植物乳杆菌后生元及其在改变肠道微生态和降低胆固醇的产品中的应用的制作方法

1.本发明涉及微生物领域，特别是涉及植物乳杆菌后生元及其在改变肠道微生态和降低胆固醇的产品中的应用。


背景技术：

2.人体内的胆固醇水平对正常的细胞和功能起着重要的作用，过高会造成脂质代谢紊乱，增加引发心血管疾病、非酒精性脂肪肝炎和肥胖等疾病的风险。目前常见的降胆固醇药物包括他汀类和贝特类药物等，但是长期服用会引起明显的副作用，如增加横纹肌溶解症的风险、过敏反应综合症和药期认知障碍等。
3.近年来，益生菌的降胆固醇作用引起了研究者们的关注，相对于药物治疗，其高效、安全且经济的特点更受消费者的青睐。目前对益生菌降胆固醇机制的探讨主要分为非代谢途径和代谢途径，代谢途径包括益生菌调节肠道菌群，并且信号通路和肠道微生物之间的交互作用也具有降胆固醇的效果。肠道菌群的变化可能影响宿主的能量稳态、全身炎症、脂质代谢、葡萄糖平衡和胰岛素敏感性，益生菌的摄入能够显著改善肠道菌群的丰富度和多样性，尤其是厚壁菌门和拟杆菌门的比例。
4.虽然目前对益生菌降胆固醇机制研究的很多，但都是以活菌为对象进行预防胆固醇升高方向的研究，对于热灭活或裂解菌的益生菌在治疗方向降胆固醇效果鲜有研究。 2021年，非营利组织国际益生菌和益生元科学协会(isapp)将后生元定义为“一种对宿主健康有益的无生命微生物和/或其成分的制剂”，这是全球第一个权威组织对后生元明确定义，开启了后生元研究及产业化的新篇章。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供植物乳杆菌后生元及其在改变肠道微生态和降低胆固醇的产品中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，热灭活的植物乳杆或者植物乳杆菌裂解菌能够降低胆固醇血症小鼠的胆固醇含量，以及调节肠道微生态及粪便中的代谢物。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供植物乳杆菌后生元在改变肠道微生态和降低胆固醇的产品中的应用，所述植物乳杆菌的保藏编号为cgmcc no.18205。
8.优选的是，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌h6热灭活菌或者植物乳杆菌h6裂解菌。
9.优选的是，热灭活条件为：90℃，30min。
10.优选的是，所述产品包括药物和食品。
11.本发明还提供一种调节肠道微生态和降低高胆固醇的后生元，其包括所述的植物乳杆菌h6。
12.优选的是，还包括药学上可接受的辅料。
13.本发明公开了以下技术效果：
14.本发明系统研究植物乳杆菌后生元对高胆固醇小鼠的治疗作用，评估了植物乳杆菌h6热灭活菌或者植物乳杆菌h6裂解菌调节胆固醇及其对肠道菌群的影响，结果发现该菌可以有效改善小鼠高胆固醇饮食引起的高胆固醇血症，改善小鼠粪便菌群结构和粪便代谢物，这为益生菌的产业化发展及治疗胆固醇疾病提供理论依据。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
16.图1为ih6对小鼠的血清和肝脏理化指标的影响；a-b：灌胃期间各组小鼠进食量及体重变化；c：12周后各组小鼠肝脏重量；d-e：各组小鼠血清和肝脏tc含量；f：各组小鼠血清alt含量；其中，
*
为sim、ih6与hcd_nd的组间比较；
17.图2为ih6对高胆固醇血症小鼠的肝脏变性的影响；a：12周后各组小鼠肝脏的代表性照片；b、c：用h&e和油红o染色的肝脏组织学切片的显微照片(bar＝100μm)； d：ucp1在各组小鼠肝脏组织中表达的显微照片(bar＝100μm)；
18.图3为ih6对高胆固醇血症小鼠胰岛素耐量(itt)的影响；a、b：itt试验，禁食 4小时的小鼠注射胰岛素(0.75u/kg)，然后在0、15、30、60和120分钟测定血糖含量，计算各组auc值；其中，
*
为sim、ih6与hcd_nd的组间比较，p＜0.05；
19.图4a为检测ih6对高胆固醇血症小鼠肠道菌群结构的影响的等级多度分布曲线 (rank-abundance curves)；
20.图4b为评估ih6对高胆固醇血症小鼠肠道菌群结构的影响的α多样性指数ace、 shannon、shannoneven的稀释性曲线；
21.图4c为评估ih6对高胆固醇血症小鼠肠道菌群结构的α多样性指数ace、shannon、 shannoneven；
22.图4d为评估ih6对高胆固醇血症小鼠样本分组的anosim(相似性分析)；
23.图4e为基于otu评估ih6对高胆固醇血症小鼠肠道菌群结构的主坐标分析(pcoa)；
24.图4f为评估ih6对高胆固醇血症小鼠肠道菌群结构的otu水平的venn分析；
25.图4g为评估ih6对高胆固醇血症小鼠肠道菌群结构的前100个otu相对丰度的 heatmap分析；
26.图4h为门水平上评估ih6对高胆固醇血症小鼠主要肠道微生物群的相对丰度变化及firmicutes和bacteroidota的比率；
27.图4i为评估ih6对多级物种差异判别分析(lefse)；
28.图4j为根据lda分析a/i/sh6组的肠道微生物菌群组成；
29.图4k为hcd_nd与ih6的组间差异显著性检验(p≤0.05标记为
*
，p≤0.01标记为
**
，p≤0.001标记为
***
)；
30.图5a为基于偏最小二乘法判别分析(pls-da)ih6对高胆固醇血症小鼠肠道代谢物β多样性的影响；
31.图5b-d分别为通过使用超高效液相色谱串联飞行时间质谱uplc-tripletof的非
的非靶向代谢组学检测vitamins and cofactors、amino acids及bile acids的相对含量；
52.图11e为hcd_nd与sh6组差异lipids的聚类热图和vip条形图；
53.图11f为hcd_nd与sh6组差异代谢物的kegg pathway富集分析；(p≤0.05标记为*，p≤0.01标记为**，p≤0.001标记为***)；
54.图12a为前10种最丰富细菌与sh6高胆固醇血症理化指标的pearson相关性分析；
55.图12b-e分别为sh6微生物群落与粪便代谢物vitamins and cofactors、aminoacids、bile acids、lipids的rda分析；(p≤0.05标记为*，p≤0.01标记为**，p ≤0.001标记为***)。
具体实施方式
56.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
57.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
58.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
59.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
60.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
61.实施例1
62.一、实验方法
63.1、材料与方法
64.1.1材料与试剂
65.辛伐他汀购自山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司；胰岛素注射液购自江苏万邦生化医药集团有限责任公司；血糖仪、血糖条(ga-3型)购自三诺生物传感股份有限公司；总胆固醇(t-cho)、谷丙转氨酶(alt)测试盒购自南京建成生物工程研究所。
66.1.2ih6菌株的制备
67.植物乳杆菌h6(cgmcc 18205，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心)分离自中国黑龙江省传统发酵食品粘面子，体外试验表明h6具有强的胆固醇清除能力，已获得中国发明专利(zl 201910955071.x)。动物试验之前，将菌株活化2次。将活化后的菌株按2％接种mrs培养基中，37℃厌氧培养24h。培养后将菌悬液用生理盐水洗涤2次，并调节菌悬液
浓度为1
×
109cfu/ml，采用如下方法进行处理：
68.(1)水浴锅90℃、30min制备热灭活菌株(ih6)，平板培养表明无活菌生长。
69.(2)菌悬液用超声细胞破碎机工作5s，间歇9s，工作60min制备菌裂解物(sh6) (pan et al.,2017)，平板培养表明无活菌生长
70.1.3动物试验及分组
71.40只雄性c57bl/6小鼠(5周龄，体重18-19g)spf级，购自沈阳长生生物有限公司。进行1周的适应性培养，室温(25℃
±
1℃)光照12h黑暗12h循环下将小鼠进行培养。
72.在高胆固醇饲料(ashf4，高胆固醇鼠粮，戴茨生物科技有限公司)喂养4周后，将nd和建模组小鼠安乐死后取血清及肝脏测量tc和tg含量，将建模组血脂水平为 nd组血脂水平的2-3倍为高胆固醇血症模型建立成功，进行后续试验。
73.从第5周至第12周，除了nd组，其余组均喂食普通饲料(小鼠生长繁殖饲料，北京科澳协力饲料有限公司)，同时每天灌胃ih6(1
×
109cfu/ml)和辛伐他汀3.80(mg/kgbw)或者每天灌胃是sh6(1
×
109cfu/ml)和辛伐他汀3.80(mg/kg bw)，对照组(nd 组、hcd_nd组)每天灌胃等量的0.9％nacl。
74.在小鼠处死前一天无菌条件下收集小鼠粪便，液氮保存，转移至-80℃保存备用。在12周的动物试验之后，乙醚麻醉小鼠，通过颈部分离处死小鼠，收集血液，在4℃下于3000g离心15min获得血清，储存在-20℃备用；收集肝脏并称重，部分4％多聚甲醛固定，部分液氮保存并转移至-80℃保存备用。
75.1.4胰岛素耐受量(itt)测量
76.在ih6或sh6处理的第8周，小鼠禁食过夜，腹腔注射胰岛素(0.75g/kg bw)，在0、15、30、60、120min后测量鼠尾血血糖浓度，并计算每组曲线下面积。
77.1.5生理生化分析
78.按照试剂盒使用说明书检测小鼠血清总tc、alt含量以及肝脏总tc含量。
79.1.6肝脏组织病理分析
80.he染色，固定后的肝脏石蜡切片脱蜡，切片入苏木素染液染3min，流水冲洗，切片依次入85％、95％的梯度酒精脱水各5min，入伊红染液中染色5min，中性树胶封片后显微镜200倍图像采集。
81.油红o染色，新鲜冰冻切片固定后油红染色，取出切片，停留3s后依次浸入两缸60％异丙醇分化，各3s、5s，之后进行苏木素复染3min，甘油明胶封片剂封片后显微镜200倍图像采集。
82.免疫组化染色，肝脏石蜡切片脱蜡进行抗原修复，放入3％双氧水溶液阻断内源性过氧化物酶，滴加3％bsa室温封闭30min，加一抗4℃孵育过夜，加二抗室温孵育50min，然后滴加新鲜配制的dab显色液，显微镜下控制显色时间，苏木素复染3min左右复染细胞核，最后中性树胶封片显微镜200倍图像采集。
83.1.7 16s rrna基因测序
84.根据soil dna kit(omega bio-tek,norcross,ga,u.s.)说明书进行微生物群落总dna抽提。使用338f(5
’‑
actcctacgggaggcagcag-3’)和 806r(5
’‑
ggactachvgggtwtctaat-3’)对16s rrna基因v3-v4可变区进行pcr 扩增。将同一样本的pcr产物混合后使用2％琼脂糖凝胶回收pcr产物，利用axyprepdna gel extraction kit
(axygen biosciences,union city,ca,usa)进行回收产物纯化， 2％琼脂糖凝胶电泳检测，并用quantus
tm
fluorometer(promega,usa)对回收产物进行检测定量。利用illumina公司的miseq pe300/novaseq pe250平台进行测序(shanghaimajorbio bio-pharm technology co.,ltd)。使用fastp软件 (https://github.com/opengene/fastp，version 0.20.0)对原始测序序列进行质控，使用 flash软件(http://www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.7)进行拼接。使用 uparse(edgar,2013)软件(http://drive5.com/uparse/，version 7.1)，根据97％的相似度对序列进行otu聚类并剔除嵌合体。数据在美吉生信云计算平台 (http://cloud.majorbio.com/)上进行分析。
85.1.8粪便代谢组学分析
86.基于超高效液相色谱串联飞行时间质谱uplc-tripletof方法非靶向代谢组学分析(shanghai majorbio bio-pharm technology co.,ltd)。将50mg小鼠的粪便样品放于400μl提取液(乙腈：甲醇＝1：1)，涡旋混匀30s后，低温超声提取30min(5℃， 40khz)，静置于-20℃，30min，在4℃，13000g离心15min，取上清液，氮气吹干， 120μl复溶液(乙腈：水＝1：1)复溶，低温超声萃取5min(5℃，40khz)，在4℃， 13000g离心5min，取上清液上机分析。10μl样本经beh c18色谱柱(100mm
×
2.1 mm i.d.,1.8μm)分离后进入质谱检测。分离梯度：0-3min，流动相a(含0.1％甲酸的水溶液)从线性95％降至80％，流动相b(含0.1％甲酸的1：1乙腈/异丙醇溶液) 线性从5％升至20％；3-9min，流动相a线性从80％降至5％，流动相b线性从20％升至 95％；9-13min，流动相a线性维持5％，流动相b线性维持95％；13.0-13.1min，流动相a线性从5％升至95％，流动相b线性从95％降至5％；13.1-16min，流动相a线性维持95％，流动相b线性维持5％。流速为0.40ml/min，柱温为40℃。样品质谱信号采集采用正负离子扫描模式，质量扫描范围m/z：50-1000。离子喷雾电压，正离子电压5000v，负离子电压4000v，去簇电压80v，喷雾气50psi，辅助加热气50psi，气帘气30psi，离子源加热温度500℃，20-60v循环碰撞能。上机完成之后，lc-ms原始数据导入代谢组学处理软件progenesis qi(waters corporation，milford，usa) 进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐，最终得到一个保留时间、质荷比和峰强度的数据矩阵，数据矩阵用80％规则来去除缺失值，即保留至少一组样品中非零值80％以上的变量，再进行填补空缺值(原始矩阵中最小值填补空缺值)，为减小样品制备及仪器不稳定带来的误差，用总和归一化法对样本质谱峰的响应强度进行归一化，得到归一化后的数据矩阵。ms和msms质谱信息与代谢公共数据库hmdb(http： //www.hmdb.ca/)和metlin(https：//metlin.scripps.edu/)数据库进行匹配，得到代谢物信息。预处理的数据在美吉生信云计算平台(http://cloud.majorbio.com/)上进行分析。
87.血清肝脏脂质相关指标数据使用graphpad prism 8.0进行统计学分析，采用非参数t检验进行多组样本间的差异显著性分析，p＜0.05表示差异具有显著性。结果以平均值
±
标准差表示，并用graphpad prism 8.0作图。
88.二、结果与分析
89.1、ih6对小鼠各项指标的影响
90.1.1 ih6对小鼠的血清和肝脏理化指标的影响
91.在喂养的过程中发现，ih6组的进食量与hcd_nd组有显著差异(p＜0.05，图1a)，但是各组间小鼠的体重没有显著性的差异(图1b)，这可能是摄入ih6后，增加了小鼠的食欲，
但同时能量消耗也增加。与hcd_nd相比，在经过ih6灌胃后，小鼠脂代谢相关的理化指标得到了改善(图1c-f)，ih6组小鼠的肝脏重量下降了22.10％，血清 tc也显著下降(p＜0.05)，肝脏tc下降了24.49％(p＜0.05)，ih6可显著降低小鼠血清 alt含量，下降到了11.58u/l。
92.1.2 ih6对高胆固醇血症小鼠的肝脏变性的影响
93.hcd_nd组肝脏肿大，呈灰黄色，ih6组会使肝脏体积减小，颜色呈红棕色，肝脏质地柔软，接近于nd组的肝脏形态(图2a)。he染色中hcd_nd组的肝脏细胞排列松散无序，有大量大小不等、数量不一的脂肪空泡出现，肝细胞体积变大且部分坏死，肝细胞损伤较严重(图2b)。ih6组肝细胞损伤明显降低，胞浆内的脂肪滴空泡减少，肝细胞排列整齐。油红o染色的hcd_nd组小鼠肝脏脂滴呈颗粒堆积，染色后融合呈片状 (图2c)，但ih6组的肝脏细胞脂滴染色数量显著减少，并且体积较小，呈不规则不均匀分布。用免疫组织化学染色检测小鼠肝脏组织中ucp1的表达(图2d)，与hcd_nd相比，ih6组的ucp1表达明显增强，在肝脏组织内有大量面积的阳性表达的棕色颗粒。
94.1.3 ih6对高胆固醇血症小鼠胰岛素耐量(itt)的影响
95.hcd_nd组小鼠体内的葡萄糖水平紊乱，注入胰岛素后血糖水平下降缓慢，ih6可以改善小鼠的胰岛素耐量，表现在葡萄糖降低和胰岛素耐量试验的auc值降低，ih6组的auc值下降了15.10％(p＜0.05，图3a、b)。表明ih6能够缓解高胆固醇血症小鼠的胰岛素耐量。
96.1.4 ih6对高胆固醇血症小鼠肠道菌群结构的影响
97.采用16s rrna基因测序技术从小鼠肠道菌群共鉴定出1061个otus，包括18个门、 33个纲、78个目、112个科、196个属、305个种。rank-abundance曲线是分析多样性的一种方式，可用来解释物种多样性的丰富度和群落均匀度，与hcd_nd相比，ih6 组能够明显改善高胆固醇饮食诱导的物种丰富度和群落均匀度减小的现象(图4a)。图 4b分别为稀释性曲线对ace、shannon、shannoneven指数的影响，从图中可以看出，各组数据在3种指数的稀释性曲线中均逐渐趋向平坦，说明微生物的测量是合理的，更多的测量量只会产生少量的outs。
98.通过基于otu水平评估了不同处理小鼠肠道微生物的α多样性，ih6组小鼠肠道微生物群的ace、shannon和shannoneven指数显著高于hcd_nd(图4c)。样本分组分析表明样本分组是的合理的(图4d)，β多样性主坐标分析(pcoa)表明，ih6组小鼠的肠道微生物群与nd组和sim组更为相似，与hcd_nd组有明显的差异(图4e)。与hcd_nd 相比，ih6增加了小鼠肠道微生物群的丰度，otu数量增加了39.86％(图4f)。基于 otu水平的热图表明hcd_nd组及其他试验组的菌群结构被明显地分为2个部分，ih6 的群落丰度与nd和sim组更为相似(图4g)。
99.进一步分析肠道菌群在门水平上的组成，figure 4h表明，hcd组小鼠肠道的 firmicutes增多，bacteroidota减少，从而导致f/b比率上升。而ih6使firmicutes 的相对丰度减少了44.96％，bacteroidota的相对丰度增加了377.05％，与hcd_nd组相比ih6组显著降低了f/b的比率。
100.lefse分析表明不同处理组间的菌群结构具有显著差异(图4i)，采用线性判别分析(lda)评价了不同处理组小鼠的优势菌属，ih6组的优势菌属为 norank_f__muribaculaceae、prevotellaceae_ucg-001、shuttleworthia、 norank_f__norank_o__clostridia_vadinbb60_group(图4j)。student's t test检验组间差异(图4k)，与ih6组相比，hcd_nd组显著增加了faecalibaculum、allobaculum、 turicibacter和norank_f__
eubacterium_coprostanoligenes_group的菌群丰度。与 hcd_nd组相比，ih6组的norank_f__muribaculaceae、prevotellaceae_ucg-001和 muribaculum丰度显著增加，这些优势菌可能成为ih6有效降低胆固醇的潜在生物标志物。以上结果表明，ih6能够通过调节肠道微生物缓解高胆固醇血症小鼠的肠道菌群失调。
101.1.5 ih6对高胆固醇血症小鼠粪便代谢物的影响
102.基于超高效液相色谱串联飞行时间质谱uplc-tripletof方法非靶向检测小鼠粪便代谢物，将ms和msms质谱信息与代谢公共数据库hmdb(http：//www.hmdb.ca/)和metlin(https：//metlin.scripps.edu/)数据库进行匹配，共鉴定出1114种粪便代谢物。β多样性pls-da分析表明hcd_nd组与nd、sim、ih6组有明显的分离，置换检验模型显示pls-da模型是可靠的(图5a)。
103.所有代谢物进一步分为与脂质代谢相关的vitamins and cofactors、amino acids、 bile acids及lipids。与hcd_nd相比，ih6显著增加了4种vitamins and cofactors 的相对含量，分别为s-adenosylmethionine、folic、pantothenate和niacinamide(图 5b)。与hcd_nd相比，ih6显著增加了与肠道菌群代谢相关的氨基酸(图5c)，如l-tryptophan、l-proline的相对含量，而ih6却提高了支链氨基酸(bcaa) l-isoleucine的相对含量。对于bile acids，与hcd_nd相比，ih6组中初级胆汁酸 cholic acid的相对含量降低了13.31％，而ih6却下调了次级胆汁酸(deoxycholic acid、 3-dehydrocholic acid、12-ketolithocholic acid、glycolithocholic acid)的相对含量(图5d)。通过聚类热图和vip条形图观察hcd_nd与ih6的差异代谢物重要性和表达量趋势变化(图5e)，ih6找出7个lipids的差异代谢物，与hcd_nd相比，ih6 组显著上调了stearidonic acid、dodecanedioic acid和alprostadil三种lipids。
104.kegg通路分析用于预测各组粪便代谢物的生物过程，对ih6与hcd_nd组之间的差异代谢物进行分析，发现ih6调节高胆固醇血症小鼠可能与vitamin digestion andabsorption、regulation of lipolysis in adipocytes、camp signaling pathway、 bile secretion等代谢通路有关(图5f)。
105.1.6 ih6和fmt3组微生物群落与理化指标和代谢物的相关性
106.进一步分析肠道微生物群(属水平的前10个属)与高胆固醇血症理化指标之间的 pearson相关性(图6a)，norank_f__muribaculaceae和lactobacillus与tc、alt、肝脏tc及肝脏重量呈显著性的负相关，turicibacter、romboutsia、allobaculum和 faecalibaculum与这些指标呈显著性的正相关。通过冗余分析(rda)评估粪便代谢物与微生物群落结构之间的相关性，如图6b-e所示，faecalibaculum、allobaculum和 turicibacter与其他菌属均呈现明显的负相关，与之前的结果一致。vitamins andcofactors与lactobacillus、coriobacteriaceae_ucg-002和muribaculum呈现正相关(图6b)。l-serine与lactobacillus呈现正相关，同时其余amino acids与ih6 优势菌呈现正相关(图6c)。对于bile acids，turicibacter、romboutsia和 faecalibaculum与大多数bile acids呈现显著的正相关(图6d)。同样的ih6优势菌与lipids呈现正相关(图6e)。虽然没有统计学意义，但这些结果表明ih6组调节高胆固醇血症小鼠粪便代谢物的产生及丰度与肠道微生物有一定的相关性。
107.2、sh6对小鼠各项指标的影响
108.2.1 sh6对小鼠的血清和肝脏理化指标的影响
109.在喂养的过程中发现，sh6组的进食量与hcd_nd组没有差异，同样各组间小鼠的体重也没有差异(图7a-b)。在经过sh6灌胃后，小鼠脂代谢相关的理化指标得到了改善(图7c-f、h-i)，与hcd_nd相比，sh6组小鼠的肝脏重量显著下降(p＜0.05)，血清tc、ldl-c分别下降了23.95％、48.38％，sh6也可显著降低小鼠血清alt含量，下降到了 15.86u/l，并且肝脏tc、tg分别下降了35.69％、17.16％(p＜0.05)。
110.2.2 sh6对高胆固醇血症小鼠的肝脏变性的影响
111.hcd_nd组肝脏肿大，呈灰黄色，sh6组会使肝脏体积减小，颜色呈红棕色，肝脏质地柔软，接近于nd组的肝脏形态(图8a)。he染色中hcd_nd组的肝脏细胞排列松散无序，有大量大小不等、数量不一的脂肪空泡出现，肝细胞体积变大且部分坏死，肝细胞损伤较严重(图8b)。sh6组肝细胞损伤明显降低，胞浆内的脂肪滴空泡减少，肝细胞排列整齐。油红o染色的hcd_nd组小鼠肝脏脂滴呈颗粒堆积，染色后融合呈片状(图8c)，但sh6组的肝脏细胞脂滴染色数量减少，并且体积较小，呈不规则不均匀分布。用免疫组织化学染色检测小鼠肝脏组织中ucp1的表达(图8d)，与hcd_nd相比， sh6组的ucp1表达增强，在肝脏组织内出现阳性表达的棕色颗粒。
112.2.3 sh6对高胆固醇血症小鼠葡萄糖耐量(gtt)的影响
113.hcd_nd组小鼠体内的葡萄糖水平紊乱，血糖水平急速上升，sh6会使小鼠葡萄糖耐量对应的auc值下降，下降了23.89％(p＜0.05，图9a、b)，表明sh6能够缓解高胆固醇血症小鼠的葡萄糖耐量。
114.2.4 sh6对高胆固醇血症小鼠肠道菌群结构的影响
115.采用16s rrna基因测序技术从小鼠肠道菌群共鉴定出1061个otus，包括18个门、 33个纲、78个目、112个科、196个属、305个种。rank-abundance曲线是分析多样性的一种方式，可用来解释物种多样性的丰富度和群落均匀度，与hcd_nd相比，sh6 组能够明显改善高胆固醇饮食诱导的物种丰富度和群落均匀度减小的现象(图10a)。图10b分别为稀释性曲线对ace、shannon、shannoneven指数的影响，从图中可以看出，各组数据在3种指数的稀释性曲线中均逐渐趋向平坦，说明微生物的测量是合理的，更多的测量量只会产生少量的outs。
116.通过基于otu水平评估了不同处理小鼠肠道微生物的α多样性，sh6组小鼠肠道微生物群的ace、shannon和shannoneven指数显著高于hcd_nd(图10c)。样本分组分析表明样本分组是的合理的(图10d)，β多样性主坐标分析(pcoa)表明，sh6组小鼠的肠道微生物群与nd组和sim组更为相似，与hcd_nd组有明显的差异(图10e)。与 hcd_nd相比，sh6增加了小鼠肠道微生物群的丰度，otu数量增加了17.63％(图10f)。基于otu水平的热图表明hcd_nd组及其他试验组的菌群结构被明显地分为2个部分，sh6的群落丰度与nd和sim组更为相似(图10g)。
117.进一步分析肠道菌群在门水平上的组成，图10h表明，hcd组小鼠肠道的 firmicutes增多，bacteroidota减少，从而导致f/b比率上升。而sh6使firmicutes的相对丰度减少了44.64％，bacteroidota的相对丰度增加了234.85％，与hcd_nd组相比sh6组显著降低了f/b的比率。
118.lefse分析表明不同处理组间的菌群结构具有显著差异(图10i)，采用线性判别分析(lda)评价了不同处理组小鼠的优势菌属，sh6组的优势菌属为limnohabitans(图 10j)。
student's t test检验组间差异(图10k)，与sh6组相比，hcd_nd组显著增加了 faecalibaculum、allobaculum、turicibacter和norank_f__eubacterium_coprostanoligenesgroup等的菌群丰度。与hcd_nd组相比，sh6组的norank_f__muribaculaceae和 muribaculum的丰度显著增加，这些优势菌可能成为sh6有效降低胆固醇的潜在生物标志物。以上结果表明，sh6能够通过调节肠道微生物缓解高胆固醇血症小鼠的肠道菌群失调。
119.2.5 sh6对高胆固醇血症小鼠粪便代谢物的影响
120.基于超高效液相色谱串联飞行时间质谱uplc-tripletof方法非靶向检测小鼠粪便代谢物，将ms和msms质谱信息与代谢公共数据库hmdb(http：//www.hmdb.ca/) 和metlin(https：//metlin.scripps.edu/)数据库进行匹配，共鉴定出1114种粪便代谢物。β多样性pls-da分析表明hcd_nd组与nd、sim、sh6组有明显的分离，置换检验模型显示pls-da模型是可靠的(图11a)。
121.所有代谢物进一步分为与脂质代谢相关的vitamins and cofactors、amino acids、 bile acids及lipids。与hcd_nd相比，sh6显著增加了5种vitamins and cofactors的相对含量，分别为s-adenosylmethionine、folic acid、pantothenate、pantothenic acid和 niacinamide(图11b)。与hcd_nd相比，sh6显著增加了与肠道菌群代谢相关的氨基酸(图11c)，如l-tryptophan、l-proline的相对含量，而sh6却提高了支链氨基酸(bcaa) l-isoleucine的相对含量。对于bile acids，与hcd_nd相比，sh6组中初级胆汁酸cholicacid的相对含量降低了21.00％，而sh6却下调了次级胆汁酸(deoxycholic acid、 3-dehydrocholic acid、12-ketolithocholic acid、glycolithocholic acid)的相对含量(图11d)。通过聚类热图和vip条形图观察hcd_nd与sh6的差异代谢物重要性和表达量趋势变化(图11e)，sh6找出16个lipids的差异代谢物，与hcd_nd相比，sh6组显著上调了ouabain。
122.kegg通路分析用于预测各组粪便代谢物的生物过程，对sh6与hcd_nd组之间的差异代谢物进行分析，发现sh6调节高胆固醇血症小鼠可能与bile secretion、mtorsignaling pathway、regulation of lipolysis in adipocytes等代谢通路有关(图11f)。
123.2.6sh6和fmt3组微生物群落与理化指标和代谢物的相关性
124.进一步分析肠道微生物群(属水平的前10个属)与高胆固醇血症理化指标之间的 pearson相关性(图12a)，norank_f__muribaculaceae和lactobacillus与tc、ldl-c、 alt、肝脏tc、tg及肝脏重量呈明显的负相关，turicibacter、allobaculum和 faecalibaculum与这些指标呈显著性的正相关。通过冗余分析(rda)评估粪便代谢物与微生物群落结构之间的相关性，如图figure 6b-e所示，faecalibaculum、allobaculum、 romboutsia和turicibacter与其他菌属均呈现明显的负相关，与之前的结果一致。 vitamins and cofactors与lactobacillus、coriobacteriaceae_ucg-002、muribaculum和 norank_f__muribaculaceae等呈现正相关(图12b)，amino acids与lactobacillus、 coriobacteriaceae_ucg-002、muribaculum和norank_f__muribaculaceae也呈现正相关(图 12c)。对于bile acids，turicibacter、romboutsia和faecalibaculum与大多数bile acids 呈现显著的正相关(图12d)。同样的lactobacillus、coriobacteriaceae_ucg-002、 muribaculum和norank_f__muribaculaceae与lipids呈现正相关(图12e)。虽然没有统计学
意义，但这些结果表明sh6组调节高胆固醇血症小鼠粪便代谢物的产生及丰度与肠道微生物有一定的相关性。
125.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。