基于博落回提取物作为仔猪肠道reg3γ的调节剂及其应用
技术领域：
：1.本发明属于生物、医药
技术领域：
：，尤其是涉及一种基于博落回提取物作为仔猪肠道reg3γ调节剂、应用
技术领域：
：。
背景技术：
：：2.reg3γ是reg(regeneratinggene，再生基因)家族成员之一，属于c型凝集素的第iv家族，主要在哺乳动物的胰岛、皮肤和肠道上皮组织表达。reg3γ对肠道细菌具有杀菌活性，被认为是肠道微生物区系的重要调控因子，除了对细菌具有直接杀灭活性外此外，reg3γ还能将微生物群与小肠上皮表面物理隔离，限制免疫反应的过度激活。此外，reg3γ还具有抗炎、促进细胞增殖及损伤修复等多种生物学功能。3.博落回[macleayacordata(wild).r.br.]是一种多年生草本植物，属于罂粟科博落回属。博落回作为一种富含生物碱的传统的中草药，其药用历史有1000多年，具有抗菌、抗炎、抗癌、杀虫、提高免疫力等多种生物学活性。在畜牧业中，博落回及其有效成分已用于治疗禽霍乱、仔猪白痢、猪大肠杆菌病、对猪黄痢、白痢、水肿病、副伤寒和猪的传染性肠胃炎等多种疾病。博落回及其有效成分在养猪业中已经开始使用，主要用于促生长添加剂、抗菌、抗炎等。关于博落回提取物(macleayacordataextract，mce)是否能够调节仔猪肠道reg3γ表达的研究尚未见报道；博落回提取物与reg3γ是否存在指向性关联，暂无证据证实。技术实现要素：[0004]本发明提供一种基于博落回提取物作为仔猪肠道reg3γ的调节剂及其应用技术方案。[0005]本发明采用如下技术方案实现。[0006]一种调节剂，本发明所述的调节剂为基于博落回提取物作为reg3γ的调节剂。[0007]进一步为，本发明所述的reg3γ是肠道reg3γ。[0008]进一步为，本发明所述的reg3γ是仔猪肠道reg3γ。[0009]进一步为，本发明所述的博落回提取物来源于罂粟科植物博落回，从博落回的地上部分干燥之后提取制备而成。[0010]进一步为，本发明所述的博落回提取物包含的血根碱与白屈菜红碱的质量含量分别为43-47％和17-21％。[0011]进一步为，本发明所述的博落回提取物包含的血根碱与白屈菜红碱的质量含量分别为45％和19％。[0012]一种药物，本发明所述的该药物同时包含血根碱与白屈菜红碱。[0013]进一步为，本发明该药物同时包含的血根碱与白屈菜红碱的质量含量分别为43-47％和17-21％。[0014]进一步为，本发明该药物同时包含的血根碱与白屈菜红碱的质量含量分别为45％和19％。[0015]本发明的有益效果为，1)本发明证实了博落回提取物提高了仔猪肠道reg3γ表达。2)本发明包括利用博落回提取物制造提高仔猪肠道reg3γ表达的药物。3)本发明为后期开展与博落回提取物调节reg3γ表达进行更深层次的研究奠定了坚实的基础。[0016]下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。附图说明[0017]图1mce对21日龄仔猪回肠粘膜中reg3γmrna表达的影响；其中，数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(p《0.05)，不同大写字母表示差异极显著(p《0.01)。[0018]图2不同浓度mce对lps处理ipec-j2细胞reg3γmrna表达的影响；其中，数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(p《0.05)，不同大写字母表示差异极显著(p《0.01)。[0019]图3不同浓度mce对lps处理ipec-j2细胞reg3γ蛋白表达的影响(柱状图)。其中，数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(p《0.05)，不同大写字母表示差异极显著(p《0.01)。[0020]图4不同浓度mce对lps处理ipec-j2细胞reg3γ蛋白表达的影响(条带图)。具体实施方式[0021]本发明实施例是以仔猪作为研究对象进行，并非仅限制在仔猪这一种物种之中。[0022]为了研究mce作为调节仔猪肠道reg3γ表达药物方面的应用，本研究通过对新生仔猪隔天灌服1ml8mg/mlmce，在21日龄时，检测仔猪回肠粘膜中reg3γ表达水平，研究mce对仔猪肠道reg3γ表达的影响。同时本研究利用lps诱导的ipec-j2细胞作为细胞炎症模型，研究mce对ipec-j2细胞表达reg3γ的影响。[0023]一种调节剂，本发明所述的调节剂为基于博落回提取物作为reg3γ的调节剂。[0024]进一步为，本发明所述的reg3γ是肠道reg3γ。[0025]进一步为，本发明所述的reg3γ是仔猪肠道reg3γ。[0026]进一步为，本发明所述的博落回提取物来源于罂粟科植物博落回，从博落回的地上部分干燥之后提取制备而成。[0027]进一步为，本发明所述的博落回提取物包含的血根碱与白屈菜红碱的质量含量分别为43-47％和17-21％。[0028]进一步为，本发明所述的博落回提取物包含的血根碱与白屈菜红碱的质量含量分别为45％和19％。[0029]一种药物，本发明所述的该药物同时包含血根碱与白屈菜红碱。[0030]进一步为，本发明该药物同时包含的血根碱与白屈菜红碱的质量含量分别为43-47％和17-21％。[0031]进一步为，本发明该药物同时包含的血根碱与白屈菜红碱的质量含量分别为45％和19％。[0032]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0033]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0034]实施例1：mce对21日龄仔猪回肠粘膜中reg3γmrna表达的影响[0035](1)实验设计与实验材料[0036]试验设计：选用体重、胎次(经产3～4胎)、泌乳量、产仔数相近，预产期相近，健康的ly母猪18头，每头母猪选4头小猪(2公2母)，试验分为3个处理，每个处理6个重复(6头母猪)，每个重复4头小猪，共72头小猪，打耳号，用于试验。3个处理分别为对照组、mce组(8mg/mlmce)和金霉素组(5mg/ml盐酸金霉素)。不同处理的仔猪隔天分别经口灌服1ml/(头.天)生理盐水、8mg/mlmce或5mg/ml金霉素。[0037]试验饲粮：参照nrc(2012)猪营养需要推荐量配制ly哺乳母猪饲粮，哺乳母猪饲粮组成和营养水平见表1。[0038]表1哺乳母猪饲粮及营养水平(风干基础)[0039]table1compositionandnutrientlevelsoflactatingsows(air-drybasis)％[0040][0041]矿物质预混料为每千克饲粮提供mineralpremixprovidedthefollowingperkilogramofdiets：fe(asferroussulfate)80mg，cu(ascoppersulfate)20mg，zn(aszincsulfate)100mg，mn(asmanganesesulfate)25mg，se(assodiumselenite)0.15mg，i(aspotassiumiodide)0.14mg。[0042]维生素预混料为每千克饲粮提供vitaminpremixprovidesthefollowingperkilogramofdiets：va2000iu，vd800iu，ve44iu，vk0.5mg，生物素0.2mg，胆碱1mg，叶酸1.30mg，可利用尼克酸10mg，泛酸12mg，核黄素3.75mg，vb11mg，vb61mg，vb1215mg，亚油酸0.10mg[0043]消化能为计算值，其它为实测值。[0044]饲养管理：试验母猪饲养于同一产房，每栏1头，自由饮水与采食，日喂2次不含抗生素的母猪日粮，严格按照猪场饲养管理要求进行消毒、常规免疫与母猪管理。整个试验期间仔猪随母猪在产床哺乳，产床设有红外保温箱，直到21日龄断奶。仔猪于7日龄开始诱食不含抗生素的教槽料，少量勤添，保持料盘始终有少量教槽料供仔猪自由采食。仔猪自由饮水，免疫程序及其他饲养管理方式按常规进行。[0045]试验材料：[0046]mce：由本试验团队提取，经高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography，hplc)测定，其中的血根碱与白屈菜红碱含量分别为45％和19％；[0047]盐酸金霉素：(chlortetracyclinehydrochloride)，纯度》95％，solarbio公司；[0048](2)实验方法[0049]21日龄时，从每个处理中，随机选择体重相近的3头仔猪(2公1母)屠宰。仔猪屠宰后，截取回肠中部，纵向剪开，在冰的无菌生理盐水中轻轻摆动，除净肠道内容物，用手术刀片刮取回肠粘膜，按1:5加冰生理盐水，匀浆，4000r/min离心15min，取上清，以gapdh作为内参基因，用rt-pcr方法检测回肠粘膜reg3γmrna表达水平。[0050]1)总rna提取[0051]裂解：取100mg左右的肠粘膜放入研钵，先加少量的液氮快速研磨，待粘膜变软后，再加入少量的液氮，快速研磨成粉状。[0052]抽提：将粘膜样品按100mg加入1mltrizol，转移入离心管。另外样品体积不能超过trizol体积的10％，用均浆器充分均浆1～2min。4℃、12000rmp、5min离心，取上清。[0053]萃取：按每毫升trizol中加入200μl的氯仿，盖紧离心管，用手振荡混匀15s，室温放置10min。4℃、12000r、15min离心，吸取上层水相，移至新的离心管中。[0054]沉淀：按每毫升trizol加入0.6ml异戊醇，混匀后室温放置5～10min。[0055]漂洗：4℃、12000r、10min离心，弃上清液，按每毫升trizol加入1ml的75％乙醇，温和振荡，悬浮沉淀。[0056]干燥：在室温晾干5～10min，用nanodroop1000，检测rna浓度、纯度，定量rna浓度，保存于-80℃冰箱备用。[0057]2)反转录[0058]a按照takara反转录试剂盒说明操作。首先去除基因组dna，按表2冰上配置反应液，反应条件：42℃2min。[0059]表2反应体系a组成[0060]table2compositionofreactionsystema[0061][0062]b然后进行反转录反应，按表3冰上配制反应混合液，反应条件：37℃15min；85℃5s；4℃。[0063]表3反应体系b组成[0064]table3compositionofreactionsystemb[0065][0066]c实时荧光定量pcr[0067]参照ncbi普通猪的相关基因序列，利用primer5.0软件进行引物设计，并用primer-blast确认引物的特异性，由擎科生物科技有限公司合成引物。实时荧光定量pcr引物信息见表4。[0068]表4rt-pcr引物信息[0069]table4informationofprimerssuedforrt-pcr[0070][0071]按表5冰上配制反应混合液。[0072]表5反应体系c组成[0073]table5compositionofreactionsystemc[0074][0075]反应条件：使用appliedbiosystemssteponepluspcr仪，进行realtimepcr，反应程序设置为，预变性：95℃，30s；pcr反应：95℃，4s，60℃，30s(40个循环)；溶解曲线：95℃，15s，60℃，1min，95℃，15s。[0076]数据处理与统计分析：用gapdh作为内参，采用2‑△△ct法计算基因相对表达量。目的基因的表达量＝2‑△△ct，△△ct＝[(ct目的基因-ct管家基因)试验组]-[(ct目的基因-ct管家基因)对照组]。试验数据用excel2007软件进行初步整理后，采用spss19.0软件的one-wayanova进行单因素方差分析，结果以“平均值±标准差”表示，差异显著分析采用duncan法进行多重比较，p《0.05为差异显著，p《0.01为差异极显著。[0077](3)实验结果[0078]金霉素在养殖业中主要用于促进动物生长，提高饲料转化率，防治动物疾病。博落回及其有效成分在养殖业中主要用于促生长添加剂、抗菌、抗炎等。为了比较两者对仔猪肠道reg3γ表达的影响，试验设立对照组、金霉素组和mce组。由图1可知，与对照组相比，金霉素组和mce组新生期仔猪回肠粘膜中reg3γmrna表达极显著升高(p《0.01)，且mce组reg3γmrna表达极显著高于金霉素组(p《0.01)。结果说明金霉素和mce均能提高reg3γmrna的表达，且隔天灌服1ml/(头.天)8mg/ml的mce效果优于5mg/ml金霉素。[0079]实施例2：mce对lps处理的ipec-j2细胞reg3γmrna和蛋白表达的影响[0080](1)实验材料[0081]实验细胞株：猪小肠上皮细胞ipec-j2，购自北京北纳创联生物技术研究院。[0082]mce：由本试验团队从博落回干燥之后的地上部分提取，经高效液相色谱法测定，其中的血根碱与白屈菜红碱含量分别为45％和19％。；[0083]β-actin(#ma5-15739)，购自invitrogen；reg3γ(ab233480)购自abcam；二抗(#31460)，购自thermofisherscientific-cn；增强型化学发光(ecl)检测试剂，购自biosharp；[0084]胎牛血清(fbs)购自gibco；pvdf膜，购自merckmillipore。[0085](2)实验方法[0086]将ipec-j2细胞按每孔1×105接种到6孔板，在37℃，5％co2条件下培养24h后，置于倒置显微镜下观察，待细胞贴壁良好，完全铺满细胞板底部时，用于后续试验。试验分为对照组、lps组、50ng/mlmce组、100ng/mlmce组和150ng/mlmce组，每组3个重复。分别向不同浓度mce组加入相应质量的mce，对照组和lps组分别加入相同体积的基础培养基，于37℃，5％co2条件下培养12h；吸弃原培养基，向除对照组外各组细胞中分别加入2ml含1μg/mllps的基础培养基，对照组加入等量基础培养基，继续培养12h。吸弃培养基，收集细胞。收集细胞，提取细胞总rna，检测其浓度后，用于后续荧光定量pcr试验；同时，提取细胞全蛋白，用于后续westernblot试验。其中，细胞总rna用takaraminibestuniversalrnaextractionkit试剂盒提取，rna反转录用primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser反转录试剂盒，荧光定量用tbpremixextaqtmii(tlirnasehplus)试剂。[0087]荧光定量pcr试验步骤按实施例1进行。[0088]蛋白提取：将细胞培养基弃去，用4℃预冷的pbs洗涤细胞三次后，将六孔板倒置于滤纸上，将水控干。按ripa：pmsf＝100：1的比例混合后，每孔加入400μl细胞裂解液，在冰上放置30min，让其充分裂解。用预先高压准备的刮子及ep管并做好标记，将细胞刮入1.5ml的ep管中，离心机4℃，12000r，12min。将离心后的上清转移至新的1.5mlep管中标记，并进行蛋白含量的测定。[0089]蛋白含量的测定及样品制备：取20μl，5mg/mlbsa蛋白标准品溶液用pbs溶液稀释至100μl，终浓度为1mg/ml。以终浓度为0μg/ml、25μg/ml、125μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、750μg/ml、1000μg/ml、1500μg/ml、2000μg/ml做标准测定溶液。将适当体积的提取蛋白加入微孔板中，并用pbs补足20μl。加入bca工作液(a液：b液按照体积比50：1混合)，37℃放置30min。562nm波长测定吸光值，并记录。以a562为纵坐标，bsa含量为横坐标，绘制标准曲线，计算提取样品的蛋白浓度，按照100μg上样量，计算所需样品的体积。制备westernblot样品，5μl配制好的5×载样液+计算好的样品量，混匀并瞬时离心。将混匀的样品放置95℃，10min，制备好的样品直接电泳或冻于ꢀ‑80℃。[0090]westernblot检测：[0091]①sds-page电泳：用洗洁精清洗玻璃板，用自来水冲洗后，在用up水冲洗干净，放架子上晾干。将玻璃板对齐夹紧后灌胶，注意底部平整防止漏胶。按表6配制10％的分离胶、5％浓缩胶。灌胶时注意梳孔到分离胶留出距离0.5-1cm。灌入分离胶后加1ml水液封，30-45min后，胶与水之间出现一条折线分离胶已凝，倒出水，用滤纸将剩余水分吸干，灌入浓缩胶并插入梳子。将sds凝胶放入电泳槽，倒入已经配制好的电泳液(5×电泳液100ml+900mlup水)，缓慢拔出梳子，将制备好的蛋白样品按顺序加入梳孔，并加入6μl蛋白marker。设定电泳程序：首先电压为50v，时间30min，当样品跑入分离胶后，电压改为120v，时间1h。当溴酚蓝载样液到距离胶板底部1-2cm时，停止电泳。[0092]表610％分离胶和5％浓缩胶的配制[0093]table6preparationof10％separationglueand5％concentrateglue[0094][0095]②转膜：根据蛋白marker和待测蛋白的分子量，对待测蛋白的位置进行初步判定，适当扩宽并切下凝胶。裁出与同凝胶大小相等的pvdf膜，放入甲醇中激活5min备用；按黑面，海绵，3层滤纸、蛋白胶，三层滤纸，海绵、白面顺序做成三明治样，操作期间避免在凝胶和pvdf膜中间出现气泡。将夹好的三明治放置在转膜盒中，到入预冷转膜液(10×转膜液80ml+720mlup水+200ml甲醇)。再将整个装置放入冰盒中，避免温度过高；100v，350ma，60min转膜；结束后拿出pvdf膜，标记正反面，再用封闭液封闭，37℃下摇床摇1h。[0096]③抗体孵育：封闭1h后，倒掉盒中封闭液，用up水冲洗泡沫，将盒倒置，把水控干(防止一抗被稀释)，将配制好的一抗倒入盒中，4℃冰箱摇床过夜。回收一抗，用tbst洗膜三次，每次10min，倒入相应二抗37℃下摇床摇1h。回收二抗，tbst洗膜三次，每次10min。[0097]④曝光：配制好显色液，一张膜1ml的量，现配现用。a液：b液＝1：1(试剂盒4℃保存)，将膜取出，置于吸水纸上吸干，将其置于仪器中，加入显色液，正反面都要与显色液充分接触，注意不要有气泡，进行曝光处理，保存并标注图片。[0098]统计与数据分析：基因相对表达分析采用2‑△△ct法，目的基因的表达量＝2‑△△ct，ꢀ△△ct＝[(ct目的基因-ct管家基因)试验组]-[(ct目的基因-ct管家基因)对照组]。用imagej分析westernblot条带灰度，所有试验数据用excel2007软件进行初步整理后，采用spss19.0软件的one-wayanova进行单因素方差分析，结果以“平均值±标准差”表示，差异显著时用duncan法进行多重比较，p《0.05为差异显著，p《0.01为差异极显著。[0099](3)实验结果[0100]由图2可知，lps极显著提高了ipec-j2细胞的reg3γ的mrna表达(p《0.01)，ipec-j2细胞在炎性状态下添加mce可进一步提高reg3γ的表达。与lps组相比，50ng/ml、100ng/ml、150ng/mlmce极显提高了reg3γ的mrna表达(p《0.01)，与50ng/ml、150ng/mlmce组相比，100ng/mlmce组的浓度极显提高了reg3γ的mrna表达(p《0.01)。由图3、4可知，lps极显著提高了ipec-j2细胞的reg3γ蛋白表达；与lps组相比，50ng/ml、100ng/ml、150ng/mlmce极显著提升了reg3γ的蛋白表达(p《0.01)。在3种浓度的mce中，100ng/mlmce组的reg3γ的蛋白表达最高。细胞试验与动物试验均证明mce可以提高reg3γ的表达。[0101]以上所述的仅是本发明的部分具体实施例，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。当前第1页12当前第1页12