一种芬苯达唑类脂质体的制备方法及应用

1.本发明涉及芬苯达唑的新制剂技术领域，具体为一种芬苯达唑类脂质体的制备方法及应用。


背景技术：

2.据2020年世界卫生组织国际癌症研究机构最新公布的数据显示，2020年全球新发癌症病例1929万例，其中全球女性乳腺癌新发病例快速增长达226万，死亡病例达68万例，首次正式取代肺癌成为全球第一大癌症，同时也成为了女性恶性肿瘤死亡的主要原因。目前临床治疗乳腺癌的手段，如手术、放疗、化疗等并不能完全阻止乳腺癌的复发与转移，同时伴有严重的不良反应，且目前仍没有任何一种药物能显著改善乳腺癌的总生存率。本发明主要利用非肿瘤药物芬苯达唑开发出一种靶向治疗效果优异且副作用低的新型脂质体给药剂型，以提高乳腺癌患者生存率及改善预后。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提出了一种芬苯达唑类脂质体的制备方法及应用，使用脂质体作为抗乳腺癌药物的载体可以改善治疗效果，减少用药剂量，降低细胞毒性，减轻甚至避免变态和免疫反应，减轻病人痛苦。
4.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
5.一种芬苯达唑类脂质体的制备方法，包括以下步骤：
6.步骤s1：将2.790g芬苯达唑粉末充分溶解于25ml四氢呋喃溶液中；
7.步骤s2：向步骤s1中加入9.45ml盐酸溶液，室温下使溶剂完全蒸发得到无定形、浅棕色物质；
8.步骤s3：将步骤s2得到的物质溶解于500ml乙醇中，在室温下蒸发乙醇，得到灰白色粉末，即得芬苯达唑盐酸盐；
9.步骤s4：取0.4g胆固醇和0.6g大豆蛋白溶解于50ml氯仿中，加入0.1ml荧光剂，于超声波振荡器中溶解；
10.步骤s5：向步骤s4中加入适量芬苯达唑盐酸盐，震荡数分钟使药物完全溶解；
11.步骤s6：将步骤s5中的溶液在40-50℃的水浴中旋转蒸发15分钟，直至溶剂完全蒸发；
12.步骤s7：用ph 9.0的碳酸钠缓冲溶液溶解脂质体膜并将步骤s6所得物质包封于脂质体膜中，即得芬苯达唑盐酸盐脂质体。
13.进一步地，包括以下步骤：
14.步骤s1：将3.100g芬苯达唑粉末充分溶解于250ml四氢呋喃溶液中；
15.步骤s2：向步骤s1中加入0.683ml甲磺酸溶液，室温下使溶剂完全蒸发得到无定形、浅棕色物质；
16.步骤s3：将步骤s2得到的物质溶解于500ml乙醇中，在室温下蒸发乙醇，得到灰白
色粉末，即得芬苯达唑甲磺酸盐；
17.步骤s4：取0.4g胆固醇和0.6g大豆蛋白溶解于50ml氯仿中，加入0.1ml荧光剂，于超声波振荡器中溶解；
18.步骤s5：向步骤s4中加入适量芬苯达唑甲磺酸盐，震荡数分钟使药物完全溶解；
19.步骤s6：将步骤s5中的溶液在40-50℃的水浴中旋转蒸发15分钟，直至溶剂完全蒸发；
20.步骤s7：用ph 9.0的碳酸钠缓冲溶液溶解脂质体膜并将步骤s6所得物质包封于脂质体膜中，即得芬苯达唑甲磺酸盐脂质体。
21.进一步地，包括以下步骤：
22.步骤s1：将3.000g芬苯达唑粉末充分溶解于250ml四氢呋喃溶液中；
23.步骤s2：向步骤s1中加入10.15ml硫酸溶液，室温下使溶剂完全蒸发得到无定形、浅棕色物质；
24.步骤s3：将步骤s2得到的物质溶解于500ml乙醇中，在室温下蒸发乙醇，得到灰白色粉末，即得芬苯达唑硫酸盐；
25.步骤s4：取0.4g胆固醇和0.6g大豆蛋白溶解于50ml氯仿中，加入0.1ml荧光剂，于超声波振荡器中溶解；
26.步骤s5：向步骤s4中加入适量芬苯达唑硫酸盐，震荡数分钟使药物完全溶解；
27.步骤s6：将步骤s5中的溶液在40-50℃的水浴中旋转蒸发15分钟，直至溶剂完全蒸发；
28.步骤s7：用ph 9.0的碳酸钠缓冲溶液溶解脂质体膜并将步骤s6所得物质包封于脂质体膜中，即得芬苯达唑硫酸盐脂质体。
29.进一步地，所述步骤s5中的：向步骤s4中加入适量芬苯达唑盐酸盐，震荡数分钟使药物完全溶解，通过用正交实验确定芬苯达唑盐酸盐最佳质量。
30.进一步地，所述步骤s5中的：向步骤s4中加入适量芬苯达唑甲磺酸盐，震荡数分钟使药物完全溶解，通过用正交实验确定芬苯达唑甲磺酸盐最佳质量。
31.进一步地，所述步骤s5中的：向步骤s4中加入适量芬苯达唑硫酸盐，震荡数分钟使药物完全溶解，通过用正交实验确定芬苯达唑硫酸盐最佳质量。
32.一种根据权利要求1-3所述的芬苯达唑类脂质体的应用，所述芬苯达唑类脂质体用于治疗乳腺癌。
33.本方法发明利用获得美国食品和药物管理局(fad)批准的芬苯达唑类药物中进行体外抗乳腺癌活性的测试。为提高药物的溶解度和生物利用度，首先将芬苯达唑药物制成盐酸盐、甲磺酸盐和硫酸盐等散剂，使用ph试纸法检测药盐溶液的ph值，并通过人工目视法观察药盐的形态及颜色，以评价药物的品质；利用紫外分光光度法测定芬苯达唑药物的溶解度，同时将芬苯达唑可溶性盐药物用于体外乳腺癌细胞凋亡实验，以考察芬苯达唑类药物及其盐类的体外抗癌活性。为制备具有优良性能的载药脂质体，基于传统薄膜蒸发法，于碱性条件中洗涤脂质体，然后通过正交实验确定载药脂质体的最佳配方；使用透射电镜观察脂质体的形态，于粒度分析仪中测定脂质体的粒度和zeta电位，并使用紫外分光光度法检测脂质体的包封率，以分析本发明所制备的脂质体药物的性能。为考察芬苯达唑脂质体给药系统的抗乳腺癌活性，将芬苯达唑脂质体给药系统用于体外乳腺癌凋亡实验，同时结
合芬苯达唑散剂的抗乳腺癌活性，得到一种最佳的芬苯达唑类药物及其给药形式本发明与现有技术相比具有以下优点：
34.1、本发明通过开发传统芬苯达唑药物的新用途可显著缩短抗癌药物的研发和审批周期，同时降低药物的研发成本及风险。
35.2、脂质体作为一种药物剂型有着悠久的发展历史，它经历了比其他任何药物递送系统都更严格的研究，这为开发脂质体类药物提供了一个极好的机会。
36.3、本发明制备的脂质体药物可提高药物的稳定性并降低其毒性，具有良好的靶向作用和缓释作用，同时还具有给药途径多样、药物分布可控等优势。
37.4、使用脂质体作为抗乳腺癌药物的载体可以改善治疗效果，减少用药剂量，降低细胞毒性，减轻甚至避免变态和免疫反应，减轻病人痛苦。
附图说明
38.以下结合附图和实施例将本发明做进一步说明。
39.图1为400x显微镜下芬苯达唑脂质体的药物图像。
具体实施方式
40.下面通过对发明具体实施例的详细说明进一步阐述本发明，但实施例不是对本发明的限制。
41.实施例1
42.本发明提供一种技术方案：一种芬苯达唑类脂质体的制备方法，包括以下步骤：
43.步骤s1：将2.790g芬苯达唑粉末充分溶解于25ml四氢呋喃溶液中；
44.步骤s2：向步骤s1中加入9.45ml盐酸溶液，室温下使溶剂完全蒸发得到无定形、浅棕色物质；
45.步骤s3：将步骤s2得到的物质溶解于500ml乙醇中，在室温下蒸发乙醇，得到灰白色粉末，即得芬苯达唑盐酸盐；
46.芬苯达唑盐酸盐其活性筛选：
47.(1)ph检测
48.准确称取0.002g芬苯达唑盐酸盐，加入蒸馏水使其充分溶解，使用ph试纸测定。通过比较ph试纸的颜色确定芬苯达唑盐酸盐溶液的ph值。
49.(2)溶解度的测定
50.准确称取0.02g芬苯达唑盐酸盐，加1-2ml溶剂，加水至20ml，配制成1000μg/ml溶液，使用紫外分光光度计分别测定对应溶液的吸光度，分别以0、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml溶液溶度为横坐标，其相应吸光度为纵坐标绘制芬苯达唑药物的标准曲线，计算其回归曲线；再称取相同量的药盐，加入20ml蒸馏水使其溶解，使用相应波长的紫外分光光度计测定其吸光度，计算得到芬苯达唑盐酸盐的溶解度。
51.(3)乳腺癌细胞凋亡检测
52.将乳腺癌细胞以5
×
105个/孔的密度置于六孔培养皿中，加入2ml含10％fbs孵育24h；用pbs清洗细胞，吸去死细胞和代谢物，换不含血清的0.1％bsa酚红培养基；以不同的时间间隔培养和收获细胞，再次使用温热的pbs洗涤去除死细胞，并通过细胞计数器和台盼
蓝染料测定处理后的活细胞数量；乳腺癌细胞处理3天后，用温热的pbs洗涤细胞，胰蛋白酶消化，并通过离心机离心收获；用0.4％台盼蓝溶液染去细胞核浓缩或破碎的凋亡细胞；使用自动细胞计数器对细胞计数，使用活细胞成像仪观察细胞形态。
53.步骤s4：取0.4g胆固醇和0.6g大豆蛋白溶解于50ml氯仿中，加入0.1ml荧光剂，于超声波振荡器中溶解；
54.步骤s5：向步骤s4中加入适量芬苯达唑盐酸盐，震荡数分钟使药物完全溶解；
55.步骤s6：将步骤s5中的溶液在40-50℃的水浴中旋转蒸发15分钟，直至溶剂完全蒸发；步骤s7：用ph 9.0的碳酸钠缓冲溶液溶解脂质体膜并将步骤s6所得物质包封于脂质体膜中，即得芬苯达唑盐酸盐脂质体。
56.具体而言，所述步骤s5中的：向步骤s4中加入适量芬苯达唑盐酸盐，震荡数分钟使药物完全溶解，通过用正交实验确定芬苯达唑盐酸盐最佳质量。
57.一种根据权利要求1-3所述的芬苯达唑类脂质体的应用，所述芬苯达唑类脂质体用于治疗乳腺癌。
58.(1)脂质体的形态观察
59.将适量的芬苯达唑盐酸盐脂质体滴于载玻片上，在透射电镜下观察其形态。
60.(2)脂质体粒度和zeta电位的测定
61.取2ml芬苯达唑盐酸盐脂质体置于特殊的石英盘中，将石英盘放入粒度分析仪，测定脂质体的粒度和zeta电位。
62.(3)脂质体包封率的测定
63.准确称取0.02g芬苯达唑盐酸盐脂质，加1-2ml溶剂，加水至20ml，配制成1000μg/ml溶液，用紫外分光光度计分别测定溶液浓度为0、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml的吸光度，得到芬苯达唑标准曲线。取0.5ml药物脂质体混悬液放入专用离心管中，于4℃下密封3000r/min离心2h。取出上清液，加入0.8ml体积比dmso：甲醇为1:3的混合液，混合均匀后加入0.2ml三氯甲烷，摇匀，下层沉淀物使用上述相同方法处理。使用紫外分光光度计分别测定上清液和沉淀物的吸光度，根据标准曲线方程计算芬苯达唑盐酸盐脂质以外的药物的含量。
64.芬苯达唑盐酸盐和脂质体给药对乳腺癌的体外抑制活性对比研究
65.(1)乳腺癌细胞活性测定
66.将乳腺癌细胞以5
×
105个/孔的密度置于六孔培养皿中培养，加入2ml 10％fbs孵育24h。1天后，用pbs洗涤细胞，并更换培养基。3天后，以不同的时间间隔收获细胞，通过用温热的pbs温和洗涤去除死细胞，并通过自动细胞计数器计算活细胞数量，使用活细胞成像仪观察细胞形态。
67.(2)mtt检测
68.将细胞以6
×
104个/ml的密度置于96孔培养板中，使用二氧化碳培养箱培养3天，培养温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。样品浓度梯度分别为0、0.5、1、2、10、20μm，向每孔培养板中加入mtt试剂，使用elisa计数器在540nm处测定光密度。
69.实施例2
70.本发明提供一种技术方案：一种芬苯达唑类脂质体的制备方法，包括以下步骤：
71.步骤s1：将3.100g芬苯达唑粉末充分溶解于250ml四氢呋喃溶液中；
72.步骤s2：向步骤s1中加入0.683ml甲磺酸溶液，室温下使溶剂完全蒸发得到无定形、浅棕色物质；
73.步骤s3：将步骤s2得到的物质溶解于500ml乙醇中，在室温下蒸发乙醇，得到灰白色粉末，即得芬苯达唑甲磺酸盐；
74.芬苯达唑甲磺酸盐其活性筛选：
75.(1)ph检测
76.准确称取0.002g芬苯达唑甲磺酸盐，加入蒸馏水使其充分溶解，使用ph试纸测定。通过比较ph试纸的颜色确定芬苯达唑甲磺酸盐溶液的ph值。
77.(2)溶解度的测定
78.准确称取0.02g芬苯达唑甲磺酸盐，加1-2ml溶剂，加水至20ml，配制成1000μg/ml溶液，使用紫外分光光度计分别测定对应溶液的吸光度，分别以0、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml溶液溶度为横坐标，其相应吸光度为纵坐标绘制芬苯达唑药物的标准曲线，计算其回归曲线；再称取相同量的芬苯达唑甲磺酸盐，加入20ml蒸馏水使其溶解，使用相应波长的紫外分光光度计测定其吸光度，计算得到芬苯达唑甲磺酸盐的溶解度。
79.(3)乳腺癌细胞凋亡检测
80.将乳腺癌细胞以5
×
105个/孔的密度置于六孔培养皿中，加入2ml含10％fbs孵育24h；用pbs清洗细胞，吸去死细胞和代谢物，换不含血清的0.1％bsa酚红培养基；以不同的时间间隔培养和收获细胞，再次使用温热的pbs洗涤去除死细胞，并通过细胞计数器和台盼蓝染料测定处理后的活细胞数量；乳腺癌细胞处理3天后，用温热的pbs洗涤细胞，胰蛋白酶消化，并通过离心机离心收获；用0.4％台盼蓝溶液染去细胞核浓缩或破碎的凋亡细胞；使用自动细胞计数器对细胞计数，使用活细胞成像仪观察细胞形态。
81.步骤s4：取0.4g胆固醇和0.6g大豆蛋白溶解于50ml氯仿中，加入0.1ml荧光剂，于超声波振荡器中溶解；
82.步骤s5：向步骤s4中加入适量芬苯达唑甲磺酸盐，震荡数分钟使药物完全溶解；
83.步骤s6：将步骤s5中的溶液在40-50℃的水浴中旋转蒸发15分钟，直至溶剂完全蒸发；步骤s7：用ph 9.0的碳酸钠缓冲溶液溶解脂质体膜并将步骤s6所得物质包封于脂质体膜中，即得芬苯达唑甲磺酸盐脂质体。
84.具体而言，所述步骤s5中的：向步骤s4中加入适量芬苯达唑甲磺酸盐，震荡数分钟使药物完全溶解，通过用正交实验确定芬苯达唑甲磺酸盐最佳质量。
85.一种根据权利要求1-3所述的芬苯达唑类脂质体的应用，所述芬苯达唑类脂质体用于治疗乳腺癌。
86.(1)脂质体的形态观察
87.将适量的芬苯达唑甲磺酸盐脂质体滴于载玻片上，在透射电镜下观察其形态。
88.(2)脂质体粒度和zeta电位的测定
89.取2ml芬苯达唑甲磺酸盐脂质体置于特殊的石英盘中，将石英盘放入粒度分析仪，测定脂质体的粒度和zeta电位。
90.(3)脂质体包封率的测定
91.准确称取0.02g芬苯达唑甲磺酸盐，加1-2ml溶剂，加水至20ml，配制成1000μg/ml溶液，用紫外分光光度计分别测定溶液浓度为0、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml的吸光
度，得到芬苯达唑标准曲线。取0.5ml芬苯达唑甲磺酸盐脂质体混悬液放入专用离心管中，于4℃下密封3000r/min离心2h。取出上清液，加入0.8ml体积比dmso：甲醇为1:3的混合液，混合均匀后加入0.2ml三氯甲烷，摇匀，下层沉淀物使用上述相同方法处理。使用紫外分光光度计分别测定上清液和沉淀物的吸光度，根据标准曲线方程计算芬苯达唑甲磺酸盐脂质以外的药物的含量。
92.芬苯达唑甲磺酸盐和脂质体给药对乳腺癌的体外抑制活性对比研究
93.(1)乳腺癌细胞活性测定
94.将乳腺癌细胞以5
×
105个/孔的密度置于六孔培养皿中培养，加入2ml 10％fbs孵育24h。1天后，用pbs洗涤细胞，并更换培养基。3天后，以不同的时间间隔收获细胞，通过用温热的pbs温和洗涤去除死细胞，并通过自动细胞计数器计算活细胞数量，使用活细胞成像仪观察细胞形态。
95.(2)mtt检测
96.将细胞以6
×
104个/ml的密度置于96孔培养板中，使用二氧化碳培养箱培养3天，培养温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。样品浓度梯度分别为0、0.5、1、2、10、20μm，向每孔培养板中加入mtt试剂，使用elisa计数器在540nm处测定光密度。
97.实施例3
98.本发明提供一种技术方案：一种芬苯达唑类脂质体的制备方法，包括以下步骤：
99.步骤s1：将3.000g芬苯达唑粉末充分溶解于250ml四氢呋喃溶液中；
100.步骤s2：向步骤s1中加入10.15ml硫酸溶液，室温下使溶剂完全蒸发得到无定形、浅棕色物质；
101.步骤s3：将步骤s2得到的物质溶解于500ml乙醇中，在室温下蒸发乙醇，得到灰白色粉末，即得芬苯达唑硫酸盐；
102.芬苯达唑硫酸盐其活性筛选：
103.(1)ph检测
104.准确称取0.002g芬苯达唑硫酸盐，加入蒸馏水使其充分溶解，使用ph试纸测定。通过比较ph试纸的颜色确定芬苯达唑硫酸盐溶液的ph值。
105.(2)溶解度的测定
106.准确称取0.02g芬苯达唑硫酸盐，加1-2ml溶剂，加水至20ml，配制成1000μg/ml溶液，使用紫外分光光度计分别测定对应溶液的吸光度，分别以0、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml溶液溶度为横坐标，其相应吸光度为纵坐标绘制芬苯达唑药物的标准曲线，计算其回归曲线；再称取相同量的芬苯达唑硫酸盐，加入20ml蒸馏水使其溶解，使用相应波长的紫外分光光度计测定其吸光度，计算得到芬苯达唑硫酸盐的溶解度。
107.(3)乳腺癌细胞凋亡检测
108.将乳腺癌细胞以5
×
105个/孔的密度置于六孔培养皿中，加入2ml含10％fbs孵育24h；用pbs清洗细胞，吸去死细胞和代谢物，换不含血清的0.1％bsa酚红培养基；以不同的时间间隔培养和收获细胞，再次使用温热的pbs洗涤去除死细胞，并通过细胞计数器和台盼蓝染料测定处理后的活细胞数量；乳腺癌细胞处理3天后，用温热的pbs洗涤细胞，胰蛋白酶消化，并通过离心机离心收获；用0.4％台盼蓝溶液染去细胞核浓缩或破碎的凋亡细胞；使用自动细胞计数器对细胞计数，使用活细胞成像仪观察细胞形态。
109.步骤s4：取0.4g胆固醇和0.6g大豆蛋白溶解于50ml氯仿中，加入0.1ml荧光剂，于超声波振荡器中溶解；
110.步骤s5：向步骤s4中加入适量芬苯达唑硫酸盐，震荡数分钟使药物完全溶解；
111.步骤s6：将步骤s5中的溶液在40-50℃的水浴中旋转蒸发15分钟，直至溶剂完全蒸发；步骤s7：用ph 9.0的碳酸钠缓冲溶液溶解脂质体膜并将步骤s6所得物质包封于脂质体膜中，即得芬苯达唑硫酸盐脂质体。
112.具体而言，所述步骤s5中的：向步骤s4中加入适量芬苯达唑硫酸盐，震荡数分钟使药物完全溶解，通过用正交实验确定芬苯达唑硫酸盐最佳质量。
113.一种根据权利要求1-3所述的芬苯达唑类脂质体的应用，所述芬苯达唑类脂质体用于治疗乳腺癌。
114.(1)脂质体的形态观察
115.将适量的芬苯达唑硫酸盐脂质体滴于载玻片上，在透射电镜下观察其形态。
116.(2)脂质体粒度和zeta电位的测定
117.取2ml芬苯达唑硫酸盐脂质体置于特殊的石英盘中，将石英盘放入粒度分析仪，测定脂质体的粒度和zeta电位。
118.(3)脂质体包封率的测定
119.准确称取0.02g芬苯达唑硫酸盐，加1-2ml溶剂，加水至20ml，配制成1000μg/ml溶液，用紫外分光光度计分别测定溶液浓度为0、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml的吸光度，得到芬苯达唑标准曲线。取0.5ml药物脂质体混悬液放入专用离心管中，于4℃下密封3000r/min离心2h。取出上清液，加入0.8ml体积比dmso：甲醇为1:3的混合液，混合均匀后加入0.2ml三氯甲烷，摇匀，下层沉淀物使用上述相同方法处理。使用紫外分光光度计分别测定上清液和沉淀物的吸光度，根据标准曲线方程计算芬苯达唑硫酸盐脂质以外的药物的含量。
120.芬苯达唑硫酸盐和脂质体给药对乳腺癌的体外抑制活性对比研究
121.(1)乳腺癌细胞活性测定
122.将乳腺癌细胞以5
×
105个/孔的密度置于六孔培养皿中培养，加入2ml 10％fbs孵育24h。1天后，用pbs洗涤细胞，并更换培养基。3天后，以不同的时间间隔收获细胞，通过用温热的pbs温和洗涤去除死细胞，并通过自动细胞计数器计算活细胞数量，使用活细胞成像仪观察细胞形态。
123.(2)mtt检测
124.将细胞以6
×
104个/ml的密度置于96孔培养板中，使用二氧化碳培养箱培养3天，培养温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。样品浓度梯度分别为0、0.5、1、2、10、20μm，向每孔培养板中加入mtt试剂，使用elisa计数器在540nm处测定光密度。
125.zata电位法测得粒径的大小见下表：
[0126][0127]
参见图1，图1为400倍显微镜下芬苯达唑脂质体的药物图像，图片中第一排最左侧为标号1，第三排最右侧为标号9，图1中图片标号1和图片标号9是我们的理想结果，其中图片标号1粒径较小；图片标号3、4、5、6、7是不溶性白色药物颗粒。
[0128]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。