的糖类辅料，醇沉不能将麦芽糊精与多糖分离，会导致多糖含量测定结果偏高，出现一些产品标示的多糖含量远高于真实值的现象，损害了消费者的利益，扰乱了市场秩序。通过文献研究发现，糖化酶可将麦芽糊精水解为小分子糖类，消除麦芽糊精对铁皮石斛多糖含量测定的干扰。本发明利用糖化酶去除鲜铁皮石斛冻干粉中的麦芽糊精，建立完整的鲜铁皮石斛冻干粉定性定量方法。
9.本发明建立完整的鲜铁皮石斛冻干粉定性定量方法，并且发现铁皮石斛具有较好的保湿屏障作用，尤其是在促进aqp3、flg、lor、zo-1、claudin-1、occludin等的基因表达方面，表现显著。


技术实现要素：

10.一方面，本发明提供了具有皮肤保湿和/或维护皮肤屏障功能的铁皮石斛提取物，所述提取物采用溶剂提取法制备。在优选的实施方式中，本发明的铁皮石斛提取物采用水作为溶剂提取。在优选的实施方式中，所述皮肤保湿和/或维护皮肤屏障功能通过促进选自以下的基因的表达实现：aqp3、flg、lor、zo-1、claudin-1、occludin或其组合。
11.另一方面，本发明提供了铁皮石斛提取物的冻干产品。在优选的实施方式中，本发明的冻干产品的制备过程还包括加入麦芽糊精。在优选的实施方式中，本发明的冻干产品的多糖含量为30.43重量％。
12.另一方面，本发明还涉及一种检测铁皮石斛提取物的冻干产品的多糖含量的方法，包括加入糖化酶的步骤。
13.另一方面，本发明还涉及一种包含铁皮石斛提取物的冻干产品的皮肤外用剂。在优选的实施方式中，铁皮石斛提取物的冻干产品在皮肤外用剂中的含量为0.08-1重量％。在更优选的实施方式中，铁皮石斛提取物的冻干产品在皮肤外用剂中的含量为0.32-0.48重量％。
附图说明
14.图1显示了实施例1鲜铁皮石斛提取液样品颜色。
15.图2显示了实施例2鲜铁皮石斛提取液脱色后样品颜色。
16.图3显示了实施例12-14样品的红外光谱。
具体实施方式
17.本发明首次发现铁皮石斛提取物具有较好的皮肤保湿和皮肤屏障作用，尤其是在促进aqp3、flg、lor、zo-1、claudin-1、occludin等的基因表达方面作用显著。因此，铁皮石斛提取物可作为功效添加剂加入到皮肤外用剂(例如，护肤品)中，以辅助改善与aqp3、flg、lor、zo-1、claudin-1、occludin有关的皮肤问题如肌肤干燥、皮肤屏障受损等。
18.而且，本发明还利用糖化酶去除鲜铁皮石斛冻干粉中的麦芽糊精，建立完整的鲜铁皮石斛冻干粉定性定量方法。
19.为了提供更简明的描述，本文给出的一些数量表述没有用术语“约”修饰。应当理解，无论是否明确地使用了术语“约”，本文所给出的每个量都意在指代实际的给定值，并且还意在指代由本领域的普通技术人员可合理推测出的这些给定值的近似值，包括这些给定值的由实验和/或测量条件所引起的近似值。
20.为了提供更简洁的描述，本文中一些数量表述被叙述为约x量至约y量的范围。应当理解，当叙述范围时，该范围并不限制于所叙述的上下界限，而应包括约x量至约y量的整个范围或它们之间的任何量。
21.铁皮石斛提取物
22.铁皮石斛是我国传统滋阴名贵中药材之一，被列为“中华九大仙草”之首。现代研究表明，铁皮石斛含有丰富的多糖、多酚、黄酮类等美容成分，具有抗氧化、抗炎、抗衰老等美容作用。以往研究对于铁皮石斛的抗炎抗衰老作用较多，根据文献和已有专利来看，未有铁皮石斛单味药在皮肤保湿和皮肤屏障作用，尤其是促进aqp3、flg、lor、zo-1、claudin-1、occludin等基因表达方面作用的报道。
23.本发明意外地发现，铁皮石斛提取物具有促进aqp3、flg、lor、casp14、zo-1、claudin-1、occludin等基因表达的作用。本发明的铁皮石斛提取物可作为功效添加剂用于皮肤外用剂中，具有修复肌肤、修护强韧屏障、焕新肌底、改善肌肤干燥等作用。
24.本发明使用的铁皮石斛可以是干铁皮石斛，也可以是鲜铁皮石斛。
25.对于铁皮石斛的提取方法，采用溶剂提取。在优选的实施方式中，先将鲜铁皮石斛进行粉碎操作，然后再进行溶剂提取。
26.在对铁皮石斛进行溶剂提取时，应当选择具有以下特性的提取溶剂：
①
溶解性能好，即溶剂对所需成分的溶解度要大，对杂质的溶解度要小，或反之；
②
惰性，即溶剂不能与植物成分发生化学反应，即使反应也属于可逆性的；
③
操作简便，在提取的提取物后能够方便地将溶剂与提取物分离，或者能直接将溶于溶剂中的提取物用于下一步骤；
④
经济安全，即在选择溶剂时要考虑经济易得，毒性小，便于回收和反复使用，并具有一定的安全性，对环境污染小。在本发明的优选实施方式中，采用水(例如，去离子水)进行提取。在一个具体的实施方式中，在95～105℃的条件下采用水作为提取溶剂进行提取。
27.鲜铁皮石斛的提取过程还包括脱色步骤。在优选的实施方式中，采用活性炭进行脱色。在更优选的实施方式中，采用20目～200目的活性炭进行脱色。
28.铁皮石斛提取物的冻干产品
29.本发明还提供了铁皮石斛提取物的冻干产品。
30.铁皮石斛多糖含量丰富，而多糖类成分大多容易吸湿，因此若直接鲜铁皮石斛提取液制备成冻干粉，容易吸潮，不易运输、储存及使用。因此，在制备铁皮石斛提取物的冻干
产品时加入大量的麦芽糊精，从而解决冻干粉吸潮等问题。而且，麦芽糊精在冻干工艺中也是一种较好的赋形剂，适合与活性成分一起进行冻干。
31.在一些实施方式中，取铁皮石斛提取物，加入大量的麦芽糊精，进行冷冻干燥。在一个具体的实施方式中，取铁皮石斛提取物1kg，加入40g麦芽糊精，进行冷冻干燥。
32.在一些实施方式中，冷冻干燥的具体条件包括：-40℃预冻至固体，4～8h；-5℃，16～24h；10℃，4～8h。本发明得到的冻干产品的粉末呈白色至淡黄色，肉眼无明显异物可见。
33.本发明还涉及这种冻干产品的定性定量方法。
34.由于在冻干过程中加入了大量的麦芽糊精，而麦芽糊精导致多糖含量测定结果偏高，因而导致一些产品标示的多糖含量远高于真实值的现象。为了解决该问题。本发明的冻干产品的多糖含量检测过程包括加入糖化酶的步骤。糖化酶可将麦芽糊精水解为小分子糖类，消除麦芽糊精对铁皮石斛多糖含量测定的干扰。采用这种检测方法能够保障消费者的利益，维护市场秩序。在一个具体的实施方式中，在2ml的1重量％铁皮石斛提取物的冻干产品的水溶液中加入0.1ml糖化酶。
35.皮肤外用剂
36.本发明所述的铁皮石斛提取物可以作为具有维护皮肤屏障功能的添加剂应用于皮肤外用剂。在一个具体的实施方式中，铁皮石斛提取物可以作为具有维护皮肤屏障功能的添加剂应用于化妆品中。在一个具体的实施方式中，所述化妆品选自：洁面乳、化妆水、乳液、膏霜、啫喱、面膜。根据制剂的不同类型添加不同的用量。
37.在一些优选的实施方式中，所述皮肤外用剂中包含铁皮石斛提取物的用量可以是0.001％-10％(w/w)，0.002％-10％(w/w)，0.003％-10％(w/w)，0.01％-10％(w/w)，0.02％-10％(w/w)，0.03％-10％(w/w)，0.1％-10％(w/w)，0.2％-10％(w/w)，0.3％-10％(w/w)。在一些优选的实施方式中，所述皮肤外用剂中包含铁皮石斛提取物的用量可以是0.001％-1％(w/w)，例如0.002％-1％(w/w)，0.003％-1％(w/w)，0.01％-1％(w/w)，0.02％-1％(w/w)，0.03％-1％(w/w)，0.1％-1％(w/w)，0.2％-1％(w/w)，0.3％-1％(w/w)。
38.在一些具体的实施方式中，用于皮肤保湿和/或维护皮肤屏障功能的铁皮石斛提取物的用量为0.08％-1％(w/w)。在一些具体的实施方式中，用于皮肤保湿和/或维护皮肤屏障功能的铁皮石斛提取物的用量为0.12％-0.64％(w/w)。在一些具体的实施方式中，用于皮肤保湿和/或维护皮肤屏障功能的铁皮石斛提取物的用量为0.24％-0.5％(w/w)。在一些具体的实施方式中，用于皮肤保湿和/或维护皮肤屏障功能的铁皮石斛提取物的用量为0.32％-0.48％(w/w)。
39.在本发明的另一方面，提供了一种具有皮肤保湿和/或维护皮肤屏障功能的皮肤外用剂，所述皮肤外用剂包含按照本发明方法制备得到的包含铁皮石斛提取物及化妆品领域可接受的赋形剂。
40.所述皮肤外用剂是通常用于皮肤外部的所有成分的统称概念，例如可以是化妆料组合物或药学组合物。所述化妆料组合物中可以是基础化妆料、面部妆容化妆料、身体用化妆料、头发护理用化妆料等，对其剂型无特殊限制，根据不同目的可合理选择。
41.所述化妆料组合物中根据剂型和目的的不同还含有不同的化妆品学层面允许的介质或基质赋形剂。
42.可以用于本发明皮肤外用剂组合物的化妆品、皮肤病学或药学上可接受的赋形剂
为水相、油相、凝胶、水包蜡型乳液、水包油型乳液或油包水型乳液的形式。水相为一种或多种水溶性或分散性组分的混合物，其在室温(25℃)下可以为液体、半固体或固体。赋形剂包括或可以为在水或水-醇赋形剂中的混悬液、分散液或溶液的形式，其可以含有增稠剂或凝胶剂。本领域技术人员可以基于本领域技术人员掌握的知识选择合适的产品形式，其中包含的组分。
43.所述的组合物可以包括水相，该水相可以含有水或水与至少一种亲水性有机溶剂的混合物，所述的亲水性有机溶剂诸如醇，尤其是含有2-5个碳原子的直链或支链低级一元醇，如乙醇或丙醇；多元醇，如丙二醇、山梨醇、甘油、泛醇或聚乙二醇及其混合物。
44.当发明的组合物为乳液形式时，该组合物还可以任选包含表面活性剂。
45.所述的组合物还可以包含成膜聚合物，如聚氨基甲酸酯、聚丙烯酸均聚物或共聚物、聚酯、基于烃的树脂和/或硅氧烷树脂。可以将聚合物溶于或分散于化妆品可接受的赋形剂中并且任选与增塑剂合并。
46.本发明的组合物还可以包含油相，所述的油相含有在室温(25℃)下为液体的油溶性或油分散性组分和/或在室温下为油状或蜡状的物质，如蜡、半固体、树胶及其混合物。该油相还可以含有有机溶剂。
47.通常在室温下为液体，合适的油性物质包括：来源于动物的基于烃的油，如全氢化角鲨烯；基于烃的植物油，如液体的c4-10脂肪酸的甘油三酯类，例如庚酸或辛酸甘油三酯类，或油，例如向日葵油、玉米油、大豆油、葡萄籽油、蓖麻油、鳄梨油、辛酸/癸酸甘油三酯类、霍霍巴油；矿物或合成来源的直链或支链烃类，例如液体石蜡及其衍生物、凡士林；合成酯类和醚类，特别是脂肪醇的酯类，例如肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸2-乙基己酯、硬脂酸2-辛基十二烷基酯、异硬脂酸异硬脂醇酯；羟基化酯类，例如乳酸异硬脂醇酯、羟基硬脂酸辛酯、羟基硬脂酸辛酯、羟基硬脂酸辛基十二烷基酯、脂肪醇的庚酸酯类、辛酸酯类和癸酸脂类；多元醇酯类，例如丙二醇二辛酸酯、新戊二醇二庚酸酯、二甘醇二异壬酸酯和季戊四醇酯类；含有c12-26的脂肪醇类，例如辛基十二烷醇、2-丁基辛醇、2-己基癸醇、2-十一烷基十五烷醇、油醇；基于部分烃的氟油和/或氟硅油，硅油，在室温下为液体或半固体的挥发性或非挥发性的直链或环状聚甲基硅氧烷，例如环状聚二甲基硅氧烷和聚二甲基硅氧烷，其任选包含苯基，例如苯基三甲基硅氧烷、硅氧烷及其混合物。
48.本发明的组合物可以进一步包含常用于化妆品领域中的任何组分。这些组分包括防腐剂、水相增稠剂(提取物生物聚合物、合成聚合物)和脂肪相增稠剂、芳香剂、亲水性和亲脂性活性剂及其混合物。
49.本发明的组合物还可以包含另外的颗粒相，所述的颗粒相可以为化妆品组合物中使用的颜料和/或珠光剂和/或填充剂。
50.颜料可以存在于组合物中，合适的无机颜料包括氧化钛、氧化锆和氧化铈以及氧化锌、氧化铁和铁蓝；合适的有机颜料包括钡、锶、钙和铝色淀和碳黑。
51.珠光剂可以存在于组合物中，合适的珠光剂包括涂覆了氧化钛、氧化铁或天然颜料的云母。
52.填充剂可以存在于组合物中，合适的填充剂包括滑石粉、二氧化硅、硬脂酸锌、云母、高岭土、尼龙粉末、聚乙烯粉末、特氟龙、淀粉、一氮化硼、共聚物微球，例如硅氧烷树脂微珠。
53.本发明组合物的油相可以包含一种或多种蜡、树胶或其混合物。蜡包括基于烃的蜡、氟蜡和/或硅氧烷蜡，并且可以来源于植物、矿物、动物和/或合成来源。合适的蜡包括蜂蜡、巴西棕榈蜡、小烛树蜡、石蜡、微晶蜡、地蜡；合成蜡包括聚乙烯蜡、含有c16-45的硅氧烷蜡。树胶一般为聚二甲基硅氧烷或羧甲基纤维素钠或提取物类，并且半固体物质一般为基于烃的化合物，如羊毛脂及其衍生物。
54.可以将本发明的组合物配制成任何合适的产品形式。这类产品形式包括，但不限于气溶胶型喷雾剂、霜剂、乳液、固体、液体、分散体、泡沫、凝胶、化妆水、摩丝、软膏、粉剂、贴剂、润发油、溶液、手按泵型喷雾剂、棒状物、面膜和湿纸巾。可以将本发明的组合物通过本领域众所周知的各种方法便利地用于制备或作为化妆品、皮肤病学或药物局部施用产品。
55.本发明的皮肤外用剂组合物可以包括一种或多种下列成分：抗过敏剂、抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、着色剂去色素剂、润肤剂、乳化剂、表皮脱落剂、成膜剂、香料、保湿剂、昆虫驱避剂、润滑剂、药物活性剂、增湿剂、耐光剂、防腐剂、护肤剂、皮肤渗透增强剂、防晒剂、稳定剂、表面活性剂、增稠剂、粘度调节剂、维生素或其任意组合。
56.下面结合具体实施例，以进一步阐述本发明。有必要在此指出的是，实施例只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，所有的百分比和份数按重量计。
57.以下实施例中采用的实验材料包括：
58.[0059][0060]
实施例1：鲜铁皮石斛提取液的制备
[0061]
准确称取4.0kg鲜铁皮石斛，粉碎。去离子水95～105℃提取3次，每次40l去离子水，提取1小时。过滤浓缩至5倍生药量，即得如图1所示紫色溶液。
[0062]
实施例2：鲜铁皮石斛提取液的制备
[0063]
准确称取4.0kg鲜铁皮石斛，粉碎。去离子水95～105℃提取3次，每次40l去离子水，提取1小时。过滤浓缩至5倍生药量，加活性炭(20目～200目)脱色。过滤，浓缩得到6.0kg固含量为4％的鲜铁皮石斛提取液，如图2所示颜色的溶液。
[0064]
实施例3：冻干粉的制备
[0065]
取1.0kg实施例2提取液，加入40.0g麦芽糊精，冷冻干燥(-40℃预冻至固体，4～8h；-5℃，16～24h；10℃，4～8h)，粉碎成粉(20目)，干燥失重在4％～6％。粉末呈白色至淡黄色，肉眼无明显异物可见。
[0066]
实施例4：样品配制
[0067]
准确称取0.1g实施例3制备物，配制成20.0g质量分数为0.50％的水溶液，备用。
[0068]
实施例5：样品配制
[0069]
准确称取0.1g实施例3制备物，配制成40.0g质量分数为0.25％的水溶液，备用。
[0070]
实施例6：样品配制
[0071]
准确称取0.1g实施例3制备物，配制成100.0g质量分数为0.10％的水溶液，备用。
[0072]
实施例7：样品配制
[0073]
准确称取0.1g实施例3制备物，配制成500.0g质量分数为0.02％的水溶液，备用。
[0074]
实施例8：样品配制
[0075]
准确称取0.1g实施例3制备物，配制成1000.0g质量分数为0.01％的水溶液，备用。
[0076]
实施例9：样品配制
[0077]
准确称取0.1g干铁皮石斛提取物，配制成100.0g质量分数为0.10％的水溶液，备用。
[0078]
实施例10：样品配制
[0079]
准确称取0.1g干铁皮石斛提取物，配制成200.0g质量分数为0.05％的水溶液，备用。
[0080]
实施例11：样品配制
[0081]
准确称取0.250g实施例3样品，配制成25.0g质量分数为1.0％的水溶液，备用。
[0082]
实施例12：样品配制
[0083]
准确量取2.0ml实施例11至15.0ml离心管中，加入0.1ml糖化酶，备用。
[0084]
实施例13：样品配制
[0085]
准确量取2.0ml实施例11至15.0ml离心管中，加入0.1ml水，备用。
[0086]
实施例14：样品配制
[0087]
准确称取0.50g麦芽糊精，配制成100.0g质量分数为0.5％的水溶液，备用。
[0088]
实施例15：样品配制
[0089]
准确量取2.0ml实施例14至15.0ml离心管中，加入0.1ml糖化酶，备用。
[0090]
实施例16：样品配制
[0091]
准确量取2.0ml实施例14至15.0ml离心管中，加入0.1ml去离子水，备用。
[0092]
实施例17：qpcr法检测角质形成细胞aqp3基因变化
[0093]
本测试基于角质形成细胞，检测实施例4～10作用后aqp3基因表达量的变化情况。设置空白对照组(bc)、cacl2为阳性对照组(pc)、实施例4～10为样品组。
[0094]
按2.0
×
105个/孔的接种密度接种细胞至6孔板，培养箱(37℃、5％co2)中孵育过夜。待6孔板中细胞铺板率达到40％～60％时，进行分组给药，每孔给药量为2.0ml，每组设3个复孔，培养箱(37℃、5％co2)中孵育24h。后弃掉上清，1.0ml/孔pbs清洗两次，每孔加入1.0ml rnaiso plus，吹打裂解细胞后，收样。提取rna，反转录至cdna后，进行荧光定量pcr检测，采用2
‑△△
ct
方法进行结果计算。结果表示为均值
±
sd。样品组与bc组比较采用t-test统计分析。统计分析均为双尾。p《0.05认为具有显著差异，表示为*；p《0.01认为具有极显著差异，表示为**。
[0095]
上调率(％)＝(基因含量
样品组-基因含量
bc
)/基因含量
bc
×
100％。
[0096]
结果如表1所示。
[0097]
表1：aqp3基因表达情况
[0098]
实验分组均值
±
sd上调率bc1
±
0.04/pc2.07
±
0.03**106.90％实施例41.93
±
0.09**93.27％实施例51.14
±
0.07*14.32％实施例61.17
±
0.04**16.83％实施例71.05
±
0.15.11％实施例80.98
±
0.04-2.28％实施例91.09
±
0.048.73％实施例100.76
±
0.07**-23.93％
[0099]
由表1可知，实施例4(鲜铁皮石斛冻干粉配制成质量分数0.5％的水溶液)、5(鲜铁
皮石斛冻干粉配制成质量分数0.25％的水溶液)、6(鲜铁皮石斛冻干粉配制成质量分数0.10％的水溶液)均具有良好的促进aqp3基因表达作用。说明鲜铁皮石斛冻干粉具有较好的促进aqp3基因表达作用，尤其是实施例4(质量分数为0.5％鲜铁皮石斛冻干粉溶液)，促进作用最佳。
[0100]
实施例18：qpcr法检测角质形成细胞flg基因变化
[0101]
本测试基于角质形成细胞，检测实施例4～10作用后flg基因表达量的变化情况。设置空白对照组(bc)、cacl2为阳性对照组(pc)、实施例4～10为样品组。
[0102]
按2.0
×
105个/孔的接种密度接种细胞至6孔板，培养箱(37℃、5％co2)中孵育过夜。待6孔板中细胞铺板率达到40％～60％时，进行分组给药，每孔给药量为2.0ml，每组设3个复孔，培养箱(37℃、5％co2)中孵育24h。后弃掉上清，1.0ml/孔pbs清洗两次，每孔加入1.0ml rnaiso plus，吹打裂解细胞后，收样。提取rna，反转录至cdna后，进行荧光定量pcr检测，采用2
‑△△
ct
方法进行结果计算。结果表示为均值
±
sd。样品组与bc组比较采用t-test统计分析。统计分析均为双尾。p《0.05认为具有显著差异，表示为*；p《0.01认为具有极显著差异，表示为**。
[0103]
上调率(％)＝(基因含量
样品组-基因含量
bc
)/基因含量
bc
×
100％。
[0104]
结果如表2所示。
[0105]
表2：flg基因表达情况
[0106]
实验分组均值
±
sd上调率bc1
±
0.05/pc1.53
±
0.11**52.87％实施例41.81
±
0.09**80.71％实施例51.69
±
0.08**68.40％实施例61.7
±
0.08**69.93％实施例71.14
±
0.1313.89％实施例82.74
±
0.21**173.00％实施例91.35
±
0.11**34.96％实施例101.74
±
0.08**74.31％
[0107]
由表2可知，实施例4～8角质形成细胞flg基因表达上调率明显提高，说明实施例4(鲜铁皮石斛冻干粉配制成质量分数0.5％的水溶液)、实施例5(鲜铁皮石斛冻干粉配制成质量分数0.25％的水溶液)、实施例6(鲜铁皮石斛冻干粉配制成质量分数0.10％的水溶液)、实施例8(鲜铁皮石斛冻干粉配制成质量分数0.01％的水溶液)均具有较好的促进flg基因表达的作用，尤其是实施例8。实施例9、10角质形成细胞flg基因表达上调率明显提高，说明实施例9(干铁皮石斛提取物配制成质量分数0.10％的水溶液)、实施例10(干铁皮石斛提取物配制成质量分数0.05％的水溶液)，同样也具有良好的促进flg基因表达的作用。以上，鲜或干铁皮石斛都具有较好的促进flg基因表达的作用。
[0108]
实施例19：qpcr法检测角质形成细胞lor基因变化
[0109]
本测试基于角质形成细胞，检测实施例4～10作用后lor基因表达量的变化情况。设置空白对照组(bc)、cacl2为阳性对照组(pc)、实施例4～10为样品组。
[0110]
按2.0
×
105个/孔的接种密度接种细胞至6孔板，培养箱(37℃、5％co2)中孵育过
夜。待6孔板中细胞铺板率达到40％～60％时，进行分组给药，每孔给药量为2.0ml，每组设3个复孔，培养箱(37℃、5％co2)中孵育24h。后弃掉上清，1.0ml/孔pbs清洗两次，每孔加入1.0ml rnaiso plus，吹打裂解细胞后，收样。提取rna，反转录至cdna后，进行荧光定量pcr检测，采用2
‑△△
ct
方法进行结果计算。结果表示为均值
±
sd。样品组与bc组比较采用t-test统计分析。统计分析均为双尾。p《0.05认为具有显著差异，表示为*；p《0.01认为具有极显著差异，表示为**。
[0111]
上调率(％)＝(基因含量
样品组-基因含量
bc
)/基因含量
bc
×
100％。
[0112]
结果如表3所示。
[0113]
表3：lor基因表达情况
[0114]
实验分组均值
±
sd上调率bc1
±
0.12/pc1.59
±
0.17**58.04％实施例40.35
±
0.02**-65.11％实施例51.22
±
0.0921.39％实施例60.78
±
0.06*-21.98％实施例70.99
±
0.04-1.83％实施例89.7
±
0.58**346.82％实施例90.55
±
0.04**-45.39％实施例101.19
±
0.1518.50％
[0115]
由表3可知，实施例8作用后，角质形成细胞lor基因表达上调率明显提高，说明实施例8(鲜铁皮石斛冻干粉配制成质量分数0.01％的水溶液)能够较好的促进lor基因的表达作用，说明铁皮石斛具有较好的促进lor基因表达的作用。
[0116]
实施例20：qpcr法检测角质形成细胞zo-1基因变化
[0117]
本测试基于角质形成细胞，检测实施例7、8作用后zo-1基因表达量的变化情况。设置空白对照组(bc)、cacl2为阳性对照组(pc)、实施例7、8为样品组。
[0118]
按2.0
×
105个/孔的接种密度接种细胞至6孔板，培养箱(37℃、5％co2)中孵育过夜。待6孔板中细胞铺板率达到40％～60％时，进行分组给药，每孔给药量为2.0ml，每组设3个复孔，培养箱(37℃、5％co2)中孵育24h。后弃掉上清，1.0ml/孔pbs清洗两次，每孔加入1.0ml rnaiso plus，吹打裂解细胞后，收样。提取rna，反转录至cdna后，进行荧光定量pcr检测，采用2
‑△△
ct
方法进行结果计算。结果表示为均值
±
sd。样品组与bc组比较采用t-test统计分析。统计分析均为双尾。p《0.05认为具有显著差异，表示为*；p《0.01认为具有极显著差异，表示为**。
[0119]
上调率(％)＝(基因含量
样品组-基因含量
bc
)/基因含量
bc
×
100％。
[0120]
结果如表4所示。
[0121]
表4：zo-1基因表达情况
[0122]
实验分组均值
±
sd上调率bc1
±
0.03/pc1.39
±
0.21*39.39％实施例71.19
±
0.1*18.90％
实施例81.1
±
0.079.94％
[0123]
由表4可知：实施例7作用后，角质形成细胞zo-1基因表达上调率明显提高，说明实施例7(鲜铁皮石斛冻干粉配制成质量分数0.02％的水溶液)能够较好的促进zo-1基因表达的作用。
[0124]
实施例21：qpcr法检测角质形成细胞claudin-1基因变化
[0125]
本测试基于角质形成细胞，检测实施例7、8作用后claudin-1基因表达量的变化情况。设置空白对照组(bc)、cacl2为阳性对照组(pc)、实施例7、8为样品组。
[0126]
按2.0
×
105个/孔的接种密度接种细胞至6孔板，培养箱(37℃、5％co2)中孵育过夜。待6孔板中细胞铺板率达到40％～60％时，进行分组给药，每孔给药量为2.0ml，每组设3个复孔，培养箱(37℃、5％co2)中孵育24h。后弃掉上清，1.0ml/孔pbs清洗两次，每孔加入1.0ml rnaiso plus，吹打裂解细胞后，收样。提取rna，反转录至cdna后，进行荧光定量pcr检测，采用2
‑△△
ct
方法进行结果计算。结果表示为均值
±
sd。样品组与bc组比较采用t-test统计分析。统计分析均为双尾。p《0.05认为具有显著差异，表示为*；p《0.01认为具有极显著差异，表示为**。
[0127]
上调率(％)＝(基因含量
样品组-基因含量
bc
)/基因含量
bc
×
100％。
[0128]
结果如表5所示。
[0129]
表5：claudin-1基因表达情况
[0130]
实验分组均值
±
sd上调率bc1
±
0.02/pc1.23
±
0.06**23.08％实施例71.26
±
0.03**25.93％实施例80.96
±
0.06-3.58％
[0131]
由表5可知：实施例7作用后，角质形成细胞claudin-1基因表达上调率明显提高，说明实施例7(鲜铁皮石斛冻干粉配制成质量分数0.02％的水溶液)能够较好的促进claudin-1基因表达的作用。
[0132]
实施例22：qpcr法检测角质形成细胞occludin基因变化
[0133]
本测试基于角质形成细胞，检测实施例7、8作用后occludin基因表达量的变化情况。设置空白对照组(bc)、cacl2为阳性对照组(pc)、实施例7、8为样品组。
[0134]
按2.0
×
105个/孔的接种密度接种细胞至6孔板，培养箱(37℃、5％co2)中孵育过夜。待6孔板中细胞铺板率达到40％～60％时，进行分组给药，每孔给药量为2.0ml，每组设3个复孔，培养箱(37℃、5％co2)中孵育24h。后弃掉上清，1.0ml/孔pbs清洗两次，每孔加入1.0ml rnaiso plus，吹打裂解细胞后，收样。提取rna，反转录至cdna后，进行荧光定量pcr检测，采用方法进行结果计算。结果表示为均值
±
sd。样品组与bc组比较采用t-test统计分析。统计分析均为双尾。p《0.05认为具有显著差异，表示为*；p《0.01认为具有极显著差异，表示为**。
[0135]
上调率(％)＝(基因含量
样品组-基因含量
bc
)/基因含量
bc
×
100％。
[0136]
结果如表6所示。
[0137]
表6：occludin基因表达情况
[0138]
实验分组均值
±
sd上调率bc1.01
±
0.17/pc1.31
±
0.07*30.06％实施例71.04
±
0.142.72％实施例82.71
±
0.38**170.89％
[0139]
由表6可知：实施例8作用后，角质形成细胞occludin基因表达上调率明显提高，说明实施例8(鲜铁皮石斛冻干粉配制成质量分数0.01％的水溶液)能够较好的促进occludin基因表达的作用。
[0140]
实施例23：3d皮肤细胞模型水分含量测定
[0141]
本测试基于3d表皮皮肤模型检测实施例6作用后表皮皮肤含水量的变化情况。设置空白对照组(bc)、甘油为阳性对照组(pc)、实施例6为样品组。
[0142]
将模型转移到6孔板中(提前添加0.9ml epigrowth培养液)，在6孔板上标注测试组编号。样品组将样品均匀分布于模型表面，置于co2培养箱(37℃，5％co2)中孵育24h。孵育结束后，用无菌pbs溶液清洗模型表面残留的受试物，用无菌棉签拭去模型内、外残留液体。结束后，根据模型数量准备24孔板，并做相应标记。每孔加入0.3ml的epigrowth培养液。将装有模型的24孔板放置于超净工作台内，打开24孔板的盖子，静置30min后进行测量。将cm 825皮肤含水量测试探头连接到mpa6适配器上，打开仪器测量软件，选择测量参数为含水量，选择测量模式为单点测量，然后用75％酒精清洁探头。将模型底部的水分擦干，用手术刀片将模型从细胞小室底部环切下来，用镊子将模型放置在测试仪的探头上，保证模型的角质层一面与探头完全接触，然后按压探头进行测量，每个模型测量三次，获得9个数据，取平均值。测量结束后用75％酒精清洁探头，待探头表面干燥后测量下一个模型。各组间比较采用t-test统计分析。统计分析均为双尾。与p《0.05认为具有显著差异，表示为*；p《0.01认为具有极显著差异，表示为**。结果如表7所示。
[0143]
表7：含水量测定情况
[0144]
实验分组均值
±
sdbc26.21
±
0.91pc108.56
±
1.47**实施例6112.88
±
0.07**
[0145]
由表7可知：实施例6作用后，3d表皮含水量极显著上升，说明实施例6(鲜铁皮石斛冻干粉配制成质量分数0.1％的水溶液)能够较好的提高皮肤含水量，具有较好的保湿作用。
[0146]
实施例24：多糖含量检测
[0147]
标准曲线的制备：准确称取干燥至恒重的d-无水葡萄糖0.10446g，去离子水定容至1.0l，摇匀得对照品母液，备用。分别精密吸取葡萄糖对照品母液0.2、0.4、0.6、0.8和1.0ml，置于15.0ml具塞试管中，分别加去离子水至2.0ml。各管分别加入5％苯酚溶液1.0ml，迅速加入5.0ml浓硫酸，振摇均匀，室温静置30min。489nm处测吸光度值，另取2.0ml去离子水作为空白对照。标准曲线：y＝0.0129x+0.0157(r2＝0.998)。结果表明，无水葡萄糖在20.892～104.46μg/ml线性关系良好。
[0148]
样品检测：实施例12、15、16各管均60℃水浴30min，沸水浴5min。分别精密加入无水乙醇10.0ml，摇匀，4℃冷藏1h，取出，离心10min，4000rpm/min。均弃去上清液，沉淀加80％乙醇溶解2次，每次8.0ml，离心，弃去上清液，沉淀加热水溶解，分别转移至25.0ml量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，即得。实施例12、15、16分别稀释10倍，待测。
[0149]
各管分别加入5％苯酚溶液1.0ml，迅速加入5.0ml浓硫酸，振摇均匀，室温静置30min。489nm处测吸光度值。
[0150]
表8：多糖含量检测结果
[0151] 吸光度实施例120.3907实施例150.0462实施例160.3374
[0152]
由表8可知：实施例15(2.0ml 0.5％麦芽糊精溶液，加入0.1ml糖化酶)的od值为0.0462、实施例16(2.0ml0.5％麦芽糊精溶液，加入0.1ml水)的od值为0.3374，实施例16比实施例15的od值明显升高，说明糖化酶能够有效的分解麦芽糊精，可用于鲜铁皮石斛冻干粉的多糖含量检测，而且在计算中应该扣除实施例15(麦芽糊精和糖化酶反应)的计算结果。
[0153]
由公式计算，可知：实施例12多糖含量为3633.72μg/ml，实施例15多糖含量为295.54μg/ml，实施例3(鲜铁皮石斛冻干粉)中多糖含量为30.43％。
[0154]
实施例12多糖含量(μg/ml)＝((od
实施例12-0.0157)/0.0129*10*25)/2
[0155]
实施例15多糖含量(μg/ml)＝((od
实施例15-0.0157)/0.0129*10*25)/2
[0156]
实施例3多糖含量(％)＝(实施例12多糖含量*25/1000)/(0.25*1000)*100％-(实施例15多糖含量*100/1000)/(0.5*1000)*100％
[0157]
实施例25：红外光谱测定
[0158]
取45ml实施例12～14样品分别置于烧杯中，微沸蒸除大部分水，置于105℃烘箱中直至完全烘干，出烘干残余物，进行红外测试，得到各实施例的红外光谱。
[0159]
从图3可知：实施例14麦芽糊精红外指纹区有2个特征吸收1147cm-1
、1077cm-1
，实施例13(未用糖化酶处理的鲜铁皮石斛冻干粉)红外指纹区同样也含有这2个特征吸收，而实施例12(用糖化酶处理的鲜铁皮石斛冻干粉)红外指纹区没有这2个特征吸收。同样说明加入糖化酶可以分解麦芽糊精形成小分子糖，后经醇沉工艺除去小分子糖后，在实施例12中未见明显1147cm-1
、1077cm-1
特征吸收，应属于麦芽糊除去后的表现。
[0160]
同样从图3可知，3279cm-1
处的宽峰为-oh官能团吸收峰，说明其存在分子内或分子间的氢键；在2924cm-1
和1717cm-1
处的峰分别属于c-h键伸缩振动和变角振动；在1070～1020cm-1
处的峰说明有c-o-c的弯曲振动和耦合振动。整体上看与大部分植物多糖红外图谱类似。以上说明该方法可以用来进行鲜铁皮石斛冻干粉的定性检测。
[0161]
实施例26：电导率测定
[0162]
取实施例4～8，测定电导率，结果如表9，所示。
[0163]
表9电导率结果
[0164] 电导率μs/cm实施例4318.8
实施例5164.4实施例670.3实施例715.9实施例89.0
[0165]
实施例4～8等制备物用于皮肤外用剂的制备。所述皮肤外用剂优选为化妆品组合物，例如化妆水、精华液、乳霜等。所述混合物在皮肤外用剂中的重量百分比为0.08％-1％(w/w)。优选的重量百分比为0.12％-0.64％(w/w)。更优选的重量百分比为0.24％-0.5％(w/w)。最优选的重量百分比为0.32％-0.48％(w/w)。
[0166]
以下是铁皮石斛提取物在皮肤外用剂中的具体应用的实施例，及其这些剂型的配方和制备方法。以下各表中
“‑”
表示无添加。
[0167]
应用例1：面霜的制备
[0168][0169]
应用例2：乳液的制备
[0170][0171][0172]
应用例3：啫喱的制备
[0173][0174]
应用例4：化妆水的制备
[0175][0176]
应用例5：精华液的制备
[0177][0178][0179]
应用例6：面膜的制备
[0180][0181]
应用例7：眼霜的制备
[0182]
[0183][0184]
应用例8：气雾(清洁泡)的制备
[0185][0186]
应用例9：喷雾的制备
[0187][0188]
应用例10：沐浴露的制备
[0189][0190][0191]
应用例11：洗面奶的制备
[0192]