一种蜂胶黄酮提取物及其制备方法与应用

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种蜂胶黄酮提取物及其制备方法与应用。


背景技术：

2.产气荚膜梭菌诱导的坏死性肠炎是一种严重危害家禽健康的胃肠道疾病。临床数据证实产气荚膜梭菌诱导的坏死性肠炎可造成肉鸡高达30%以上的死亡率，同时亚临床症状的产气荚膜梭菌诱导的坏死性肠炎可引起肉鸡慢性肠道黏膜损伤，营养消化吸收率下降，体重减轻、耗料增重比增加，从而降低肉鸡的生产力，造成巨大的经济损失。过去相当长时间内，预防和控制产气荚膜梭菌诱导的坏死性肠炎的发生主要是通过饲料中添加抗生素，但是随着抗生素抗性的增强，以及抗生素的限制使用，使得近年来全球范围内家禽产气荚膜梭菌诱导的坏死性肠炎的爆发率大大增加。从安全、经济、高效、可持续角度出发，开发抗生素替代品，探索防治家禽产气荚膜梭菌诱导的坏死性肠炎的新方法，是当前家禽健康研究的大趋势。
3.蜂胶是由西方蜜蜂的工蜂采集植物树芽、树脂等与其上颚腺、蜡腺分泌物混合形成的胶粘性物质，具有多种药理活性，现已收录于《中华人民共和国药典》（2015版，一部）。蜂胶在畜牧兽医生产实践中也有着广泛的应用。研究表明蜂胶对家禽有很好的抗应激、修复黏膜、提升免疫力、平衡肠道菌群、保护肝脏、促进生长等积极作用。蜂胶的化学成分和药理活性受采集蜂种、植物来源、地理位置及采胶季节等多种因素的影响。蜂胶毛胶由于含有木屑蜂蜡昆虫等多种杂质，不能直接使用，需要对其有效活性物质进行提取。其中，蜂胶黄酮是蜂胶有效活性物质中的主要成分。而蜂胶的提取方式更是会极大地影响蜂胶有效活性物质功能的发挥。
4.现有技术中，蜂胶黄酮的提取方法包括采用乙醇、超临界二氧化碳、水或者有机溶剂提取等。在采用乙醇进行提取时，蜂胶黄酮的含量大概为20%左右（一级品）。虽然现有的提取方法众多，但是仍存在制备步骤复杂、蜂胶黄酮含量不高的缺陷，将其应用于家禽产气荚膜梭菌诱导的坏死性肠炎效果不好。


技术实现要素：

5.鉴于此，本发明提供了一种预防或治疗家禽产气荚膜梭菌诱导的坏死性肠炎效果优异的蜂胶黄酮提取物及其制备方法。
6.本发明的第一目的是提供一种蜂胶黄酮提取物的制备方法，具体是将蜂胶与乙醇水溶液混合，并在60~70℃下处理至蜂胶溶解，收集沉淀即得；所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分比为90~98%。
7.通过在上述简单的工艺条件下处理蜂胶，制得的蜂胶黄酮提取物中蜂胶黄酮的含量较高，将其应用于家禽产气荚膜梭菌诱导的坏死性肠炎，能够显著改善家禽的肠道健康。
8.作为本发明的一种优选的实施方案，所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分比为93~97%。
9.在上述浓度的乙醇水溶液中处理蜂胶，能够进一步提升蜂胶黄酮提取物中蜂胶黄酮的含量。
10.作为本发明的一种优选的实施方案，在62~68℃下处理至蜂胶溶解。
11.在上述温度下处理蜂胶，能够进一步提升蜂胶黄酮提取物中蜂胶黄酮的含量。
12.作为本发明的一种优选的实施方案，蜂胶与乙醇水溶液的质量体积比为1g：15~25ml。
13.在上述比例用量下，有利于增加蜂胶黄酮的提取得率，且能够节约有机试剂的使用量。
14.作为本发明的一种优选的实施方案，所述蜂胶为蜂胶细粉。
15.作为本发明的一种优选的实施方案，所述蜂胶经10~40目筛网筛选。
16.采用粉碎后的蜂胶细粉，有利于提升蜂胶黄酮提取物中蜂胶黄酮的含量。
17.在具体实施过程中，粉碎前可以采用冷冻等方式对蜂胶进行处理。
18.本领域技术人员可以进一步通过对上述优选方案进行组合，以得到本发明中蜂胶黄酮提取物的制备方法的其它较优实施例。
19.本发明的第二目的是提供一种蜂胶黄酮提取物，其由上述的任一实施方案制备得到。
20.本发明的制备方法所制得的蜂胶黄酮提取物中，蜂胶黄酮的含量较高，相比于蜂胶黄酮一级品（含有20%蜂胶黄酮），能够显著提升一倍以上。
21.进一步地，本发明还提供了上述制得的蜂胶黄酮提取物在抑制产气荚膜梭菌生长中的应用。
22.具体地，可以将上述蜂胶黄酮提取物应用于微生物培养领域，例如将其作为一种添加剂应用于微生物选择培养基中，以实现抑制产气荚膜梭菌生长的目的。本领域技术人员应当理解，也可以将其与其它添加剂复合使用，以实现选择培养微生物的目的。
23.本发明的第三目的是提供一种药品，该药品含有上述蜂胶黄酮提取物。
24.本发明的第四目的是提供一种食品或食品添加剂，该食品或食品添加剂含有上述蜂胶黄酮提取物。
25.本发明的第五目的是提供一种饲料或饲料添加剂，该饲料或饲料添加剂含有上述蜂胶黄酮提取物。
26.本发明的第六目的是提供上述蜂胶黄酮提取物在制备药品、食品、食品添加剂、饲料或饲料添加剂中的应用，所述药品、食品、食品添加剂、饲料或饲料添加剂被用于以下至少一方面：（1）改善肠道健康；（2）预防或治疗由产气荚膜梭菌感染导致的肠道疾病。
27.作为优选，所述药品、食品、食品添加剂、饲料或饲料添加剂被用于预防或治疗由产气荚膜梭菌感染导致的家禽肠道疾病。
28.其中，本发明发现，将其作为饲料添加剂，应用于家禽产气荚膜梭菌诱导的坏死性肠炎的治疗时，具有优异的作用效果。
29.本发明的有益效果在于：提供了一种步骤简单且蜂胶黄酮含量较高的蜂胶黄酮提取物的制备方法，将蜂胶黄酮提取物应用于家禽产气荚膜梭菌诱导的坏死性肠炎，能够显
著改善家禽的肠道健康。本发明的制备方法简单经济，有利于在工业生产中应用推广。
附图说明
30.图1是蜂胶黄酮提取物的抑菌效果图。
31.图2是蜂胶黄酮提取物对产气荚膜梭菌碱性磷酸酶释放量影响的统计图。
32.图3是试验例3的病理评分统计图。
具体实施方式
33.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
34.实施例中未注明具体技术或条件者，均为常规方法或者按照本领域的文献所描述的技术或条件进行，或者按照产品说明书进行。所用试剂和仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
35.实施例1本实施例提供了一种蜂胶黄酮提取物的制备方法。具体步骤如下：将粉碎的蜂胶与乙醇水溶液混合，乙醇水溶液中乙醇的体积百分比为95%，蜂胶与乙醇水溶液的质量体积比为1g：20ml，并加热到65℃，待全部溶解后，将上清去除，收集底部沉淀，烘干即得。
36.实施例2本实施例提供了一种蜂胶黄酮提取物的制备方法。具体步骤如下：将粉碎的蜂胶与乙醇水溶液混合，乙醇水溶液中乙醇的体积百分比为98%，蜂胶与乙醇水溶液的质量体积比为1g：20ml，并加热到65℃，待全部溶解后，将上清去除，收集底部沉淀，烘干即得。
37.实施例3本实施例提供了一种蜂胶黄酮提取物的制备方法。具体步骤如下：将粉碎的蜂胶与乙醇水溶液混合，乙醇水溶液中乙醇的体积百分比为95%，蜂胶与乙醇水溶液的质量体积比为1g：20ml，并加热到70℃，待全部溶解后，将上清去除，收集底部沉淀，烘干即得。
38.对比例1本对比例提供了一种蜂胶黄酮提取物的制备方法。具体步骤如下：将粉碎的蜂胶与乙醇水溶液混合，乙醇水溶液中乙醇的体积百分比为95%，蜂胶与乙醇水溶液的质量体积比为1g：5ml，在常温下浸渍24h，提出浸液，在重复加入2次，合并浸液冷却至5℃以下过滤，减压回收溶剂，收集浓缩物即得呈深棕色至黑色蜂胶黄酮提取物ecp。
39.对比例2本对比例提供了一种蜂胶黄酮提取物的制备方法。具体步骤如下：将粉碎的蜂胶与水混合，蜂胶与水的质量体积比为1g：20ml，于室温条件下搅拌48h，过滤；滤渣加水反复提取、过滤；合并滤液，在15000r/min条件下离心15min；合并上清液，经冻干处理后制得水溶性蜂胶黄酮提取物wcp。
40.对比例3
本对比例提供了一种蜂胶黄酮提取物的制备方法。具体步骤仅与实施例1不同的是：乙醇水溶液中乙醇的体积百分比为40%。
41.试验例1本试验例对实施例和对比例中所制备的蜂胶黄酮提取物中蜂胶黄酮的含量以及抗氧化活性进行测试，结果如表1所示。
42.表1 蜂胶黄酮含量及抗氧化活性结果表明，采用本发明的制备方法所制备的蜂胶黄酮提取物中蜂胶黄酮含量显著提高，而且其体外自由基清除活力显著增强。
43.试验例2本试验例对实施例和对比例中所制备的蜂胶黄酮提取物的抑菌效果进行测试，测试采用的菌种为产气荚膜梭菌，结果如图1所示。此外，对蜂胶黄酮提取物对产气荚膜梭菌碱性磷酸酶的释放量也进行测试。结果如图2所示。
44.结果表明，采用本发明的制备方法所制备的蜂胶黄酮提取物，其对产气荚膜梭菌的抑制效果显著优于其它制备方法制得的蜂胶黄酮提取物。实施例1的蜂胶黄酮提取物能够显著促进产气荚膜梭菌碱性磷酸酶的释放。
45.试验例3本试验例通过动物实验设计，验证实施例和对比例中所制备的蜂胶黄酮提取物，其作为饲料添加剂在治疗家禽产气荚膜梭菌诱导的坏死性肠炎中的作用效果。具体实验步骤如下：选用300只1日龄中速型黄羽雄性肉鸡，随机分成5组，每个组6个重复，每个重复10只。5个处理组分别是对照组、产气荚膜梭菌组（简称感染组）、实施例1组、对比例1组、对比例2组。全程对所有处理组正常饲喂饲料，此外，从第14-28天，对照组的肉鸡灌喂1ml不含产气荚膜梭菌的肉汤培养基；产气荚膜梭菌组的肉鸡连续经口接种培养时间为16h的a型产气荚膜梭菌新鲜菌液（1
×
108cfu/ml）；其它组的肉鸡连续经口接种培养时间为16h的a型产气荚膜梭菌新鲜菌液（1
×
108cfu/ml）和每kg饲料中添加500mg蜂胶黄酮提取物。
46.试验周期35天，屠宰解剖观察回肠病变情况，取回肠进行组织病理切片，计算组织
病理评分情况，结果如图3所示。结果表明，采用本发明的制备方法所制备的蜂胶黄酮提取物，能够显著改善产气荚膜梭菌感染的肉鸡肠道健康。
47.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。