陈皮醇提物及其在治疗嗜酸性粒细胞食管炎中的应用

1.本发明涉及药物提取物的制备及其应用，具体为一种陈皮醇提物及其在治疗嗜酸性粒细胞食管炎中的应用。


背景技术：

2.嗜酸性粒细胞性食管炎(eoe)是一种与食物抗原诱发相关的慢性炎症性食管疾病，可同时伴发哮喘等其他过敏性疾病，其病理生理学涉及过敏原驱动的th2 t细胞免疫反应。1978年首次将eoe确定为一种独立的疾病，其主要组织学表现为食管黏膜层被大量的嗜酸性粒细胞(eosinophil，简称eos)浸润，以食管功能障碍为主要临床症状。该病可发生于各个年龄段，50岁以下成人及儿童较为常见，尤其是儿童发病率较高，男性多于女性(3～4∶1)。成人患者临床症状为吞咽困难、食管狭窄、食物嵌顿以及反流样症状；儿童则主要表现为拒食和营养不良，严重影响患者及其家人的生活质量，部分患者的社会活动受到一定的限制。迄今为止我国仍未有eoe流行病学资料，但随着医师对该病的认识越来越深入，临床上报道该病例的研究在我国也呈现出明显增加的趋势。
3.eoe诱发因素较多，如接触特定的食物过敏原或空气传播的过敏原，一般认为其发病机制与其他特应性疾病如食物过敏、哮喘、变应性鼻炎和特应性皮炎等一致，是由th2免疫应答引发的。eoe的炎症特征是浸润食管粘膜的t细胞和肥大细胞数量增加，以及il-5和tnf-α的高水平表达，以th2免疫反应为显著特征。
4.mapk是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者，是一组能被不同的细胞外刺激的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，不仅调节th1/th2分化、嗜酸性粒细胞趋化因子的表达，参与免疫反应，活化后可加快生成炎症细胞因子，从而加剧炎症反应，其中p38介导炎症、凋亡等，常用作开发抗炎药物的经典靶位。 tgf-β表达增加是纤维化的常见途径，tgf-β的生物学功能研究主要在炎症、组织修复等方面，近年来发现其对细胞的生长分化和免疫功能都有重要的调节作用。tgf-β1属于调节细胞生长和分化的tgf-β超家族成员之一，而smads 蛋白家族是细胞内重要的信号传导和调节因子，作为tgf-β1的调解中介，可以引起许多部位的纤维化增殖。tgf-β/smad信号通路是tgf-β发挥生物学效应的主要经典通路，除此之外，tgf-β还能以非smad信号途径的方式激活mapk 信号通路。目前对eoe的分子机制和免疫病理学的认识尚存在许多空白，但大量临床结果表明eoe触发嗜酸性粒细胞(eos，eosinophil)渗入食管，导致炎症、重塑和纤维化。以上三个亚家族很有可能参与了eoe的发病机制，抑制该通路中p38 mapk、tgf-β1和smad3蛋白的表达，可有效地减少炎症因子释放，可能是治疗eoe的潜在通路。
5.eoe的发病机制至今尚未完全明确，目前尚无法根治，当前治疗的目标为改善患者临床症状，预防并发症(尤其是食道的纤维增生性狭窄)，提高患者的生活质量。针对其发病机制，eoe治疗方法主要为饮食疗法和药物治疗。饮食治疗通过避免食物中的过敏原可在一定程度上缓解与eoe发病机制相关的炎症，需要对患者的日常生活和饮食习惯做出较大改变，往往存在依从性差的问题。目前尚无fda批准的治疗eoe的特异性药物，因其发病机制与
哮喘、特应性皮炎等过敏性疾病类似，故而临床上治疗eoe的一线药物是局部(吸入)/口服(全身)糖皮质激素类药物。据报道激素治疗可在一定程度上缓解食管炎症，但停药后易复发，但也有研究表明大多数接受外用糖皮质激素治疗的患者最终无法达到食管功能的完全正常，如果长期接受激素治疗，反而会再出现加重食管中嗜酸性粒细胞的增多；而且患者(尤其是儿童患者)不得不面临长期的糖皮质激素治疗及无法避免的激素不良反应(如青少年发育迟缓，口咽部/食管念珠菌病、骨密度异常、青光眼、高血糖和其他拮抗作用等)。
6.因此，研究具有疗效确切且安全的治疗嗜酸性粒细胞性食管炎的新型药物是一个亟待解决的问题。


技术实现要素：

7.为了解决上述现有技术中存在的不足，本发明提供了一种陈皮醇提物及其制备方法，其通过抑制th2型炎症因子，并降低tgf-β表达来达到治疗eoe的目的，在治疗嗜酸性粒细胞食管炎中的应用具备良好的治疗效果。
8.本发明的目的是这样实现的：
9.一种陈皮醇提物，其制备方法如下：称取50g陈皮，剪碎，置于500ml圆底烧瓶，70％乙醇浸泡2h，采取10倍量溶媒在常压条件下分别提取三次，提取时间依次为2h、1.5h、1h，用8层纱布过滤，合并提取液，减压浓缩至无醇味，真空冷冻干燥后-20℃保存；平行提取5次，提取物得率范围为36.91
±
0.64％， rsd《5.00％，重复性良好。
10.所述的陈皮醇提物的应用于治疗嗜酸性粒细胞食管炎。
11.积极有益效果：现有的研究认为eoe与食物和环境过敏原密切相关，除遗传和自然环境外，th2型免疫异常(亢进)在eoe的发生和发展中发挥了关键作用，并与ige介导的ⅰ型变态反应紧密相关。本发明通过实验证实了花生过敏原和皮肤刺激是诱导实验性eoe的必要条件。并证明了th2细胞因子白细胞介素-4(il-4)、il-5、il-13和tnf-α在eoe发病机制中的关键作用，以及tgf-β、 mapk等炎症信号通路也参与了eoe的发病过程，本发明制备的陈皮醇提物可通过抑制th2型炎症因子和降低特异性ige的产生，有效降低tgf-β1，smad-3 等蛋白表达从而达到治疗嗜酸性粒细胞食管炎的目的。
12.(1)本发明提供了70％陈皮醇提物制备方法及hplc检测方法，该含量测定方法重复性好，明确了治疗嗜酸性粒细胞食管的药效物质基础，其主要成分为橙皮苷、川陈皮素、桔皮素。
13.(2)本发的陈皮醇提物可用于治疗嗜酸性粒细胞性食管炎，这一发现弥补了目前嗜酸性粒细胞性食管炎治疗药物匮乏的缺陷。
14.(3)本发明为了验证陈皮醇提物的治疗eoe的效果，提供了一种改进的eoe 小鼠模型，通过该方法使得小鼠患上嗜酸性粒细胞性食管炎，该小鼠模型可基本满足人类eoe临床症状和病理表现，并采用陈皮醇提物对其进行治疗，治疗结果证明了陈皮醇提物对嗜酸性粒细胞性食管炎具有一定的治疗效果，并显示出良好的安全性。
附图说明
15.图1为本发明中嗜酸性粒细胞性食管炎小鼠模型建立流程图；
16.图2为本发明中陈皮醇提物薄层色谱鉴别图；
17.图3为本发明中混合标准品和陈皮醇提物高效液相色谱图；
18.图4为本发明中小鼠的表观指征图；
19.图5为本发明中小鼠在试验期间的体重变化图；
20.图6为本发明中各组小鼠在末次激发后40min内的体温变化图；
21.图7为本发明中各组小鼠在末次激发后的过敏指数变化图；
22.图8为本发明中各组小鼠在治疗结束时的脾脏、肺脏、肾脏指数变化柱状图；
23.图9各组小鼠血清在治疗结束时il-4、il5和tnf-α水平(th2细胞因子)的示意图；
24.图10各组小鼠血清在治疗结束时ifn-γ(th1细胞因子)和il-10(treg细胞因子)水平的示意图；
25.图11为本发明中各组小鼠的血清在治疗结束时peanut-s-ige水平的示意图；
26.图12为本发明中各组小鼠在治疗结束时食管、肺和小肠组织h&e染色图；
27.图13为发明中各组小鼠治疗结束时食管组织中tgf-β1水平的示意图。
28.图14发明中各组小鼠食管组织tgf-β1、smad3和p38 mapk及其磷酸化蛋白表达的示意图。
具体实施方式
29.下面结合附图及具体实施方式，对本发明做进一步的说明：
30.多种研究报道，过敏反应可通过气道、皮肤或胃肠道等途径产生。本实验拟通过典型的花生蛋白食物过敏经皮肤与胃肠道等途径建立小鼠eoe模型。
31.第一方面
32.1.陈皮醇提物的制备
33.称取50g陈皮，剪碎，置于500ml圆底烧瓶，70％乙醇浸泡2h，采取10倍量溶媒在常压条件下分别提取三次，提取时间依次为2h、1.5h、1h，用8层纱布过滤，合并提取液，减压浓缩至无醇味，真空冷冻干燥后-20℃保存。平行提取5次，提取物得率范围为36.91
±
0.64％，rsd《5.00％，重复性良好。
34.1.1薄层色谱鉴别
35.供试品溶液：取陈皮醇提物粉末加甲醇配制为6mg/ml的供试溶液，超声 20分钟，0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液。对照品溶液：称取橙皮苷、川陈皮素和桔皮素对照品适量，加甲醇分别配制成相应的饱和溶液。
36.依据《中国药典》(通则0502)中陈皮饮片项下薄层色谱方法，吸取上述四种溶液，毛细管分别点于同一硅胶g板上，两种展开剂分别展开，最后取岀晾干，均匀喷洒三氯化铝试液，置紫外光灯下检视拍照。
37.1.2高效液相色谱条件
38.1.2.1色谱条件与系统适用性试验
39.以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。以乙腈为流动相a，以水为流动相b，按下表中的条件进行梯度洗脱，全波长检测。
40.表1.3色谱条件
[0041][0042]
(2)对照品溶液、供试品溶液的制备
[0043]
取橙皮苷对照品、川陈皮素对照品、橘皮素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含橙皮苷0.4mg、川陈皮素25μg、橘皮素15μg的混合溶液，即得。
[0044]
取本品粗粉(过二号筛)约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率300w；频率40khz)45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0045]
(3)测定法
[0046]
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，上样，测定，即得。
[0047]
第二方面
[0048]
1实验动物
[0049]
spf级balb/c小鼠60只，7-8周龄，雌，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物许可证号scxk(鲁)2019003，实验单位使用许可证号syxk(豫) 200-0004。饲养于申请人实验动物房。
[0050]
2药物、试剂及仪器
[0051]
2.1药品和试剂
[0052]
[0053][0054]
2.2仪器
[0055][0056]
花生蛋白粗提液的制备：取鲜花生烘干去皮，花生仁用粉碎机打至粉末，置于烧杯用预冷丙酮100ml浸泡，于4℃冰箱过夜，去脂直至上清液澄清。风干丙酮后，加入pbs缓冲液提取蛋白，4℃冰箱浸泡24h，1500r
·
min-1离心20min，去除上层脂肪下层残渣，留取中间层，反复离心取上清，即是花生蛋白粗提液(ppe)。采用bca蛋白定量试剂盒测定ppe的浓度，具体操作根据试剂盒说明书进行。冻干后-20℃保存。
[0057]
ppe致敏液：根据蛋白定量结果称取24mg ppe、量取240mg铝佐剂(原液40 mg/ml)溶至12ml pbs中，充分溶解现用现配。
[0058]
ppe软膏混合物：将ppe与卡泊三醇软膏按重量比1:100均匀混合，即每20mg 的软膏混合物中含ppe 0.2mg。
[0059]
ppe激发液：根据蛋白定量结果称取300mg ppe溶至12ml pbs中，充分溶解现用现配。最后一次大剂量激发液为600mg ppe溶至12ml pbs中。
[0060]
陈皮醇提物：将3项下方法制备的etp溶解，使其浓度分别为800mg/kg、400 mg/kg、200mg/kg。
[0061]
地塞米松溶液：依据药品说明书，成人开始剂量为一次0.75～3.00mg，一日2～4 次，维持量约一日0.75mg(1片)。根据体表面积折算法，小鼠和人的等效剂量比9.1进行换算，给药前期(前一周)给予1mg/kg，给药后期0.2mg/kg持续给药。
[0062]
3方法
[0063]
3.1分组、模型制备及给药
[0064]
如图1所示，本次实验，实验动物选用balb/c雌性小鼠，致敏原为ppe，致敏方式采用腹腔注射与经皮皮损相结合，激发方式选择食管灌注激发。造模方法参照文献的方法并进行改良建立模型，如图1所示。
[0065]
(1)基础致敏阶段：分别在0、1、2、3周免疫建立，除空白组之外，其余组的小鼠均腹腔(i.p.)注射0.2ml 2mg/ml的致敏液，每周1次，共4次；同时给予空白组小鼠等量pbs缓冲液。
[0066]
(2)经皮致敏阶段：除空白组之外，分别在1-7、21-28天，每次连续一周涂以 20mg ppe软膏混合物；同时给予空白组小鼠等量卡泊三醇软膏。
[0067]
(3)局部刺激阶段：第4次腹腔注射后，间隔7天，于第28天进行局部刺激阶段。除空白组之外，其余各组的每只小鼠食管灌注进行刺激，每次给予0.2ml 25mg/ml的ppe激发液，每周1次，共5次；同时给予空白组小鼠等量pbs 缓冲液。
[0068]
(4)造模评价：基础致敏阶段共进行4次，为了初步掌握建模是否成功，于第三周下颌采血检测小鼠血清中特异性ppe-sige，根据检测结果按随机数字表法分为6组，分为空白组、模型组、地塞米松组、陈皮醇提物高、中、低剂量组。第57天处死前给予每只0.2ml 25mg/ml大剂量激发液，观察记录各项指标实验结束。
[0069]
正常组(naive)：pbs缓冲液；模型组(sham)：pbs缓冲液；地塞米松组(dex)：地塞米松溶液；给药组：陈皮醇提物高剂量组(etp-h，浓度为800 mg/kg)、中剂量组(etp-m，浓度为400mg/kg)及低剂量组(etp-l，浓度为 200mg/kg)。
[0070]
3.2体重及表观体征变化
[0071]
末次激发(第56天)后，采用盲法观察记录小鼠行为学变化，即过敏指数 (无症状0分；骚扰头和鼻1分；腹泻、眼周及嘴部水肿、毛发直立、活动频率下降2分；口尾紫绀、呼吸困难3分；刺激后无反应或仅有轻度反应、震颤及痉挛4分；死亡5分)。
[0072]
并采用红外温度计记录小鼠激发后40min内的体温变化。
[0073]
3.3细胞因子检测
[0074]
表观观察结束后，取出小鼠，经眼眶静脉丛取血，12000rpm/min离心10min 分离血清。根据elisa试剂盒操作说明，检测小鼠血清中ppe-s-ige(花生蛋白特异性ige)、il-4、il-5、tnf-α、ifn-γ、il-10的水平。
[0075]
3.4 he染色观察肺组织病理学变化
[0076]
处死小鼠，取食道、肺、小肠组织并固定在4％多聚甲醛中，进行标本石蜡包埋和切片，病理标本进行苏木精-伊红(he)染色。观察各组织中炎症渗透，组织损坏，肠道上皮细胞绒毛变形和肠道隐窝丢失病理变化等。
[0077]
3.5 western blot检测食管组织tgf-β1、smad3和p38 mapk蛋白水平
[0078]
小鼠食管组织在样品缓冲液中溶解后变性，由bca蛋白试剂盒测定蛋白浓度，由sds-page分离等量的蛋白质样品。分离后蛋白质被转移到pvdf膜上。再用5％脱脂奶粉溶液封闭，并在4℃下与抗体共同孵育过夜。冲洗后，将膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔ⅱ抗在室温下孵育2h，用ecl化学发光检测试剂检测蛋白条带。
[0079]
3.6免疫组化
[0080]
石蜡切片进行免疫组化分析。即经脱蜡固定后，加入tgf-β1抗体和ⅱ抗孵育，之后染色封片。
[0081]
4统计学处理
[0082]
采用spss 19.0软件进行统计学分析。所有数据采用平均数
±
标准差(mean
ꢀ±
sd)表示。多组间比较采用单因素方差分析one-way anova)，两两间比较采用t检验。以p《0.05为差异有统计学意义。
[0083]
结果
[0084]
1陈皮醇提物质量控制
[0085]
经薄层色谱法鉴别，展开结果如图2所示，(图中1桔皮素对照品，2川陈皮素对照品，3橙皮苷对照品，4陈皮醇提物)，图a为紫外灯365nm下检视图，图b为紫外灯354nm下检视图，为了斑点更加清晰可见，对图像进行灰化处理，可看出供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
[0086]
如图3所示陈皮70％醇提物(图中为：1橙皮苷，2川陈皮素，3桔皮素)，经 hplc条件将混合对照品溶液及供试品溶液分别进样5μl，记录25min内的色谱峰保留时间和峰面积，由峰面积可知其中橙皮苷、川陈皮素、桔皮素为其主要成分。
[0087]
2表观指标
[0088]
过敏反应是由肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放的介质所触发的系统性的，甚至危及生命的疾病，其通过过敏(ige介导)或非过敏(非ige介导)机制激活。这是一个快速发展的多系统过程，涉及皮肤、肺、胃肠和心血管系统。在临床中，食物过敏往往是由ige介导，而eoe多与食物过敏相关。
[0089]
ppe诱导的eoe小鼠模型具有食物过敏的典型特征，并能很好的模拟嗜酸性粒细胞性食管炎的临床典型症状和病理变化。与阴性对照组小鼠相比，模型组小鼠在第二次激发后先后开始表现出动作缓慢、毛发光泽差和粪便疏松症状，其中部分小鼠出现明显的弓背、俯卧不动、毛发竖立、唇部肿胀等症状(如图4 所示)。
[0090]
模型组和治疗组小鼠在各次激发后均出现不同程度的抓鼻挠脸、腹泻、紫绀等过敏表现；而阴性对照组小鼠除有偶尔挠鼻外均无上述过敏的行为表现。在末次激发后，记录了15min内小鼠的出现的过敏行为学表现(并按照半定量评分进行计分，以出现最严重的行为学进行评分)，其具体的评分结果如图4 所示。与阴性对照组相比，模型组小鼠过敏症状评分明显增加，平均分为2分，具有极显著性差异(p《0.01)；经陈皮醇提物治疗后，过敏症状也得到一定程度的缓解，其高中低剂量组平均评分分别为0.71，1和1.33，显示出剂量依赖性。高剂量组小鼠过敏评分显著低于模型组(sham)，并具有统计学差异(p《0.01)，与地塞米松作用相当，如图4所示。
[0091]
图5展示了各种小鼠在整个实验期间的体重变化情况，模型组小鼠从第一次激发后(28天)体重开始出现明显的降低，每次激发后体重均又出现不同程度的降低，至实验结
束时，模型组小鼠的平均体重下降了2.71g。ppe激发后，模型组小鼠体重持续降低，并且随着激发的进行降低趋势并无缓解，末次模型组小鼠相较于阴性对照组明显下降5.72g(p《0.01)。
[0092]
激发后各陈皮醇提物治疗组的体重也都出现了不同程度的降低，但其体重减轻趋势明显得到遏制，并显示出剂量依赖性，高剂量组的体重减轻趋势得到显著抑制。在前3次激发时，体重仍略有增加，在第4、5次(末次)激发后，试验结束时体重比初始体重仅降低了0.85、0.80g。中剂量组、低剂量组也是在最后两次激发时出现明显的体重降幅。到治疗终点时，地塞米松组(p《0.01)，陈皮醇提物高、中剂量组(p《0.05)小鼠体重减轻与模型组小鼠具有显著性差异，而陈皮醇提物高、中剂量组与地塞米松组无统计学差异，如图5所示。
[0093]
如图6中所示，除阴性对照组外，其他各组小鼠于激发后40min内均出现不同程度的体温下降，并于10-30min后体温开始有所回升。如图6中所示，模型组小鼠体温降低最为明显，30min时较基础体温降低了2.3℃；经陈皮醇提物治疗后，体温显著降低的程度得到一定程度的缓解，高剂量组30min时仅降低了0.4℃，并于40min出现明显体温回升，较基础体温仅降低0.07℃。
[0094]
由于嗜酸性粒细胞食管炎为自身免疫性疾病，在实验过程中模型组小鼠出现肺部的炎症及脾脏肿大的现象，其肺脏系数和脾脏系数均显著增加(p＜0.001)；陈皮醇提物治疗组的肺系数和脾系数也较阴性对照组小鼠升高，但是相较于模型组小鼠脾脏系数和肺脏系数有不同程度降低(p＜0.05)，陈皮醇提物可以在一定程度上减轻脾脏及肺脏的炎症，并能在一定程度上改善体内的免疫平衡。
[0095]
模型组肾脏指数较阴性对照组出现一定程度增大，但各组间无统计学差异，说明该eoe动物模型或有使肾脏肿大的趋势，陈皮醇提物可轻微减轻其肾脏重大的趋势，如图8所示。
[0096]
5.3生化指标
[0097]
eoe的发病机制至今尚未完全明确，多数研究者认为eoe是一种以th2型免疫反应为主的疾病，th2细胞因子产物il-4，il-5及嗜酸性粒细胞效应因子均在eoe发病机制中发挥关键作用。因此我们检测了各组小鼠血清中的il-4、il-5、 tnf-α，ifn-γ等细胞因子的水平。
[0098]
如下图9所示，与阴性对照组小鼠相比，模型组小鼠血清中的tnf-α、il-4 和il-5细胞因子的浓度均显著升高(p＜0.01)；皮质激素类药物地塞米松可明显降低各炎症细胞因子的水平，使il-4，il-5和tnf-α细胞因子水平分别下降了66.4％，51.2％和77.7％。与模型组相比，陈皮醇提物组治疗中上述各炎症因子均出现不同程度的降低，并具有剂量依赖性，高剂量组使il-4，il-5和tnf-α细胞因子水平分别平均降低了61.0％，55.6％和61.5％，与地塞米松组降低的水平相当，如图9所示。
[0099]
如下图10所示，与阴性对照组小鼠相比，模型组小鼠血清中的ifn-γ和 il-10含量均显著降低(p《0.01)；地塞米松可使ifn-γ和il-10细胞因子水平分别升高了28.5％和42.0％。陈皮醇提物组治疗后ifn-γ和il-10抗炎细胞因子水平也明显提高，也具有剂量依赖性。高中低剂量的陈皮醇提物分别使ifn-γ水平提高了26.8％，31.9％和32.5％，使il-10细胞因子水平分别提高了36.6％，17.7％和13.8％。
[0100]
ige是ige介导的相关过敏性疾病发病机制中的关键免疫球蛋白，尽管尚无数据能
证明ige在eoe的发病过程中发挥的具体作用，但是ige的水平对于 eoe病人嗜酸性粒细胞的预后及严重程度密切相关。采用elisa法检测花生特异性ige(peanut-specific-ige，peanut-s-ige)水平，如下图11所示。与阴性对照组相比，模型组小鼠血清peanut-s-ige显著升高，平均浓度达到了369.89 ng/ml，具有极显著性统计学差异(p《0.0001)。经过陈皮醇提物治疗后其 peanut-s-ige出现不同程度的下降，高中低剂量组ige的水平分别降低了53.5％， 43.5％和26.1％，并具有剂量依赖性。
[0101]
5.4病理切片
[0102]
病理切片可以直观的评价eoe模型小鼠的病理变化。图12为各组小鼠在治疗结束时食管(a)、肺(b)和小肠(c)组织中的h&e病理切片。地塞米松组为0.5mg/kg地塞米松组；高中低剂量分别为800mg/kg、400mg/kg和200mg/kg 的陈皮提取物。
[0103]
食管组织的h&e染色切片结果(图12中a)显示：阴性对照组小鼠食管结构清晰，食管壁均匀，周围偶见少许炎症细胞浸润，食管内未见充血。模型组小鼠食管组织结构异常，基底细胞增生，结缔组织增生，偶见充血；固有层乳头、锭突延长，上固有层存在纤维化，且有脱落趋势；嗜酸性粒细胞少量沁润，且细胞核呈明显分叶状，基本符合eoe临床病理改变；地塞米松组、陈皮醇提物高剂量组增生状况以及纤维化明显减轻，其分叶状细胞核减少，且无充血现象，低剂量组有一定改善，但无明显差异。
[0104]
肺组织的h&e染色切片结果(图12中b)显示：阴性对照组小鼠肺组织气道结构清晰，肺泡完整，肺泡间隔纤细且均匀，肺泡壁偶见充血，气管周围偶见少许炎症细胞浸润，气管内未见上皮细胞脱落。模型组小鼠肺组织气道结构异常，肺泡结构基本消失，肺泡间隔明显增厚，肺泡壁充血严重，气道管腔狭窄，内有散落的支气管上皮细胞及渗出的淋巴细胞，同时气管周围伴有大量炎性细胞浸润；经陈皮醇提物治疗后，肺组织病理有所改善。
[0105]
小肠组织的h&e染色切片结果(图12中c)显示：阴性对照组小鼠小肠组织结构清晰，粘膜下层偶见少许炎症细胞浸润，未见结构疏松。模型组小鼠肠组织结构异常，表现为肠黏膜绒毛不齐、长短不一；伴有明显的、大量的嗜酸性粒细胞浸润；呈现一定程度上的肠壁增厚，杯状细胞增多等。经陈皮醇提物治疗后，高剂量组小肠组织肠绒毛恢复正常，且无明显炎症细胞浸润，陈皮醇提物中、低剂量组有所改善，但仍存在肠黏膜损坏明显，上皮层细胞脱落等现象。
[0106]
如图12中所示，tgf-β1具有调节免疫反应和致纤维化的功能，是介导组织炎症、调节细胞外基质沉积最关键的细胞因子。tgf-β1细胞染色定位于胞质内，呈黄棕色，弥漫状分布为tgf-β1的阳性表达。tgf-β1在模型组小鼠食管组织中阳性表达水平较高，空白组小鼠阳性表达较低，治疗后，地塞米松组、陈皮醇提物组tgf-β1的阳性表达量显著下降。
[0107]
5.5陈皮醇提物对eoe模型小鼠模型食管组织tgf-β1、smad3和p38 mapk 蛋白水平
[0108]
取每组食管组织提取蛋白，定量后进行western blot实验，结果如图14所示。与空白组相比，模型组小鼠食管组织中tgf-β1、p-smad3和p-p38 mapk 蛋白表达量均显著上升，有统计学差异(p《0.05)。与模型组比较，陈皮醇提物高、中剂量组中tgf-β1、p-smad3和p-p38 mapk蛋白的表达量均呈现不同程度降低(p《0.05)。
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如图13所示，目前普遍认为eoe与食物和环境过敏原有关，遗传和免疫异常(亢进)等参与了本病的发生和发展，认为eoe系由ige介导的ⅰ型变态反应和/或非ige介导，有实验证实，th2细胞因子信号转导是诱导实验性eoe的必要条件。证明了th2细胞因子白细胞介素
(il)-4、il-5、il-13和tnf-α在eoe 发病机制中的关键作用，以及其他细胞因子如tgf-β、mapk等通路参与。
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现有的研究认为eoe与食物和环境过敏原密切相关，除遗传和自然环境外， th2型免疫异常(亢进)在eoe的发生和发展中发挥了关键作用，并与ige介导的ⅰ型变态反应紧密相关。本发明通过实验证实了花生过敏原和皮肤刺激是诱导实验性eoe的必要条件。并证明了th2细胞因子白细胞介素-4(il-4)、il-5、 il-13和tnf-α在eoe发病机制中的关键作用，以及tgf-β、mapk等炎症信号通路也参与了eoe的发病过程，本发明制备的陈皮醇提物可通过抑制th2型炎症因子和降低特异性ige的产生，有效降低tgf-β1，smad-3等蛋白表达从而达到治疗嗜酸性粒细胞食管炎的目的。
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其具体的治疗结果如下：
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eoe模型小鼠在第二次激发后先后开始出现骚扰头鼻、毛发直立、弓背等明显的全身过敏症状，过敏指数评分显著升高(p《0.01)；血清中花生蛋白特异性ige、igg1和典型th2型细胞因子il-4、il-5、tnf-α等的水平显著升高 (p《0.01)，th1型细胞因子ifn-γ水平和抗炎细胞因子il-10水平明显降低(p《0.01)，与阴性对照组小鼠相比，模型组小鼠出现了典型的th1/th2失衡；食管、肺、肠组织病理明显损伤，表现为结缔组织增生、纤维化、嗜酸性粒细胞浸润等；食管组织中p-p38 mapk、tgf-β1和p-smad3蛋白表达量升高 (p《0.05)，以及tgf-β1阳性表达(p《0.01)。
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与模型组小鼠相比，陈皮醇提物治疗后能有效缓解激发期间小鼠体重减轻、体温降低和过敏指数升高等情况；降低小鼠血清中ppe-s-ige、igg1、il-4、il-5、 tnf-α等的水平，升高小鼠血清中il-10、ifn-γ水平，有效调节th1/th2免疫失衡情况；对食管、肺、肠组织病理损伤有一定缓解；陈皮醇提物能够抑制ppe 诱导的eoe模型小鼠食管组织中p38 mapk和tgf-β通路的激活，使 phosphorylated-p38 mapk、phosphorylated-tgf-β1和phosphorylated-smad3的表达下降，其高剂量的陈皮醇提物的疗效与地塞米松的疗效相当。对花生蛋白诱导的嗜酸性粒细胞性食管炎具有一定的干预作用。
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(1)本发明提供了70％陈皮醇提物制备方法及hplc检测方法，该含量测定方法重复性高，明确了治疗嗜酸性粒细胞食管的药效物质基础，其主要成分为橙皮苷、川陈皮素、桔皮素。
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(2)本发的陈皮醇提物可用于治疗嗜酸性粒细胞性食管炎，这一发现弥补了目前嗜酸性粒细胞性食管炎治疗药物匮乏的缺陷。
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(3)本发明为了验证陈皮醇提物的治疗eoe的效果，提供了一种改进的eoe 小鼠模型，通过该方法使得小鼠患上嗜酸性粒细胞性食管炎，该小鼠模型可基本满足人类eoe症状和病理表现，并采用陈皮醇提物对其进行治疗，治疗结果证明了陈皮醇提物对嗜酸性粒细胞性食管炎具有一定的治疗效果，并显示出良好的安全性。