突变型博德特氏菌属菌株及其使用方法与流程

突变型博德特氏菌属菌株及其使用方法
1.本技术是申请日为2017年03月29日，申请号为201780021384.7，发明名称为“突变型博德特氏菌属菌株及其使用方法”的申请的分案申请。
2.相关申请的交叉引用
3.本技术要求于2016年3月29日提交的美国临时专利申请序列号62/314,843的优先权。
4.序列表
5.本技术包含已经以ascii格式电子提交的序列表，并且将其通过引用以其全文特此并入。创建于2017年3月27日的所述ascii副本名称为7056-0073_sl.txt并且大小是2,134字节。
技术领域
6.本发明总体上涉及微生物学、免疫学、过敏和医学领域。更具体地，本发明涉及在百日咳杆菌粘附素(pertactin)上有缺陷的减毒百日咳博德特氏菌活菌株及其在各种疾病环境中作为预防剂和治疗剂的用途。


背景技术：

7.人们早就知道微生物及其组分会影响哺乳动物的免疫系统。感染强毒细菌和病毒会导致严重疾病或死亡。促成这种情况的同时，细菌和病毒的纯化组分也可以通过诱导炎症反应或以其他方式导致免疫系统以不希望的方式表现而引起病理。尽管如此，包括完整细菌、病毒或其部分在内的疫苗不仅被证明是开发用于预防严重感染的药物的最有力工具之一，而且还可以引起其他有益效果。例如，在实验模型中，发现名为bpze1的减毒活百日咳疫苗候选物(参见wo2007104451a1)不仅可提供针对强毒百日咳博德特氏菌的保护，而且还通过抑制对过敏原的超免疫反应来发挥有效的抗过敏和抗哮喘作用(参见wo2013066272a1)。
8.尽管如此，开发安全有效的疫苗仍然具有挑战性，原因有几个。在这些当中，尽管有现代分子生物学技术和我们对微生物学和免疫学的理解的重大进展，但仍然很难生产出足够减毒但不会引起显著病理，同时具有足够的免疫原性来诱导对靶病原体的有效且长期的免疫反应的疫苗产品。在减毒全细胞活细菌疫苗的情况下，达到最佳水平的减毒特别麻烦，因为通过减少毒力因子的量或活性而过度减毒可导致免疫原性差和/或给药后在受试者体内无法存活或复制足够的时间来诱导免疫反应的疫苗。


技术实现要素：

9.本文描述了百日咳杆菌粘附素缺陷型博德特氏菌属菌株的开发，及其在诱导针对病理性博德特氏菌属感染的保护性免疫反应以及治疗或预防呼吸道炎症(如在过敏性哮喘中观察到的呼吸道炎症)中的用途。百日咳杆菌粘附素是博德特氏菌属细菌的外膜蛋白，通过促进对各种细胞的粘附而起到毒力因子的作用。在下文描述的实验中，发现了bpze1的百
日咳杆菌粘附素缺陷型突变体称为bpze1p(根据布达佩斯条约的要求于2016年12月12日以登录号cncm-i-5150保藏在国家微生物菌种保藏中心(collection nationale de cultures de microorganismes，“cncm”)，25，rue du docteur roux，paris cedex 15，75724，法国)，它能够在呼吸道定殖，诱导针对博德特氏菌属的抗体反应，并提供针对过敏性肺病的保护和治疗过敏性肺病。所述发现令人惊讶，因为正如其他人已经证明的，博德特氏菌属需要百日咳杆菌粘附素来抵抗嗜中性粒细胞介导的清除，在这种毒力因子上有缺陷的百日咳博德特氏菌预期会被过快地清除，从而不能诱导保护性免疫反应。参见，inatsuka等人infect.immun.[感染与免疫]2010；78:2901
–
2909。
[0010]
在没有抗百日咳杆菌粘附素抗体的情况下，bpze1p与bpze1一样有效地定殖于肺并与bpze1一样有效地诱导针对百日咳博德特氏菌激发的保护性免疫。在存在抗百日咳杆菌粘附素抗体的情况下，bpze1p在小鼠肺中定殖明显优于bpze1。因此，百日咳杆菌粘附素缺陷型百日咳博德特氏菌菌株(如bpze1p)可能有利于在具有预先存在的高效价百日咳杆菌粘附素抗体的受试者(包括先前用含有百日咳杆菌粘附素的无细胞疫苗接种的那些)体内提供针对呼吸道炎症的保护。
[0011]
因此，本文描述了减少或预防受试者的气道炎症发展的方法，所述方法是通过向受试者的呼吸道给予一定量的包括药学上可接受的载体和足以定殖在受试者的呼吸道的百日咳杆菌粘附素缺陷型博德特氏菌属活细菌的组合物，从而减少或预防受试者的气道炎症发展。在这些方法中，气道炎症可以与以下中的一种或多种相关：气道阻力、受试者肺中的嗜酸性粒细胞浸润和/或受试者肺中增加量的炎性细胞因子。在受试者呼吸道的定殖可导致减少或预防此类气道阻力、嗜酸性粒细胞浸润和/或增加量的炎性细胞因子。
[0012]
本文还描述了组合物，所述组合物包括药学上可接受的载体和能够定殖于受试者的呼吸道并减少或预防受试者的气道炎症发展的百日咳杆菌粘附素缺陷型博德特氏菌属活细菌。
[0013]
在本文所述的方法和组合物中，百日咳杆菌粘附素缺陷型博德特氏菌属活细菌可缺乏编码百日咳杆菌粘附素的功能基因，也在气管细胞毒素(tct)、百日咳毒素(ptx)和/或皮肤坏死毒素(dnt)上有缺陷。百日咳杆菌粘附素缺陷型博德特氏菌属活细菌可以是bpze1p。气道炎症可以通过暴露于过敏原引起，并且受试者可以是被诊断患有哮喘、间质性肺病或过敏性鼻炎的受试者；血清中具有大于10ng/ml的抗百日咳杆菌粘附素抗体的受试者；或先前已经用含有百日咳杆菌粘附素或百日咳杆菌粘附素样抗原的疫苗进行免疫的受试者。
[0014]
如本文所用，“百日咳杆菌粘附素”是由百日咳博德特氏菌及其近亲产生的外表面膜蛋白，所述近亲是如leininger等人,proc.nat’l.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊],1991,88:345-9所述的参与博德特氏菌属细菌与宿主细胞的结合的副百日咳博德特氏菌。此蛋白质中的保守区域(如其乘客(passenger)结构域和自转运蛋白(autotransporter)结构域)直接促进这些生物体的总体毒力和致病性。
[0015]
如本文所用，缩写“ptx”是指百日咳毒素，它是百日咳博德特氏菌的主要毒力因子，诱导代谢变化并改变宿主体内的免疫反应，如saukkonen等人,proc.natl.acad.sci.usa.[美国国家科学院院刊],1992,89:118-122所述。
[0016]
如本文所用，缩写“dnt”是指百日咳皮肤坏死毒素(也称为致死毒素)，它是在百日
咳博德特氏菌中发现的一种毒素，在百日咳博德特氏菌定殖于呼吸道的部位诱导炎症、血管收缩和皮肤坏死病变。参见fukui-miyazaki等人,bmc microbiol.[bmc微生物学]2010,10:247。
[0017]
如本文所用，缩写“tct”是指气管细胞毒素，它是由博德特氏菌属合成的肽聚糖的一种二糖四肽衍生物，诱导白细胞介素-1和一氧化氮合酶的产生，并引起纤毛停滞和对呼吸道上皮细胞的致死作用。参见luker等人,proc.natl.acad.sci.usa.[美国国家科学院院刊],1993,90,2365-2369。
[0018]
如本文所用，“百日咳杆菌粘附素缺陷型”博德特氏菌属菌株是在下文实例部分所述的条件下展现出bpze1中发现的百日咳杆菌粘附素活性的至少小于50％(例如，小于50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％)的菌株、没有展现出可检测到的百日咳杆菌粘附素活性的菌株或者如通过western印迹测定的没有展现出可检测到的百日咳杆菌粘附素表达的菌株。
[0019]
当提及细菌菌株中的毒素或毒力因子时，术语“功能性”意指(i)由所述菌株表达的毒素/毒力因子未突变以消除或至少减少相比于所述毒素/因子的非突变形式的超过50％的酶活性，和/或(ii)表达所述毒素/因子的细菌菌株未经工程化或选择以消除或至少减少相比于衍生了经工程化或选择的菌株的起始菌株的超过50％的该毒素/因子的分子数目。
[0020]
术语“哺乳动物”、“哺乳动物受试者”或“受试者”涵盖哺乳动物类的各种温血脊椎动物中的任何一种，包括人类。
[0021]
除非另外定义，本文中使用的所有技术术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。类似或等同于本文所述的那些的方法和材料可以用于本发明的实践或测试。本文提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用以其全文并入。在发生冲突的情况下，以包括定义的本说明书为准。另外，下文所讨论的具体实施例只为说明而非意在限制。
附图说明
[0022]
图1a是显示用于构建bpze1p的质粒的结构的图。
[0023]
图1b是显示bpze1p构建的另一个图，以及显示prn upg和prn log片段的pcr扩增结果的凝胶照片。
[0024]
图1c是免疫印迹的照片，显示bpze1中存在百日咳杆菌粘附素，但在bpze1p裂解物和上清液中不存在。
[0025]
图2是显示使用bpze1或bpze1p在balb/c小鼠中肺定殖结果的图。
[0026]
图3是显示向小鼠给予bpze1p或bpze1后总igg效价的图。
[0027]
图4a是显示在鼻内用106个百日咳博德特氏菌bpsm菌株活细菌激发的balb/c小鼠中bpze1和bpze1p介导的保护的图。
[0028]
图4b是显示在鼻内用106个百日咳博德特氏菌bpsmp菌株活细菌激发的balb/c小鼠中bpze1和bpze1p介导的保护的图。
[0029]
图4c是显示在鼻内用106个百日咳博德特氏菌b1917菌株活细菌激发的balb/c小鼠中bpze1和bpze1p介导的保护的图。
[0030]
图5是显示在用无细胞百日咳博德特氏菌疫苗(apv)预先免疫的小鼠中bpze1和bpze1p的适应度的图。
[0031]
图6是用bpze1、bpze1p接种或未接种疫苗的过敏性小鼠的气道反应性测定的实验方案图，以及显示测定结果的图。
[0032]
图7a是显示图6中所示实验的过敏性小鼠的支气管肺泡(bal)液中的总气道细胞群浸润的图。
[0033]
图7b是显示图6中所示实验的过敏性小鼠的bal液中细胞的嗜酸性粒细胞百分比的图。
[0034]
图7c是显示图6中所示实验的过敏性小鼠的bal液中细胞的嗜中性粒细胞百分比的图。
[0035]
图7d是显示图6中所示实验的过敏性小鼠的bal液中细胞的淋巴细胞百分比的图。
[0036]
图7e是显示图6中所示实验的过敏性小鼠的bal液中细胞的巨噬细胞百分比的图。
[0037]
图8a是显示针对图6中所示实验的过敏性小鼠的肺叶中测量的总蛋白标准化的il-1α的量的图。
[0038]
图8b是显示针对图6中所示实验的过敏性小鼠的肺叶中测量的总蛋白标准化的il-1β的量的图。
[0039]
图8c是显示针对图6中所示实验的过敏性小鼠的肺叶中测量的总蛋白标准化的il-6的量的图。
[0040]
图8d是显示针对图6中所示实验的过敏性小鼠的肺叶中测量的总蛋白标准化的il-13的量的图。
[0041]
图8e是显示针对图6中所示实验的过敏性小鼠的肺叶中测量的总蛋白标准化的cxcl1的量的图。
[0042]
图8f是显示针对图6中所示实验的过敏性小鼠的肺叶中测量的总蛋白标准化的cxcl9的量的图。
[0043]
图8g是显示针对图6中所示实验的过敏性小鼠的肺叶中测量的总蛋白标准化的cxcl10的量的图。
[0044]
图8h是显示针对图6中所示实验的过敏性小鼠的肺叶中测量的总蛋白标准化的gm-csf的量的图。
[0045]
图9是用bpze1、bpze1p接种或未接种疫苗的过敏性小鼠的治疗模型中气道反应性测定的实验方案图，以及显示测定结果的图。
具体实施方式
[0046]
本文描述了在百日咳杆菌粘附素上有缺陷的博德特氏菌属菌株及其在刺激抗博德特氏菌属免疫反应以及预防和治疗呼吸道炎症中的用途。下文描述的实施例示出了这些方法的代表性实例。尽管如此，从这些实施例的描述来看，基于下文提供的描述可以完成和/或实践本发明的其他方面。
[0047]
一般方法
[0048]
本文描述了涉及常规微生物学、免疫学、分子生物学和医学技术的方法。微生物学方法描述于methods for general and molecular microbiology[普通和分子微生物学方
法](第3版),reddy等人编辑,asm出版社。免疫学方法在本领域中通常是已知的，并且描述于方法论专著中，如current protocols in immunology[免疫学实验指南],coligan等人编辑,john wiley&sons[约翰威利父子公司],纽约。分子生物学技术详细描述于专著中，如molecular cloning:a laboratory manual[分子克隆：实验室手册],第2版,第1-3卷,sambrook等人编辑,cold spring harbor laboratory press[冷泉港实验室出版社],冷泉港,纽约,2001；以及current protocols in molecular biology[分子生物学实验指南],ausubel等人编辑,greene publishing and wiley-interscience[格林出版与威利交叉科学出版社],纽约。药物治疗的一般方法描述于mcphee和papadakis,current medical diagnosis and treatment[当代医疗诊断与治疗]2010,第49版,mcgraw-hill medical[麦格劳-希尔医学出版社],2010；以及fauci等人,harrison’s principles of internal medicine[哈里森内科学原理],第17版,mcgraw-hill professional[麦格劳-希尔专业出版社],2008。
[0049]
百日咳杆菌粘附素缺陷型博德特氏菌属菌株
[0050]
在百日咳杆菌粘附素表达上有缺陷的博德特氏菌属物种(如百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和支气管炎博德特氏菌)(例如，比对应菌株少表达至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％百日咳杆菌粘附素的那些)可用于产生针对博德特氏菌属物种的免疫反应，以及用于治疗和/或预防呼吸道炎症(如在过敏性哮喘中发生的呼吸道炎症)。活的减毒的百日咳杆菌粘附素缺陷型百日咳博德特氏菌和活的减毒的百日咳杆菌粘附素缺陷型副百日咳博德特氏菌优选用于治疗或预防人类受试者的过敏性呼吸道炎症。本文所述的减毒百日咳杆菌粘附素缺陷型博德特氏菌属活菌株可以通过采用本领域已知的方法(如下文实例部分中所述的那些)制备。起始菌株可以是任何合适的博德特氏菌属物种。博德特氏菌属物种的实例包括百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和支气管炎博德特氏菌。百日咳博德特氏菌优选用作预防百日咳感染的疫苗和方法的起始菌株。用作起始菌株的几种合适的博德特氏菌属菌株可从已建立的菌种保藏(例如，弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型菌种保藏中心(american type culture collection))获得，或者可通过已知技术(例如，如aoyama等人,dev.biol.stand[生物学标准化的发展],73:185-92,1991中所述)从天然储库(例如，患有百日咳的患者)中分离。
[0051]
可以通过选择或优选为了稳定性目的的诱变(例如，如下所述的天然prn基因的缺失)而使得表达功能性百日咳杆菌粘附素的博德特氏菌属菌株在此分子或其活性上有缺陷。可替代地，也可从天然来源(例如，被此类菌株感染或定殖的人类受试者或其他哺乳动物)中分离出在百日咳杆菌粘附素上有缺陷的博德特氏菌属物种。因为博德特氏菌属致病菌株的减毒不足可能在受试者体内引起病理性感染，所以优选的是，使用的百日咳杆菌粘附素缺陷型博德特氏菌属菌株也具有较低水平的其他功能性毒力因子。另一方面，为了确保百日咳杆菌粘附素缺陷型博德特氏菌属菌株保留定殖于受试者的能力并对呼吸道炎症发挥保护作用，它不能被过度减毒。可以通过使菌株突变来减少其百日咳杆菌粘附素和以下中的一种或多种(例如，1、2、3、4、5种或更多种)的表达来实现减毒：百日咳毒素(ptx)、皮肤坏死毒素(dnt)、气管细胞毒素(tct)、腺苷酸环化酶(ac)、脂多糖(lps)、丝状血凝素(fha)或任何bvg调节的组分。也可以通过使菌株突变来降低百日咳杆菌粘附素和以下中的一种或多种(例如，1、2、3、4、5种或更多种)的生物活性来实现减毒：百日咳毒素(ptx)、皮肤
坏死毒素(dnt)、气管细胞毒素(tct)、腺苷酸环化酶(ac)、脂多糖(lps)、丝状血凝素(fha)或任何bvg调节的组分。制备此类突变体的方法的实例描述于本文和美国专利号9,119,804中。在下文呈现的实验中，在功能性百日咳杆菌粘附素、功能性ptx、功能性dnt和功能性tct上有缺陷的博德特氏菌属菌株能够定殖于受试者的呼吸道，诱导针对博德特氏菌属的免疫反应，并减少或预防过敏性反应和炎症反应的发展。因此，优选在这四种毒力因子上有缺陷并且可以定殖于受试者并诱导靶向博德特氏菌属菌株的免疫反应和/或减少或预防过敏性反应和炎症反应的发展的博德特氏菌属菌株(如bpze1p)。
[0052]
本领域已知多种用于使感染性细菌菌株减毒的方法。这些方法包括使菌株体外传代直至毒力丧失、非特异性化学诱变随后基于表型进行筛选和选择、以及使用靶向分子生物学技术，如下文实例部分(包括等位基因交换)和methods for general and molecular microbiology[普通和分子微生物学方法](第3版),reddy等人编辑,asm出版社中所述的那些。使用这些方法，编码百日咳杆菌粘附素、ptx和/或dnt的基因可以缺失或突变为酶失活形式(当需要保留毒素的抗原性时，这是优选的)。通过用异源(例如，来自大肠杆菌或另一革兰氏阴性物种)ampg基因替换天然ampg基因或通过使天然ampg基因突变使得它在回收肽聚糖方面是主动的可以显著(例如》99.99％、99.90％、99.8％、99.7％、99.6％、99.5％、99.0％、98％、97％、96％、95％或90％)降低tct产量(与其他物种不同，百日咳博德特氏菌ampg不会主动回收含有tct的肽聚糖)。
[0053]
通过对基因组dna或编码经修饰的菌株的毒素的基因进行测序，可以确认起始菌株的用以降低或去除毒素/毒力因子活性的修饰。southern、northern和/或western印迹也可用于确认靶基因已缺失或靶因子的表达已减少或去除。还可以评价生物活性以确认毒素/毒力因子活性的降低或去除。一旦确认了修饰，就可以通过已知方法(如在下文实例部分中所述的那些)测试经修饰的菌株定殖于受试者并诱导针对博德特氏菌属感染的保护性免疫或者减少或预防过敏性反应和炎症反应的发展的能力。
[0054]
用于调节免疫反应的组合物
[0055]
本文所述的减毒博德特氏菌属活菌株可用于组合物中，所述组合物保护哺乳动物受试者免于发展博德特氏菌属感染(例如百日咳)或减少这种感染的症状。它们还可用于减少或预防受试者的过敏性反应和炎症反应(如哮喘、过敏性鼻炎、间质性肺病、食物过敏、花生过敏、毒液过敏、特应性皮炎、接触性超敏反应和过敏反应)的发展。为了用在治疗或预防组合物中，减毒博德特氏菌属活菌株典型地与药学上可接受的赋形剂一起配制。药学上可接受的赋形剂的实例包括例如缓冲盐水溶液、蒸馏水、乳液(如油/水乳液)、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。
[0056]
疫苗能以单位剂型包装，以方便给予受试者。例如，在1
×
104至1
×
109之间(例如，1
×
104、5
×
104、1
×
105、5
×
105、1
×
106、5
×
106、1
×
107、5
×
107、1
×
108、5
×
108或1
×
109+/-10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80或90％)个所选减毒博德特氏菌属菌株活细菌和任何赋形剂的单剂量可以分开容纳于包装或给药装置中。疫苗可以容纳于给药装置(如注射器、喷雾装置或吹入器)中。
[0057]
制剂/剂量/给药
[0058]
通过将组合物内的细菌沉积在呼吸道或其他粘膜隔室中的任何合适的方法，可以将本文所述的组合物给予哺乳动物受试者(例如，人、人类儿童或新生儿、人类成人、处于发
展百日咳并发症的高风险的人、患有肺病的人、处于免疫抑制或将变得处于免疫抑制的人、以及具有或处于发展呼吸道炎症(如哮喘、过敏性鼻炎或间质性肺病)的高风险的人)。例如，可以通过吸入或鼻内引入(例如，使用吸入器、注射器、吹入器、喷雾装置等)给予组合物。
[0059]
本文所述的百日咳杆菌粘附素缺陷型博德特氏菌属菌株可被配制成用于给予受试者的组合物。将合适数目的活细菌与药学上合适的赋形剂或载体(如磷酸盐缓冲盐水溶液、蒸馏水、乳液(如油/水乳液)、各种类型的润湿剂、无菌溶液等)混合。在一些情况下，疫苗可以被冻干，并且然后在给药前重建。使用与粘膜(特别是鼻、支气管或肺)给药相容的药学上合适的赋形剂或载体对于定殖于呼吸道是优选的。参见作为本领域的标准文本的remington's pharmaceutical sciences[雷明顿药物科学]以及usp/nf。
[0060]
当配制用于粘膜给药时，每个剂量的组合物可以包括足够数目的百日咳杆菌粘附素缺陷型博德特氏菌属活细菌以导致粘膜部位的定殖，例如大约(即，+/-50％)5
×
103至5
×
109个细菌。对于向人类受试者的给药，剂量可包括大约1
×
106、5
×
106、1
×
107、5
×
107、1
×
108、5
×
108、1
×
109、5
×
109或1
×
10
10
个百日咳杆菌粘附素缺陷型博德特氏菌属活细菌。所述剂量可以一次或多次(2、3、4、5、6、7、8次或更多次)给予，间隔为1、2、3、4、5或6天，或1、2、3、4、5或6周，或1、2、3、4、5、6或12个月。通常，给予足量的组合物以导致定殖以及保护性和/或抗炎反应。在诱导的保护性和/或抗炎反应减弱后(例如，在受试者恢复患有呼吸道炎症的症状之后)给予额外的量。
[0061]
可给予含有百日咳杆菌粘附素缺陷型博德特氏菌属活细菌的组合物的受试者可包括任何能够被所选百日咳杆菌粘附素缺陷型博德特氏菌属活细菌菌株定殖的受试者。例如，受试者可以是哺乳动物，如人。患有呼吸道炎症或处于发展呼吸道炎症的高风险的人类受试者(如患有过敏性哮喘或过敏性鼻炎或者倾向于发展过敏性哮喘或过敏性鼻炎的那些)是组合物的优选接受者。虽然组合物可以用于受试者中而不管其抗百日咳杆菌粘附素抗体的效价，但所述组合物可以用于具有可测量效价(例如，大于10、20、50、100、200或500ng/ml血清)抗百日咳杆菌粘附素抗体的那些和先前已经用含有百日咳杆菌粘附素或百日咳杆菌粘附素样抗原的疫苗免疫的那些，因为百日咳杆菌粘附素缺陷型博德特氏菌属细菌菌株不经受靶向百日咳杆菌粘附素的免疫反应。
[0062]
组合物在抑制呼吸道炎症中的有效性可通过已知方法评估，例如测量从呼吸道取的液体(例如，支气管肺泡灌洗液)中炎性细胞的数目、ige效价、促炎性细胞因子/趋化因子(如嗜酸性粒细胞趋化因子、gm-csf、ifnγ、il-4、il-5、il-8、il-10、il-12、il-13、il-17a、il-17f、il-18和tnfα)或临床参数，如肺活量测定或呼吸困难、咳嗽、喘息或呼吸能力的水平。这些参数中的任何一个或多个的改进(与未接受组合物的受试者相比改进至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)指示组合物是有效的。过敏性呼吸道炎症的动物模型也可用于评估组合物的有效性，参见例如美国专利号8,986,709。
[0063]
实例
[0064]
实例1-百日咳博德特氏菌的百日咳杆菌粘附素缺陷型菌株的构建和表征。
[0065]
在本研究中使用大肠杆菌dh5α、sm10和百日咳博德特氏菌bpze1、bpsm(menozzi等人,infect immun[感染与免疫]1994；62:769-778)和b1917(bart等人genome announc[基因组公告]2014；2(6))。将博德特氏菌属菌株在37℃下在补充有1％甘油和10％去纤维蛋白
的绵羊血的bordet-gengou琼脂(bg)上培养。生长后，通过刮擦平板收获细菌，并以所需密度重悬于磷酸盐缓冲盐水(pbs)中。对于液体培养，使博德特氏菌属菌株在37℃下在含有1g/l七(2,6-二-o-甲基)β-环糊精(西格玛公司(sigma))的改良stainer-scholte培养基(imaizumi等人infect immun[感染与免疫]1983；41:1138-1143)中生长。使用于克隆程序的大肠杆菌菌株在lb肉汤或lb琼脂板中生长。需要时，以100μg/ml使用链霉素(sm)，以10μg/ml使用庆大霉素(gm)，并以100μg/ml使用氨苄青霉素(amp)。
[0066]
为了使bpze1中编码百日咳杆菌粘附素的基因prn缺失，将prn基因下游的739-bp片段(prn lo)和prn基因上游的759-bp片段(prn up)克隆到pss4940中，以通过同源重组在bpze1和bpsm基因组中引入prn缺失。参见图1a和1b，使用prn_ko_fw(atcctcaagcaagactgcgagctg)(seq id no:1))和ol_prn_ko_rv(ggggatagaccctcctcgcttggatgccaggtggagagca)(seq id no:2))，以及ol_prn_ko_fw(tgctctccacctggcatccaagcgaggagggtctatcccc)(seq id no:3))和prn_ko_rv(ccatcatcctgtacgaccgcct)(seq id no:4))对上游和下游prn侧翼区域进行pcr扩增。然后使用prn_ko_fw和prn_ko_rv作为引物，将这些片段用作pcr延伸的模板。将得到的片段(含有prn缺失)插入topo载体(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific))中，并且然后作为kpni-noti片段切下。将切下的kpni-noti片段插入kpni和noti消化的pss4940，一种pss4245(inatsuka等人infectimmun[感染与免疫]2010；78 2901-2909)衍生物中。将得到的质粒转化到大肠杆菌sm10中，然后将其与bpze1缀合。在两个连续的同源重组事件之后，如在其他地方所述(mielcarek等人,plos pathog[plos病原体]2006；2:e65)，参见图1b，使用pcr来通过扩增覆盖所述构建的侧翼区域来确认整个prn基因的缺失，针对5’区域使用prnko_up(ttcttgcgcgaacagatcaaac)(seq id no:5))-prnkoin_uprv(ctgctggtcatcggcgaagt)(seq id no:6))且针对3’区域使用prnkoin_lofw(cgcccattcttccctgttcc)(seq id no:7))-prnko_lo(gaacaggaactggaacaggcg)(seq id no:8))。选择携带prn缺失的菌株并命名为bpze1p。使用相同的策略来构建百日咳杆菌粘附素缺陷型bpsm突变体，命名为bpsmp。
[0067]
通过bpze1和bpze1p裂解物和上清液的免疫印迹来测试百日咳杆菌粘附素的存在，针对条带的校正尺寸使用纯化的prn(利斯特生物实验室公司(list biological laboratories))作为对照。对于蛋白质提取，将bpze1和bpze1p菌株铺到bg血琼脂上并在37℃下孵育48小时。生长后，将细菌从平板上刮下，重悬于10ml stainer-scholte培养基中，并在37℃下生长4天。然后通过离心收获细菌。将上清液回收并如前所述用三氯乙酸(tca)处理(solans等人,plos pathog[plos病原体]2014；10:e1004183)用于蛋白质浓缩。将细菌沉淀重悬于补充有不含edta的蛋白酶抑制剂混合物(罗氏公司(roche))的pbs中，并用弗氏压力细胞(french pressure cell)裂解。通过以15,000x g离心30分钟除去细菌碎片，并且回收上清液用于免疫印迹。通过12％sds-page分离蛋白质，并且然后使用criterion
tm
细胞系统(伯乐公司(bio-rad))转移到硝酸纤维素膜上。用pbs 0.01％tween 20中的5％w/v脱脂奶粉封闭30分钟后，将膜用抗百日咳杆菌粘附素单克隆抗体以1:1,000稀释度进行孵育。然后以1:10,000稀释度加入山羊抗小鼠-hrp(艾碧康公司(abcam))，并使用化学发光底物(通用医疗公司(ge healthcare))显现印迹。如图1c所示，在bpze1的上清液中检测到与纯化的百日咳杆菌粘附素共迁移的抗百日咳杆菌粘附素抗体反应蛋白，但在bpze1p的上清液中没有检测到。在bpze1或bpze1p的细菌细胞裂解物中未检测到此蛋白质。
[0068]
实例2-bpze1p与bpze1一样定殖于小鼠。
[0069]
如前所述(mielcarek等人，同上)，用含有106个活细菌的20μl pbs鼻内接种18只6周龄小鼠的组。在指定的时间点(3小时、3天、7天、14天、21天和28天)，处死每组3只小鼠，并收获肺且均质化以测量集落形成单位(cfu)的总数。使用事后比较邦费罗尼(bonferroni)检验(95％置信区间)，通过双因素anova检验进行统计分析。参见图2，bpze1和bpze1p同样良好地定殖于动物中。两种菌株在疫苗接种后3天展现出增殖峰，并且定殖持续4周。在这些菌株之间没有观察到它们定殖于小鼠肺的能力上有统计学上显著的差异。
[0070]
实例3-bpze1p与bpze1一样具有免疫原性并且针对强毒百日咳博德特氏菌激发具有保护作用。
[0071]
通过鼻疫苗接种后小鼠免疫血清的抗体滴定来测量bpze1p诱导的与bpze1相比的免疫。用105个活bpze1或bpze1p鼻内接种8只小鼠的组。4周后，将小鼠放血，并针对总bpsm裂解物测量总igg效价。将血液以5,000x g离心5分钟以将血清与细胞分离。如前所述(mielcarek等人，同上)，使用酶联免疫吸附测定(elisa)估计针对百日咳博德特氏菌的抗体效价，按每孔1μg总蛋白使用总百日咳博德特氏菌bpsm裂解物。使用graphpad prism软件进行统计分析。如图3所示，bpze1和bpze1p接种的小鼠展现出比初试对照小鼠高得多的抗体效价。检测到bpze1和bpze1p接种的小鼠之间的抗体效价没有显著差异。
[0072]
通过在激发后7天测量肺中的cfu计数，并将初试组与接种组进行比较，在次优保护方案中测试bpze1p与bpze1相比的保护效力。用含有105个活bpze1或bpze1p的20μl pbs鼻内接种8只6周龄小鼠的组，或者未接种疫苗。4周后，用含有106个活bpsm、bpsmp或b1917的20μl pbs鼻内激发所有小鼠。激发后3小时，每组处死3只小鼠，并且收获肺且均质化以进行cfu计数。在激发后7天将每组剩余的5只小鼠处死以进行cfu计数。感染后3小时，将3只小鼠安乐死，并收获它们的肺以确定激发后不久的cfu计数。感染后7天，将剩余的5只小鼠安乐死，收获它们的肺，并测量cfu计数。使用事后邦费罗尼比较检验(95％置信区间)，应用参数双因素anova检验进行统计分析。*，p《0.005；**，p《0.001；***，p《0.0001。如图4a-图4c所示，用任一菌株进行疫苗接种同样良好地提供针对用bpsm、bpsmp和b1917进行的激发的保护。这些结果显示，prn的缺失不影响减毒活疫苗的保护能力-无论针对实验室菌株bpsm、其百日咳杆菌粘附素缺陷型衍生物bpsmp还是临床分离株b1917。
[0073]
实例4-bpze1p增加apv接种小鼠中的肺疫苗吸收。
[0074]
研究了bpze1p定殖于具有针对百日咳杆菌粘附素的预先存在的抗体的小鼠的肺的能力。用1/5人类剂量的无细胞百日咳疫苗(apv；infanrix，gsk；含有灭活的百日咳毒素、丝状血凝素和百日咳杆菌粘附素)皮下接种8只6周龄小鼠的组。4周后，用相同剂量的apv加强免疫小鼠。加强免疫后4周，用106个bpze1或bpze1p鼻内感染小鼠。感染后3小时，将3只小鼠安乐死，并收获肺以确定cfu计数。感染后7天，将剩余的5只小鼠安乐死，收获肺，并测量cfu计数。使用事后邦费罗尼比较检验(95％置信区间)，应用参数双因素anova检验进行统计分析。***，p《0.0001。参见图5，在给药后3小时，在两种菌株之间未看到定殖的显著差异。相比之下，接种后7天，bpze1p在肺中定殖明显优于bpze1。感染bpze1p的小鼠在给药后7天在肺中具有几乎104cfu，而给予bpze1的小鼠肺中的cfu计数达到102cfu。这些数据显示，prn基因的缺失改进了用含有百日咳杆菌粘附素的apv预免疫的小鼠的bpze1肺吸收。
[0075]
实例5-bpze1p和bpze1同样良好地提供针对过敏性气道炎症的保护。
[0076]
如在图6所示的方案中所述，在过敏性小鼠中研究了bpze1p接种对气道反应性的影响。用含有106个活bpze1或bpze1p的20μl pbs鼻内接种4周龄小鼠的组，或者未接种疫苗。4周后，用20μl屋尘螨(hdm；stallergenes s.a.)的5反应性指数(ir)粉尘螨提取物(derf 5ir)或20μlpbs(作为对照)鼻内致敏小鼠。10天后，将小鼠每天用20μl derf 5ir或pbs鼻内激发5天，并且两天后，将小鼠麻醉并气管内插管，使用flexivent装置进行机械通气。然后将小鼠暴露于增加浓度的雾化乙酰甲胆碱(pbs中0-50mg/ml)(西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich))以使用体积描记术测定其呼吸气道中的阻力。使用事后邦费罗尼比较检验(95％置信区间)，通过应用参数双因素anova检验进行统计分析。***，p《0.0001；**，p《0.001；*，p《0.005。在图6中，derf 5ir和bpze1+derf5ir之间的比较用实线表示，并且derf 5ir和bpze1p+derf 5ir之间的比较用虚线表示。在用6、12和25mg/ml的乙酰甲胆碱处理后，与未接种疫苗的小鼠相比，bpze1和bpze1p接种的小鼠在其气道中呈现显著较少的阻力。接种疫苗的小鼠的阻力与pbs对照组的阻力相当，pbs对照组在整个实验过程中未致敏，也未激发。
[0077]
实例6-肺细胞浸润的测量和细胞因子谱。
[0078]
评估图6中所示和上文刚刚讨论的实验的过敏性小鼠中的气道细胞群浸润。在体积描记术测量后，收集支气管肺泡灌洗(bal)液以测量气道中的细胞浸润。通过在4℃下以1,200rpm离心5分钟收获来自bal液的细胞，重悬于pbs中用于使用shandon cytospin 4(赛默飞世尔科技公司)进行细胞计数，并用may gr
ü
nwald giemsa染色用于细胞类型计数。在小鼠的bal液中测量总细胞数(图7a)，并计算嗜酸性粒细胞(图7b)、嗜中性粒细胞(图7c)、淋巴细胞(图7d)和巨噬细胞(图7e)的百分比。使用事后邦费罗尼比较检验(95％置信区间)，通过应用参数单因素anova检验进行统计分析。***，p《0.0001；*，p《0.005。与未接种疫苗的小鼠相比，bpze1或bpze1p疫苗接种显著减少过敏原暴露和激发后气道中总细胞的募集(图7a)。这种减少基本上反映了接种疫苗的小鼠中嗜酸性粒细胞募集的减少(图7b)，而接种疫苗和未接种疫苗的小鼠之间嗜中性粒细胞或淋巴细胞的百分比没有显著变化(图7c和d)。在用bpze1p接种的小鼠中观察到巨噬细胞百分比的小但显著的增加(图7e)。
[0079]
在bal之后，收获右肺叶并直接在液氮中冷冻用于蛋白质提取。将肺叶重悬于1ml裂解缓冲液，即含0.5％nonidet p40和蛋白酶抑制剂混合物的pbs中，并使用t-18ultra-turrax在4℃下均质化。将样品离心，并收集上清液用于依照制造商的说明，使用pierce
tm bca蛋白质测定(赛默飞世尔科技公司)进行总蛋白定量，并使用cytokine 20-plexmouse panel(invitrogen
tm
，赛默飞世尔科技公司)进行细胞因子和趋化因子测量。参见图8a-图8h，细胞因子水平表示为针对肺叶中测量的总蛋白的细胞因子/趋化因子定量的标准化。使用事后邦费罗尼比较检验(95％置信区间)，通过应用参数单因素anova检验进行统计分析。**，p《0.001。*，p《0.005。
[0080]
如图8a-图8h所示，与未经处理的小鼠相比，hdm(derf 5ir)处理的小鼠在肺中产生显著增加水平的il1α和il1β。在hdm致敏之前用bpze1或bpze1p接种显著降低了这些水平(图8a和图8b)。对于il6和il13观察到类似的趋势，尽管接种疫苗和未接种疫苗的小鼠之间的差异没有达到统计学显著性(图8c和图8d)。与仅用hdm处理的小鼠相比，在接种疫苗的小
鼠中观察到显著较低水平的诱导cxcl1(kc)、cxcl9(mig)、cxcl10(ip-10)和gm-csf(图8f-图8h)。总体来说，接种bpze1的小鼠和接种bpze1p的小鼠之间没有统计学差异。
[0081]
实例7-与未接种疫苗的那些相比，用bpze1或bpze1p接种预致敏受试者呈现显著较低水平的气道阻力。如图9的图所示，将5周龄小鼠的组用derf 5ir鼻内致敏或给予pbs，并且然后用106个bpze1或bpze1p接种，或者未接种疫苗。9天后，用derf 5ir或pbs鼻内激发小鼠5天。在最后一次激发后两天，将小鼠麻醉，并如上所述通过体积描记术测量它们在呼吸气道中的阻力。使用事后邦费罗尼比较检验(95％置信区间)，通过应用参数双因素anova检验进行统计分析。***，p《0.0001。**，p《0.001。derf 5ir和bpze1+derf 5ir之间的比较由实线表示，并且derf 5ir和bpze1p+derf 5ir之间的比较由虚线表示。与未接种疫苗的那些相比，接种bpze1或bpze1p的小鼠呈现显著较低水平的气道阻力。另外，接种疫苗的小鼠的气道阻力与对照组的气道阻力无法区分，对照组未用derf 5ir致敏或激发。
[0082]
其他实施例
[0083]
应理解，虽然已经结合其具体实施方式对本发明进行了描述，但前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其他方面、优点以及修改都在以下权利要求书的范围内。
[0084]
本技术提供了以下内容：
[0085]
1).一种减少或预防受试者的气道炎症发展的方法，所述方法包括向所述受试者的呼吸道给予一定量的组合物的步骤，所述组合物包含药学上可接受的载体和足以定殖在所述受试者的呼吸道的减毒百日咳杆菌粘附素缺陷型博德特氏菌属活细菌，其中在所述受试者的呼吸道的定殖导致减少或预防所述受试者的气道炎症发展。
[0086]
2).如1)所述的方法，其中所述气道炎症的特征在于气道阻力，并且在所述受试者的呼吸道的定殖导致减少或预防所述受试者的气道阻力的发展。
[0087]
3).如1)所述的方法，其中所述气道炎症的特征在于所述受试者的肺中的嗜酸性粒细胞浸润，并且在所述受试者的呼吸道的定殖导致减少或预防嗜酸性粒细胞浸润。
[0088]
4).如1)所述的方法，其中所述气道炎症的特征在于所述受试者的肺中的增加量的炎性细胞因子，并且在所述受试者的呼吸道的定殖导致减少或预防增加量的炎性细胞因子的发展。
[0089]
5).如1)所述的方法，其中所述减毒百日咳杆菌粘附素缺陷型博德特氏菌属活细菌缺乏编码百日咳杆菌粘附素的功能基因。
[0090]
6).如1)所述的方法，其中所述减毒百日咳杆菌粘附素缺陷型博德特氏菌属活细菌在至少一种选自下组的毒力因子上有缺陷，该组由以下组成：气管细胞毒素(tct)、百日咳毒素(ptx)和皮肤坏死毒素(dnt)。
[0091]
7).如1)所述的方法，其中所述减毒百日咳杆菌粘附素缺陷型博德特氏菌属活细菌在至少两种选自下组的毒力因子上有缺陷，该组由以下组成：气管细胞毒素(tct)、百日咳毒素(ptx)和皮肤坏死毒素(dnt)。
[0092]
8).如1)所述的方法，其中所述减毒百日咳杆菌粘附素缺陷型博德特氏菌属活细菌在气管细胞毒素(tct)、百日咳毒素(ptx)和皮肤坏死毒素(dnt)上有缺陷。
[0093]
9).如1)所述的方法，其中所述减毒百日咳杆菌粘附素缺陷型博德特氏菌属活细菌是以登录号cncm-i-5150保藏在国家微生物菌种保藏中心的bpze1p菌株。
[0094]
10).如1)所述的方法，其中所述气道炎症是由暴露于过敏原引起的。
[0095]
11).如1)所述的方法，其中所述受试者已被诊断患有哮喘。
[0096]
12).如1)所述的方法，其中所述受试者已被诊断患有间质性肺病。
[0097]
13).如1)所述的方法，其中所述受试者已被诊断患有过敏性鼻炎。
[0098]
14).如1)所述的方法，其中所述受试者在其血清中具有大于10ng/ml的抗百日咳杆菌粘附素抗体。
[0099]
15).如1)所述的方法，其中所述受试者先前已经用含有百日咳杆菌粘附素或百日咳杆菌粘附素样抗原的疫苗进行免疫。
[0100]
16).一种组合物，所述组合物包含药学上可接受的载体和能够定殖于受试者的呼吸道并减少或预防所述受试者的气道炎症发展的减毒百日咳杆菌粘附素缺陷型博德特氏菌属活细菌。
[0101]
17).如16)所述的组合物，其中所述博德特氏菌属细菌缺乏编码百日咳杆菌粘附素的功能基因。
[0102]
18).如16)所述的组合物，其中所述减毒百日咳杆菌粘附素缺陷型博德特氏菌属活细菌在至少一种选自下组的毒力因子上有缺陷，该组由以下组成：气管细胞毒素(tct)、百日咳毒素(ptx)和皮肤坏死毒素(dnt)。
[0103]
19).如16)所述的组合物，其中所述减毒百日咳杆菌粘附素缺陷型博德特氏菌属活细菌在气管细胞毒素(tct)、百日咳毒素(ptx)和皮肤坏死毒素(dnt)上有缺陷。
[0104]
20).以登录号cncm-i-5150保藏在国家微生物菌种保藏中心的bpze1p菌株。